Trx2: TRX2 Капсулы для роста волос. Что это такое?

Вся литература, подобранная вручную по указанному гену, сгруппирована по темам в соответствии с их отношение к гену (основная литература, дополнительная литература или обзор).Нажмите «Сведения о литературе». для просмотра всей литературной информации по этому локусу, включая общую литературу по генам.

Первичный

85

Дополнительный

158

Обзоры

37

Ресурсы

TRX2 (2021 г.) — стоит ли покупать?

Введение

Добавки для ухода за волосами становятся все более и более популярными как среди мужчин, так и среди женщин, сегодня индустрия роста волос гораздо более разнообразна и (надеюсь) намного более эффективна, чем когда-либо прежде.Есть шампуни, кремы, кондиционеры и диетические добавки.

В этом обзоре TRX2 мы сосредоточимся на утверждениях о том, что этот продукт может улучшить рост волос как у мужчин, так и у женщин.

Что такое TRX2?

TRX2 — это добавка для роста волос, созданная совместной компанией из Великобритании и Германии под названием Oxford BioLabs . Основатель — шотландский / немецкий биохимик по имени Томас Уитфилд, получивший докторскую степень в Крайст-Черч, Оксфордский университет (отсюда и название).

Уитфилд основал Oxford BioLabs в 2009 году, и к 2011 году был продан первый продукт компании TRX2. TRX2 означает Trichos , что по-гречески означает волосы, а цифра 2 означает «ваше второе поколение волос» [1]. Другими словами, если вам интересно, что случилось с TRX1… его никогда не существовало!

TRX2 продается через его веб-сайт и Amazon, вы можете приобрести его в пакетах на один или три месяца. Трехмесячная упаковка содержит 90 порций по три капсулы, то есть всего 270 капсул.На сайте Oxford Biolabs он стоит 184,95 доллара. Это составляет 61,65 доллара в месяц, или около 2 долларов в день.

TRX2, по всей видимости, продается в основном мужчинам. Большинство их тематических исследований — фотографии мужчин, но они подходят как мужчинам, так и женщинам, и Oxford BioLabs явно приложили усилия, чтобы сделать их привлекательными и для женщин. Тем не менее, на первый взгляд, TRX2 больше похож на средство для ухода за мужскими волосами, чем на женское.

Цель приема TRX2 — отрастить волосы и обратить вспять их выпадение.В отличие от большинства продуктов для роста волос TRX2 не пытается блокировать DHT. Вместо этого TRX2 утверждает, что стимулирует ионные каналы калия в молекулах волос, что, как утверждает Oxford BioLabs, приводит к возобновлению роста волос.

Oxford BioLabs утверждает, что 87% людей, которые принимали их продукт, сообщили о «заметно более сильных и густых волосах». Большинство людей видят разницу после девяти месяцев приема TRX2.

Работает ли TRX2?

В отличие от многих добавок и, в частности, средств по уходу за волосами, TRX2 не использует отдельные ингредиенты для создания определенных преимуществ.Вместо этого они используют комбинацию ингредиентов: L-карнитин, никотиновая кислота, калий «с запатентованным комплексом метаболических стимуляторов» для реактивации калиевых каналов, «способствующих росту волос на молекулярном уровне» [2].

Это означает, что при просмотре списка ингредиентов у нас есть только одна работа. Выясните, 1) действительно ли выпадение волос вызвано истощением калиевых каналов и 2) могут ли ингредиенты TRX2 реактивировать эти каналы, приводя к возобновлению роста волос.

Исследование 1992 года, опубликованное в Journal of Investigative Dermatology, подтверждает, что калиевые камеры действительно влияют на рост волос [3]. В то время как исследование 2005 года показывает нам, что открытие калиевых каналов действительно может привести к усиленному росту волос [4].

Oxford BioLabs также провели собственное исследование с участием 59 участников (47 мужчин, 12 женщин) в течение 18 месяцев [5]. Исследование разделило участников на две группы. Одна группа принимала TRX2, а другая (известная как контрольная группа) принимала плацебо.Через 9 месяцев среднее количество волос увеличилось на 35% в группе TRX2, а толщина волос увеличилась на 22%. Через 18 месяцев количество волос увеличилось на 49%, а толщина волос увеличилась на 38%.

Эти результаты очень впечатляют, и если бы это было независимое исследование, мне бы больше нечего было сказать. Однако важно упомянуть о предвзятости, присущей компании, проводящей собственные клинические испытания. Подумайте об этом, ведь исследователи не совсем беспристрастны!

Это не означает, что результаты не важны, и мы не подразумеваем, что произошло что-то непредвиденное.Но в науке предвзятость (даже бессознательная) может серьезно повлиять на результаты или их интерпретацию.

При этом есть четкие доказательства того, что на выпадение волос могут влиять калиевые камеры, и есть доказательства того, что решение этой проблемы может привести к обращению выпадения волос. Исследование Oxford BioLabs демонстрирует, что TRX2 работает, и, похоже, существует множество неподтвержденных свидетельств, подтверждающих это.

Итог: Появляется достаточно доказательств того, что TRX2 работает и имеет довольно высокий уровень успеха.Да, исследование в принципе недопустимо, так как оно исходит из необъективного источника. Но это указывает на то, что TRX2 имеет высокую вероятность работы.

Плюсы и минусы TRX2

В этом разделе мы исследуем все, что нам нравится, и все, что нам не нравится в TRX2.

Профи

• Выделяется из общей массы тем, что решает проблему, с которой не справляется никакая другая добавка для ухода за волосами.
• Наука, лежащая в основе нацеливания на калиевые камеры, надежна
• Исследование Oxford BioLabs показало увеличение количества волос (49%) и толщину волос (38%) через 18 месяцев
• Содержит ниацин, который, как известно, увеличивает приток крови к коже головы
• Также содержит l-карнитин, который, как было показано, увеличивает рост волос [6].
• Не нацеливаясь на DHT, TRX2 позволяет избежать множества нежелательных побочных эффектов (снижение мужественности, снижение тестостерона и т. Д.).
• Почти нет побочных эффектов, связанных с использованием TRX2 (одно исключение упомянуто в «минусах»)

Минусы

• Хотя есть доказательства, подтверждающие этот метод, о
еще мало кто слышал.
• Наиболее убедительное исследование TRX2 не является независимым и имеет проблемы с предвзятостью
• Требуется долгосрочное использование, которое при 2 долл. США в день может оказаться очень дорогим
• Желудочно-кишечные расстройства как побочный эффект TRX2 были отмечены небольшим процентом пользователей

Что такое ингредиенты TRX2?

Мы обнаружили следующие факты о добавках для этого продукта:

Одна порция содержит: L-карнитин 800 мг, хлорид калия 191 мг, L-лейцин 150 мг, L-изолейцин 75 мг, L-валин 75 мг, ниацин 40 мг, цинк 15 мг, биотин 150 мкг и селен 75 мкг.

Безопасен ли TRX2?

В TRX2 нет ничего, что можно было бы классифицировать как небезопасное, запрещенных или контролируемых веществ, и ни один из ингредиентов не присутствует в слишком высоких концентрациях. При условии хорошего здоровья потребителя проблем с приемом TRX2 быть не должно.

Подходит ли TRX2 для всех?

TRX2 подходит как для мужчин, так и для женщин и содержит совершенно безопасные ингредиенты, которые содержатся в допустимых дозах.Однако ни одна добавка не является на 100% безопасной, и могут возникнуть побочные эффекты. L-карнитин не подходит для людей с болезнью Альцгеймера, а также для людей с уже существующими заболеваниями почек. Беременным женщинам также рекомендуется избегать этого.

Аминокислоты с разветвленной цепью (лейцин, изолейцин и валин) не следует принимать диабетикам или людям, принимающим лекарства от болезни Паркинсона. Калий в основном безопасен, но при приеме в высоких дозах может вызвать осложнения с почками. Если у вас уже есть проблемы с почками, возможно, вам стоит избегать приема TRX2.

Как и калий (и любой из ингредиентов в этом списке, если на то пошло), ниацин совершенно безопасен. Однако, если в вашем рационе уже много ниацина и вы принимаете TRX2, вы рискуете принять слишком много ниацина. Что может иметь проблемы с рядом органов. Однако это невероятно маловероятно.

Таким образом, беременным женщинам, диабетикам, людям с заболеванием почек, болезнью Паркинсона или Альцгеймера следует избегать TRX2. По большей части все остальные должны быть в полном порядке. Если у вас есть какое-либо из вышеперечисленных условий, проконсультируйтесь с врачом — он, вероятно, скажет, что это абсолютно нормально, но всегда лучше проверить.

Каковы побочные эффекты TRX2?

Мы составили следующий список потенциальных побочных эффектов на основе ингредиентов, используемых в формуле:

• Тошнота
• Диарея
• Дискомфорт в животе
• Рвота
• Бессонница [7]

Примечание: эти побочные эффекты возможны, но могут быть не типичными для пользователя.

Есть ли отзывы покупателей о TRX2?

Как и в случае с большинством добавок для волос, отзывы делятся на тех, кто добился фантастических результатов, и тех, кто не видел разницы.К сожалению, здесь TRX2 может стать жертвой нетерпения. Поскольку результаты будут достигнуты через 18 месяцев, вероятно, будет большое количество неудовлетворенных клиентов, которые не смогут ждать так долго. За 2 доллара в день их тоже нельзя винить.

Один клиент написал в письме после приема TRX2 в течение 10 месяцев, и у него «не было результатов». С другой стороны, другой клиент принимал TRX2 всего 2 месяца и увидел результаты уже через месяц.

«Я определенно заметил улучшение густоты и общего состояния моих волос»

и..

«TRX2 слишком дорогой»

Вышеупомянутое, вероятно, справедливое замечание, хотя оно не является дорогостоящим в расчете на одну порцию, учитывая, сколько времени вы должны принимать, поскольку стоимость резко возрастает.

Наш окончательный вердикт по TRX2

TRX2 — это захватывающая добавка для ухода за волосами, которая поддерживается хорошей маркетинговой кампанией. Однако убедительных доказательств того, что это работает, не так уж и много. Наиболее подходящее исследование было проведено Oxford BioLabs (создателем TRX2), но его недостаточно.Анализируя отзывы, кажется, что около половины клиентов довольны (49% дали TRX2 оценку в четыре или пять звезд), в то время как другая половина не увидела почти никаких результатов.

Это действительно неплохо для добавки для волос. Многие видят лишь около 30-40% успеха, но обзоры Amazon не отражают заявления Oxford BioLabs о том, что 87% пользователей остались довольны результатами. Будет интересно посмотреть, будут ли другие компании стремиться улучшить волосы за счет восстановления калиевых камер.Если это произойдет, то, возможно, TRX2 что-то замышляет.

TRX2® Молекулярная пищевая добавка для волос

КАК ЭТО РАБОТАЕТ

Калиевые каналы — это белковые структуры, обнаруженные во многих клетках человеческого тела. В волосяных фолликулах они помогают жизненно важным питательным веществам проходить через клеточную мембрану.

Три капсулы пищевой добавки для волос TRX2® в день обеспечивают комплекс питательных веществ, стимулирующий калиевые каналы. Этот запатентованный комплекс включает такие компоненты, как аминокислоты с разветвленной цепью, никотинамид и калий, а также чистейшую форму L-карнитина, Carnipure ™.Вместе с витаминами и минералами этот комплекс способствует поддержанию здоровья

нормальных волос.

Указания: принимать по 3 капсулы в день во время еды. Вы можете принимать по 3 капсулы вместе или в кратчайшие сроки, или по указанию врача.

Состав: L-карнитин, гидроксипропилметилцеллюлоза (оболочка растительной капсулы), регулятор кислотности: винная кислота, хлорид калия (включает 0,5% диоксида кремния), L-лейцин, цитрат цинка, никотинамид, стабилизатор: соли магния жирных кислот. кислоты, селенит натрия, D-биотин.

* — NRV означает контрольную ценность питательных веществ

Меры предосторожности: не превышайте указанную рекомендуемую суточную дозу.Этот продукт не следует использовать в качестве замены разнообразного и сбалансированного питания и здорового образа жизни. Если вы кормите грудью, беременны или планируете беременность, вам следует проконсультироваться с врачом перед использованием этого продукта. Хранить в сухом прохладном месте, защищенном от прямых солнечных лучей. Хранить в недоступном для детей месте.

Капсула / вес НЕТТО: 558 мг / 50 г (90 капсул).

Производитель: Oxford Biolabs Ltd., Robert Robinson Avenue, Oxford Science Park, Oxford OX4 4GA, Великобритания.

Дистрибьютор: UAB «Bioklinika», Studentų g. 37, LT-51364 Каунас, Литва, тел. +370 68 640115

границ | Уникальный SUMO-взаимодействующий мотив Trx2 имеет решающее значение для его митохондриальной предварительной обработки и антиоксидантной активности

Особенности

— Стимулы старения вызывают старение эндотелиальных клеток одновременно с ослаблением митохондриального процессинга Trx2, что приводит к накоплению предшественника Trx2 (PreTrx2).

— Процессинг Trx2 опосредуется сайтами распознавания MPP и MIP в митохондриальной целевой последовательности Trx2.

— Уникальный SUMO-взаимодействующий мотив Trx2 имеет решающее значение для его митохондриального процессинга и последующей антиоксидантной / антистарственной активности.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются и останутся ведущей причиной глобальной смертности и инвалидности (Benjamin et al., 2017; Xue et al., 2017). Смертность от сердечно-сосудистых заболеваний увеличивается с возрастом, а процесс старения представляет собой самый большой фактор риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (Finegold et al., 2013). Хроническое воздействие факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний усиливает окислительный стресс, который ускоряет развитие старения эндотелия сосудов, что может способствовать патогенезу сердечно-сосудистых заболеваний (Voghel et al., 2007).

Старение эндотелиальных клеток сосудов все чаще связывают как со старением, так и с возрастными заболеваниями, включая сердечную недостаточность, диабет и атеросклероз (Minamino and Komuro, 2007; Voghel et al., 2007; Tian and Li, 2014; Katsuumi et al. , 2018). Стресс-индуцированное преждевременное старение (SIPS) индуцируется окислительным стрессом, активностью онкогенов или неоптимальными условиями культивирования, которые происходят независимо от изменения длины теломер (Coleman et al., 2010). Старые клетки выходят из клеточного цикла, но остаются жизнеспособными, демонстрируют уплощенную и увеличенную морфологию и демонстрируют накопление связанной со старением активности β-галактозидазы (SA-β-Gal) (Dimri et al., 1995). Старение происходит через путь p53, который трансактивирует ингибитор циклин-зависимой киназы p21 ^{WAF / CIP1} или через путь p16 ^INK4a (p16) (Coleman et al., 2010). Кроме того, фосфорилирование маркера повреждения ДНК γh3A.X также можно использовать для идентификации стареющих клеток (Munoz-Espin and Serrano, 2014).

Многие сосудистые заболевания, связанные со старением, связаны с генерацией активных форм кислорода (АФК) (Erusalimsky, 2009). Различные типы стрессов, включая химиотерапевтические препараты, потеря теломерных защитных функций, повреждение ДНК и активация онкогенов, приводят к увеличению ROS (Munoz-Espin and Serrano, 2014).Механически высокие внутриклеточные ROS индуцируют активацию p16 или p53 / p21 через MPAKK3 и MAPKK6 и их последующего эффектора киназы p38, в конечном итоге активируя ингибиторы клеточного цикла и опухолевый супрессор RB (Munoz-Espin and Serrano, 2014). Из функциональных АФК пероксид водорода (H ₂ O ₂ ) часто используется для создания окислительной среды, которая быстро приводит к преждевременному старению (Oeseburg et al., 2010; Huo et al., 2018).

Тиоредоксин 2 (Trx2) является ключевым митохондриальным окислительно-восстановительным белком, который уравновешивает уровни ROS и поддерживает функцию митохондрий в различных клетках (Hirasaka et al., 2011; Ли и др., 2014, 2017; Хуанг и др., 2015; Холзерова и др., 2016; Chen et al., 2017). Митохондриальная Trx-система состоит из тиоредоксинредуктазы 2 (TrxR2), Trx2 и пероксиредоксина 3 (Prx3) (Spyrou et al., 1997; Nonn et al., 2003). Эта система, использующая НАДФН, поддерживает нормальную функцию белка, а также предоставляет электроны PRX3 для поглощения H ₂ O ₂ в митохондриях. Trx2 является критическим регулятором окислительно-восстановительного баланса, который защищает клетки от апоптоза, вызванного окислительным стрессом (Tanaka et al., 2002; Ли и др., 2014). На сегодняшний день роль Trx2 в старении эндотелиальных клеток сосудов не исследована.

Многие митохондриальные белки-предшественники содержат N-концевую пре-последовательность, то есть сигнальный пептид нацеливания на митохондрии (MTS). MTS часто протеолитически обрабатывается митохондриальной процессинговой пептидазой (MPP). Впоследствии может происходить дополнительное расщепление для удаления вновь экспонированных N-концевых сортирующих пептидов митохондриальной промежуточной пептидазой (MIP) или пептидазой внутренней мембраны (IMP) с образованием зрелых белков (Gakh et al., 2002; Карапито и др., 2017). Некоторые митохондриальные белки содержат сигнал сортировки вне MTS (Monaghan and Whitmarsh, 2015). Trx2 также содержит консервативные мотивы, которые могут распознаваться и расщепляться с помощью MPP, MIP и IMP (Hirasaka et al., 2011). Остается выяснить, играют ли эти мотивы важную роль в процессинге Trx2.

Анализ последовательности показывает, что Trx2 содержит уникальный SUMO-взаимодействующий мотив (SIM), характеризуемый как короткий участок гидрофобных аминокислот, консенсус Val / Ile-X-Val / Ile-Val / Ile (V / IXV / IV / I) , фланкированный кислотными остатками (Gareau, Lima, 2010).SIMs опосредуют нековалентное связывание SIM-содержащих белков и белков с помощью SUMOylation (Kerscher, 2007), обратимой посттрансляционной модификации. Подобно убиквитинированию, SUMOylation нацелено на определенный лизин (K) через семейство малых белков-модификаторов убиквитина (SUMO). SUMOylation — это динамический процесс, который опосредуется гетеродимерным SUMO-активирующим ферментом E1, сигнализирующими ферментами E2 и лигирующими ферментами E3 и легко реверсируется семейством SUMO-специфических протеаз из шести членов (SENP) (Yeh, 2009).SUMOylation считается важным процессом, который модулирует различные критические клеточные процессы, включая репликацию ДНК, транскрипцию, восстановление повреждений ДНК, ядерный перенос, регуляцию клеточного цикла, сплайсинг пре-мРНК, трансдукцию сигнала, белок-белок и взаимодействие белок-ДНК ( Пихлер и др., 2017). Многочисленные доказательства показали, что SUMOylation и SIMs регулируют клеточное старение (Sahin et al., 2014a, b). В сосудистой сети SUMOylation в значительной степени участвует в окислительном стрессе и функции EC (Qiu et al., 2017; Чжу и др., 2017; Чжоу и др., 2018). Однако роль SUMOylation в старении EC не исследовалась.

В настоящем исследовании мы неожиданно обнаружили, что уникальные взаимодействующие с SUMO мотивы Trx2 являются критическими для процессинга митохондрий Trx2 и его последующей антиоксидантной / антистенесцентной активности.

Материалы и методы

Химические вещества и антитела

Гинкголевая кислота [(GA, 15: 1) — CAS 22910-60-7, 345887] была приобретена у Millipore.N-этилмалеимид (NEM, ингибитор SENP, E1271), стрептонигрин (SN, ингибитор SENP, S1014) были куплены у Sigma. Белок A / G PLUS-Agarose (sc-2003) был получен из Санта-Крус.

Антитела для иммуноблоттинга, иммунопреципитации и иммуноокрашивания были: V5 (Cell Signaling Technology, 13202, Rabbit, WB 1: 1000), Trx2 (Abcam, ab185544, Rabbit, WB, 1: 10000), Trx2 (Santa Cruz, sc-133201 , Mouse, IF, 1:50), Phospho-p53 (Cell Signaling Technology, 9284, Rabbit, WB 1: 500), P21 (Cell Signaling Technology, 2947, Rabbit, WB 1: 1000), Phospho-Histone h3A.X (Cell Signaling Technology, 9718, Rabbit, WB 1: 200), β-Actin (Cell Signaling Technology, 4970, Rabbit, WB 1: 1000), α / β-Tubulin (Cell Signaling Technology, 2148, Rabbit, WB 1). : 1000), TFAM (Cell Signaling Technology, 8076, Rabbit, IF 1: 100), PMPCA (Santa Cruz, sc-3

Культура клеток, трансфекция, трансфекция миРНК и экспрессия гена лентивируса

HEK293T и HeLa культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были приобретены из ядра культуры тканей Йельской программы сосудистой биологии и терапии (VBT) и сохранены в EBM-2 (Lonza) с добавлением 2% FBS, 2 мМ L-глутамина, пенициллина / стрептомицин и факторы роста EGM-2. Все клетки поддерживали при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ атмосферы.

Липофектамин 3000 использовали для трансфекции клеток 293Т или Hela в соответствии с протоколом производителя (Life Technologies). Клетки культивировали в 12-луночных планшетах до тех пор, пока они не достигли 60-80% конфлюэнтности, после чего их трансфицировали всего 1 мкг плазмид. Клетки обрабатывали и собирали для анализа белков или иммунофлуоресценции через 48 часов после трансфекции.

Lipofectamine RNAiMAX использовали для выполнения нокдауна siRNA в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies).HUVEC засевали в 12-луночные планшеты за 24 ч до трансфекции и позволяли расти при 60-80% конфлюэнтности. Клетки трансфицировали 15 пмоль миРНК Trx2 (Santa cruz, sc-44173) или 3′-UTR миРНК Trx2 (Integrated DNA Technologies, hs.Ri.TXN2.13.1, hs.Ri.TXN2.13.4 и hs.Ri.TXN2. .13.5). Трансфицированные клетки выращивали в течение 6 часов перед добавлением полной культуральной среды EGM-2 еще на 48 часов перед сбором.

Было создано несколько лентивирусов (pLVX-Trx2-WT, pLVX-Trx2-SIM) для сверхэкспрессии Trx2 и Trx2-SIM в HUVEC, тогда как pLVX использовали в качестве отрицательного контроля.Лентивирусные векторы, экспрессирующие Trx2 и Trx2-SIM с V5-меткой, были созданы путем вставки соответствующих кДНК в сайты мультиклонирования лентивирусного каркасного вектора pLVX-IRES-Neo. Конструкции котрансфицировали упаковывающей плазмидой (pCMV-R8.2) и плазмидой оболочки (VSV-G) в клетки 293T для упаковки лентивируса и амплификации. HUVEC инфицировали в течение 12 ч различными лентивирусами с полибреном (8 мкг / мл). После инфекций добавляли полную культуральную среду EGM-2 на дополнительные 48 часов перед проведением анализа.

Экстракция белка, Вестерн-блоттинг-анализ

Клетки промывали PBS и лизировали буфером RIPA с ингибиторами протеаз (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma-Aldrich). Белковые экстракты растворяли в полиакриламидных гелях и анализировали иммуноблоттингом на указанные белки.

Окрашивание связанной со старением β-галактозидазы (SA-β-Gal)

Уровни старения в культивируемых HUVEC оценивали путем количественного определения активности SA-β-gal с использованием набора для окрашивания старения β-галактозидазой (Cell Signaling Technology, # 9860) в соответствии с инструкциями производителя.HUVEC, инфицированные несколькими различными лентивирусами (pLVX, pLVX-Trx2-WT, pLVX-Trx2-SIM), соответственно, обрабатывали H ₂ O ₂ (150 мкМ, 6 ч) перед окрашиванием или без него. Клетки промывали один раз в PBS, фиксировали в течение 15 мин буфером для фиксирующего раствора при комнатной температуре и дважды промывали PBS. Затем клетки инкубировали в течение ночи со свежеприготовленным окрашивающим раствором SA-β-gal при 37 ° C в сухом инкубаторе без CO ₂ . Клетки подсчитывали в пяти произвольно выбранных полях и количественно определяли процент клеток, положительных по SA-β-Gal, чтобы представить активность SA-β-gal в трех независимых экспериментах.

Сайт-направленный мутагенез

Сайт-направленный мутагенез на основе ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы KOD-Plus-Neo (TOYOBO CO., LTD., KOD-401), а затем продукты расщепляли Dpn I (NEB, R0176S). Компетентные клетки DH5α трансформировали полученными плазмидами. Плазмиды были амплифицированы, и мутации были подтверждены секвенированием.

Измерение митохондриальных ROS

ROS в митохондриях измеряли с помощью индикатора митохондриального супероксида MitoSOX ^TM Red (Invitrogen, M36008) в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, клетки Hela высевали в 6-луночный планшет со стеклянным дном (MatTek Corporation), обрабатывали 150 мкМ H ₂ O ₂ в течение 8 часов, а затем окрашивали 20 нМ Mito Tracker Green FM (Invitrogen, M7514) и 10 мкг / мл Hoechst и 5 мкМ MitoSOX в течение 10 мин в полной среде. После удаления реагентов и трехкратной промывки теплым PBS флуоресценцию регистрировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Zeiss Microscope Axiovert 200M).

Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание

Клетки трансфицировали плазмидами, как указано в индивидуальных экспериментах.Клетки промывали 2 раза PBS, фиксировали в 4% PFA в течение 15–20 мин. Раствор для фиксации удаляли, и клетки промывали 3 раза PBS. Клетки пермеабилизировали в 0,1% TritonX-100 в PBS в течение 1 мин, а затем промывали 3 раза PBS и блокировали 1% BSA. Клетки инкубировали с первичными антителами (Trx2 и TFAM) в течение ночи при 4 ° C, затем трижды промывали PBS и инкубировали со вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубации вторичных антител клетки трижды тщательно промывали PBS и помещали в среду для монтажа с DAPI.

Immunogold Электронная микроскопия

Immunogold выполняли, как описано ранее (Zhang et al., 2004). В этом эксперименте использовали антитело V5 (Cell Signaling Technology, 13202).

Анализ коиммунопреципитации

Эндотелиальных клеток пупочной вены человека использовали для тестов на коиммунопреципитацию эндогенного PMPCA SUMOylation. Вкратце, клетки промывали PBS и лизировали в буфере для лизиса SUMOylation (Qiu et al., 2017) (50 мМ Tris-HCl, pH7.5, 150 мМ NaCl, 1% TritonX-100, 1 мМ EGTA, 1 мМ EDTA, 1 × смесь ингибиторов протеазы без EDTA и 20 мМ NEM). Лизаты клеток центрифугировали (12 000 g в течение 20 мин при 4 ° C) и собирали супернатант. Затем супернатант немедленно инкубировали с 10 мкл бусинок протеин A / G-агарозы при 4 ° C в течение 1 ч для преклира. Затем супернатант инкубировали с антителом против PMPCA (Santa Cruz, sc-3

Статистика

Статистический анализ выполняли с помощью программы Prism (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Количественные данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка с указанием количества образцов для каждого эксперимента в тексте или соответствующем. Если не указано в тексте или в подписях, сравнения между двумя группами проводились с использованием непарного теста t .Статистическая значимость показана как ^∗ p <0,05; ^∗∗ p <0,01; ^∗∗∗ p <0,001; ^**** p <0,0001.

Результаты

Стимулы старения ухудшают обработку Trx2

Trx2 имеет направленную на митохондрию последовательность (MTS) на своем N-конце (Damdimopoulos et al., 2002), а прогнозируемая молекулярная масса предшественника Trx2 (PreTrx2) и зрелого Trx2 составляет 19 кДа и 12 кДа, соответственно.Чтобы выяснить, изменяется ли процессинг Trx2 при патологических условиях, мы исследовали процессинг Trx2 в ответ на различные стрессовые стимулы, связанные с сосудистыми заболеваниями. С этой целью HUVEC обрабатывали провоспалительными цитокинами (TNF, IFN-γ или комбо), активатором стресса ER (туникамицин) и стимулами старения (H ₂ O ₂ или менадионом) (Debattisti et al., 2017) . Среди этих факторов только стимулы старения, включая H ₂ O ₂ (рисунок 1A) и менадион (дополнительный рисунок 1), индуцировали накопление необработанного Trx2, которое было на 19 кДа (PreTrx2) выше зрелой формы (12 кДа). .Известные эффекты TNF (индукция TRAF1), IFN-γ (индукция IRF1) и туникамицина (дегликозилирование VEGFR2) были очевидны с помощью вестерн-блоттинга. Однако эти факторы, в отличие от H ₂ O ₂ или менадиона, не влияли на процессинг Trx2 (рис. 1A).

Рисунок 1. Стимулы старения нарушают обработку Trx2. (A) Эндотелиальные клетки пупочной вены человека HUVEC инкубировали с различными стрессовыми стимулами, как указано. Тотальные клеточные лизаты подвергали вестерн-блоттингу с антителами к маркерам специфической стрессовой реакции (VEGFR2, IRF1 и TRAF1), а также к белку Trx2.Указаны предшественник Trx2 (PreTrx2) и зрелый Trx2 (Tx2). Показаны более короткая выдержка и более длинная выдержка для Trx2. (B) Влияние H ₂ O ₂ на обработку Trx2. HUVEC инкубировали с различными дозами H ₂ O ₂ , как указано. Белок Trx2 определяли вестерн-блоттингом. (C – E) Кинетика H ₂ O ₂ при процессинге и старении Trx2. HUVEC инкубировали с H ₂ O ₂ при 150 мкМ в течение указанного времени.Белок Trx2 и маркеры старения (p16, p-p53 и p21) определяли вестерн-блоттингом со специфическими антителами (C) . Анализы ассоциированной со старением β-галактозидазы для клеток, обработанных H ₂ O ₂ (8 часов и 16 часов). Репрезентативные изображения показаны в (D) с количественными данными в (E) . Стрелки указывали на положительные клетки. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех независимых экспериментов. ^∗ P <0,05; ^∗∗ P <0.01; и ^∗∗∗ P <0,001. (F, G) Trx2 защищает клеточное старение. HUVEC трансфицировали контрольной миРНК или миРНК Trx2 с последующей обработкой H ₂ O ₂ или TNF. Белок Trx2 и маркеры старения (p16, p-p53 и p21) определяли с помощью вестерн-блоттинга (F) . Относительные уровни белка определяли количественно, принимая необработанный siCtrl как 1,0 (G) . Показанные данные являются репрезентативными для трех экспериментов. Масштабная линейка: 100 мкм (D) .Mr: молекулярный вес.

Связанная со старением β-галактозидаза вместе с ингибитором клеточного цикла p16 считаются биомаркерами клеточного старения. Активация p53 и повышающая регуляция его нижестоящей мишени p21 также были связаны с клеточным старением (Sharpless and Sherr, 2015). Далее мы исследовали влияние различных доз и временных курсов H ₂ O ₂ на обработку Trx2. H ₂ O ₂ при 150 мкМ индуцировал максимальное накопление preTrx2 через 2-6 часов (рисунки 1B, C).Интересно, что кинетика накопления PreTrx2 коррелирует с активацией маркеров старения, включая экспрессию SA-β-Gal, p16, фосфорилирование p53, которое предшествует индукции p21 (Figures 1C-E). Наблюдение за тем, что стимулы старения изменяют процессинг Trx2, предполагает, что Trx2 в норме может защищать клеточное старение. Чтобы проверить эту возможность, Trx2 был сбит siRNAs в HUVEC с последующей обработкой H ₂ O ₂ -индуцированной в течение 6–16 часов. TNF использовали в качестве контроля, не являющегося индуктором старения.Один только нокдаун Trx2 не вызывал старения в EC, но усиливал индуцированную H ₂ O ₂ активацию старения EC, о чем свидетельствует повышенная экспрессия p16 и p21 и фосфорилирование p53 (рис. 1F). Эти результаты показывают, что Trx2 защищает EC от старения, а стимулы старения нарушают процессинг Trx2 во время клеточного старения.

Отображение критических остатков для обработки Trx2

Предшественники митохондриальных белков, в зависимости от их конечного назначения в митохондриях, процессируются в последовательные этапы митохондриальной процессинговой пептидазой (MPP) и сайтом расщепления митохондриальной промежуточной пептидазой (MIP) RX ↓ (F / L / I) -XX- (T / S / G) -XXXX ↓ (Хорвич и др., 1985; Гах и др., 2002). MTS Trx2 содержит потенциальный мотив (V / I) -X-X-T-X-X-X-X ↓, который может распознаваться пептидазой внутренней мембраны (IMP) между Ile-64 и Gln-65 (Hirasaka et al., 2011; Рисунок 2A). Чтобы проверить роль этих мотивов в процессинге Trx2, мы мутировали консервативную аминокислоту трех мотивов в Trx2 MTS в экспрессирующей системе, в которой Trx2 содержал V5-метку на С-конце. При сверхэкспрессии в HUVEC, Trx2-WT (с V5-меткой) присутствовал в виде двух основных полос, зрелой формы при 14 кДа и PreTrx2 при 21 кДа.Также была обнаружена дополнительная полоса 18 кДа, которая, вероятно, возникла в результате расщепления перед сайтом MPP неизвестным механизмом (сайт отмечен как x на фиг. 2A, а полученный белок обозначен xTrx2 на фиг. 2B). Мутация только в сайте MPP (Trx2-MPP) уменьшала зрелый Trx2 с увеличением предшественников Trx2 (PreTrx2 и xTrx2). Сходным образом мутации в сайте MIP (Trx2-MIP) уменьшали зрелый Trx2 с увеличением предшественников Trx2. Интересно, что промежуточная форма выше зрелого Trx2 была обнаружена в Trx2-MIP; эта полоса, вероятно, возникла в результате расщепления на вышестоящем сайте MPP, в результате чего образуется форма с дополнительными 13 аминокислотами, более длинными, чем зрелый Trx2.Мутации как в MPP, так и в MIP-мотивах (Trx2-MPP / MIP) полностью блокируют обработку Trx2, накапливая предшественники Trx2 (PreTrx2 и xTrx2). Напротив, мутация в сайте IMP (Trx2-IMP) не увеличивала предшественников Trx2 (Рисунок 2B). Эти результаты предполагают, что сайты расщепления как MPP, так и MIP, но не сайт IMP, являются критическими для процессинга Trx2 в митохондриях.

Рисунок 2. Идентификация критических мотивов для обработки Trx2. (A) Анализ последовательности митохондриальной нацеливающей последовательности (MTS) на белке Trx2.Показаны предполагаемый консервативный мотив (подчеркнутый) и сайты расщепления (вертикальные стрелки) митохондриальных процессинговых пептидаз (MPP), митохондриальной промежуточной пептидазы (MIP) и пептидазы внутренней мембраны (IMP). Консервативные аминокислотные остатки для каждого мотива обозначены разными цветами. (B) Сайты MPP / MIP критичны для обработки Trx2. Пустой вектор pcDNA3.1, Trx2-WT и различные мутанты трансфицировали в клетки. Лизаты клеток подвергали вестерн-блоттингу с анти-V5.Показаны Pre-Trx2, зрелый Trx2, а также промежуточные продукты процессинга. xTrx2: полоса 18 кДа является результатом расщепления внутри MTS перед сайтом MPP неизвестным ферментом. (C) Анализ последовательности зрелого белка Trx2. Указаны мотив взаимодействия SUMO (SIM) (VVVDF или PVVV), каталитический активный сайт (C ⁹⁰ GPC ⁹³ ) и соответствующие мутации. (D, E) SIM, но не каталитический центр, имеет решающее значение для обработки Trx2. Пустой вектор pcDNA3.1, Trx2-WT и различные мутанты трансфицировали в клетки, и полученные клеточные лизаты подвергали вестерн-блоттингу.Указаны различные формы белка Trx2. Показанные данные являются репрезентативными для трех экспериментов.

Некоторые митохондриальные белки содержат сигнал сортировки вне MTS (Monaghan and Whitmarsh, 2015). Это побудило нас изучить, участвуют ли другие последовательности в обработке Trx2. Trx2 содержит активный каталитический центр. Trx2 содержит активный окислительно-восстановительный центр (C ⁹⁰ GPC ⁹³ ). Восстановленная активная форма Trx2 в митохондриях претерпевает обратимое окисление до дисульфида Cys (Trx-S2) после восстановления белкового субстрата и затем регенерируется Trx-редуктазой-2 (TrxR2) за счет NAPDH (Holmgren, 2000).Более того, теперь признано, что остатки Cys могут подвергаться различным модификациям, включая сульфенилирование и образование дисульфидов, образование более высоких степеней окисления, S-нитрозилирование и другие модификации (Go et al., 2015). Эти модификации могут потенциально повлиять на сворачивание и обработку Trx2. Помимо редокс-активного сайта, Trx2 содержит мотив взаимодействия SUMO (SIM) (SIM1: 81-85 VVVDF) или (SIM2: 80-83 PVVV) на основе прогнозов SIM с использованием GSP-SUMO (Zhao et al., 2014) и ДЖАССА (Боклер и др., 2015; Рисунок 2C). Чтобы определить, участвуют ли эти мотивы в процессинге Trx2, мы мутировали эти сайты для создания мутантов Trx2-C90S, C93S, C90 / 93S и Trx2-SIM. Мутации в каталитическом сайте C90 / C93 не влияли на процессинг Trx2 (рис. 2D). К нашему удивлению, Trx2-SIM существовала только как предшественник Trx2. По сравнению с WT и Trx2-ΔMT, в котором отсутствует MTS и который экспрессируется в виде зрелой формы, в Trx2-SIM полностью отсутствует зрелый белок (рис. 2E). Эти результаты указывают на то, что мотив SIM является критическим для процессинга Trx2.

Мутация SUMO Interaction Motif (SIM) не влияет на локализацию Trx2

Поскольку процессинг белков-предшественников митохондрий связан с их локализацией, мы сначала исследовали, влияет ли SIM на локализацию Trx2. Чтобы исключить влияние эндогенного Trx2, мы сначала подавили эндогенный Trx2, используя миРНК Trx2 3′-UTR в EC, с последующей повторной экспрессией Trx2 или Trx2-SIM дикого типа. Trx2-ΔMT, лишенный MTS, использовали в качестве контроля цитозольного белка. Вестерн-блоттинг показал, что эти мутанты были эффективно преобразованы в ЭК (рис. 3А).Локализацию Trx2 определяли с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. В соответствии с результатами вестерн-блоттинга эндогенный Trx2 был полностью удален с помощью миРНК Trx2 3’UTR. Как и ожидалось, повторно экспрессируемый Trx2-WT был локализован внутри митохондрий, где он был колокализован с митохондриальным фактором транскрипции TFAM, тогда как Trx2-ΔMT гомогенно распределен в цитоплазме, как сообщалось ранее (Damdimopoulos et al., 2002). К нашему удивлению, Trx2-SIM, подобно Trx2-WT, полностью колокализуется в митохондриях (Рис. 3B).Эти результаты показывают, что Trx2 SIM не влияет на локализацию Trx2, но блокирует последующий процессинг Trx2 внутри митохондрий.

Рисунок 3. Мотив взаимодействия SUMO (SIM) не влияет на локализацию Trx2. Эндогенный Trx2 в EC был подавлен 3′-UTR siRNA Trx2, и Trx2-ΔMT дикого типа или Trx2-SIM повторно экспрессировались в клетках. (A) Лизаты клеток подвергали вестерн-блоттингу с анти-V5 и анти-Trx2. Указаны эндогенный Trx2 и различные формы сверхэкспрессированных белков Trx2. (B) Локализацию Trx2 определяли с помощью непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания анти-Trx2 и анти-TFAM. Масштабная линейка: 25 мкм (B) . Показанные данные являются репрезентативными для трех экспериментов.

Роль СУМОилирования MPP в обработке Trx2

Учитывая потенциальную роль SIM в процессинге Trx2, мы исследовали роль SUMOylations белков в процессинге Trx2. Гинкголевая кислота [GA, 2-гидрокси-6- (8-пентадеценил)] может специфически и напрямую связываться с SUMO-активирующим ферментом E1, блокируя образование промежуточного продукта E1-SUMO1 (Fukuda et al., 2009). Напротив, стрептонигрин (SN), натуральный продукт, выделенный из Streptomyces flocculus , действует как ингибитор SENP, нарушая взаимодействие SENP1-SUMO1, с более сильным ингибирующим действием против SENP1, чем другие SENP (Ambaye et al., 2018). Его ингибирующее действие на SUMO-2/3 было также обнаружено в различных клеточных линиях (Liu et al., 2018; Qiu et al., 2018). Сначала мы исследовали влияние GA на обработку Trx2. HUVEC обрабатывали различными концентрациями GA (0–100 мкМ) в течение 4 ч.Мы обнаружили, что GA в значительной степени индуцировал накопление PreTrx2 дозозависимым образом (рис. 4A). Затем мы использовали SN в качестве агониста SUMOylation, чтобы увидеть, может ли SN обратить H ₂ O ₂ индуцированную необработку Trx2. HUVEC обрабатывали H ₂ O ₂ в присутствии или в отсутствие SN. Результаты показали, что SN полностью уменьшил H ₂ O ₂ -индуцированное накопление PreTrx2 (фиг. 4B). Эти данные показывают, что химическое ингибирование SUMOylation белка ослабляется, в то время как ингибирование SENP1-опосредованного deSUMOylation (увеличение SUMOylation белка) способствует процессингу Trx2.

Рисунок 4. Роль SUMOylation белка MPP в процессинге Trx2. (A, B) Влияние SUMOylation на обработку Trx2. HUVEC обрабатывали различными концентрациями гинкголевой кислоты (GA) при 0–100 мкМ в течение 4 часов (A) или обрабатывали H ₂ O ₂ в течение 6 часов со стрептонигрином или без него (1 или 2 мкМ) (В) . Белок Trx2 определяли иммуноблоттингом. Указаны предшественник Trx2 (Pre-Trx2) и зрелый Trx2 (Tx2). (C) SUMOylation эндогенного α-MPP в HUVEC. Лизаты HUVEC подвергали совместной иммунопреципитации (co-IP) с анти-αMPP с последующим иммуноблоттингом с анти-SUMO1, анти-SUMO2 / 3 и анти-αMPP, соответственно. Показаны MPP и SUMOylated MPP. (D, E) GA блокирует СУМОилирование MPP. HUVEC не обрабатывали или обрабатывали GA (100 мкМ) в течение 4 часов. Общее количество SUMO1, SUMO2 / 3 и αMPP определяли иммуноблоттингом (D) . SUMOylation MPP было обнаружено как в C (E) . (F) HUVEC были инфицированы меченными V5 Trx2-WT, Trx2-MPP / MIP и Trx2-SIM. Ассоциацию Trx2 с эндогенным MPP определяли с помощью анализа коиммунопреципитации с анти-V5 (Trx2) с последующим иммуноблоттингом с анти-MPP. Указаны SUMOylated MPP. Все эксперименты повторяли трижды.

Мы предположили, что ферменты процессинга Trx2 (MPP и MIP) могут быть SUMOylated для облегчения процессинга Trx2. MPP представляет собой гетеродимерный фермент, ответственный за первое расщепление митохондриальной целевой последовательности.PMPCA (9q34.3) кодирует α-MPP, α-субъединицу процессирующей митохондрии пептидазы (MPP; также называемой PMPCA) (Gakh et al., 2002). Сообщается, что α-MPP может быть SUMOylated в нескольких сайтах с помощью масс-спектрометрии (Hendriks et al., 2017, 2018), поэтому мы сначала исследовали, может ли эндогенный α-MPP быть SUMOylated в HUVEC с помощью тестов коиммунопреципитации с антибиотиками. -MPP с последующим иммуноблоттингом с анти-SUMO1 и SUMO2 / 3. Результаты показали, что α-MPP (но не β-актин) был обнаружен при иммунопреципитации, и по крайней мере две более высокие полосы (∼80 кДа и ∼160 кДа) были обнаружены как в блотах SUMO1, так и SUMO2 / 3.Однако эти полосы отсутствовали при совместной иммунопреципитации IgG. Исходя из размера α-MPP (~ 50 кДа), α-MPP, вероятно, SUMO -илирован по множеству сайтов как SUMO1, так и SUMO2 / 3 (рис. 4C). Мы дополнительно проверили, может ли GA подавлять SUMOylation MPP, обрабатывая HUVEC GA (100 мкМ) в течение 4 часов. GA не влиял на общий уровень MPP, но уменьшал как MPP-SUMO1, так и MPP-SUMO2 / 3 (рисунки 4D, E).

Наконец, мы проверили, взаимодействует ли Trx2 через SIM напрямую с SUMOylated MPP. HUVEC были инфицированы V5-tagged Trx2-WT, Trx2-MPP / MIP и Trx2-SIM.Ассоциацию Trx2 с эндогенным MPP определяли с помощью анализа коиммунопреципитации с анти-V5 (Trx2) с последующим иммуноблоттингом с анти-MPP. Мы обнаружили, что Trx2-WT слабо, в то время как Trx2-MPP / MIP сильно связывается с SUMOylated MPP. Напротив, Trx2-SIM потерял способность связываться с SUMOylated MPP (рис. 4F). Более сильное связывание Trx2-MPP / MIP с SUMO -илированным MPP предполагает, что Trx2-MPP / MIP действует как мутант «улавливающий субстрат» (т.е. со связыванием фермента без расщепления). Взятые вместе, эти результаты показали, что SUMOylated MPP, связываясь с мотивом Trx2 SIM, опосредует расщепление Trx2 в MLS.

Trx2-SIM теряет активность против АФК и старения

Наши предыдущие и настоящие данные подтверждают, что Trx2 ответственен за супрессию ROS (Dai et al., 2009; Huang et al., 2015) и индуцированное ROS старение (see Figure 1). Мы исследовали, сохраняет ли Trx2-SIM, локализуясь в митохондриях без процессинга, активность Trx2 против ROS и против старения. С этой целью HUEVC были сверхэкспрессированы для Trx2-WT или Trx2-SIM с помощью системы экспрессии лентивируса. Экспрессию Trx2 подтверждали вестерн-блоттингом (фиг. 5А).Клетки не обрабатывали или обрабатывали митохондриальным индуктором ROS H ₂ O ₂ , который сильно индуцировал повышенные митохондриальные ROS, как измерено с помощью флуоресцентного зонда MitoSOX Red. Сверхэкспрессия Trx2-WT ослабляла H ₂ O ₂ , индуцированные митохондриальными ROS. Напротив, сверхэкспрессия Trx2-SIM немного увеличивала базальные митохондриальные ROS и значительно увеличивала H ₂ O ₂ -индуцированную генерацию ROS (фиг. 5B с количественной оценкой на фиг. 5C).

Рисунок 5. Trx2-SIM теряет активность против ROS и против старения. (A) Выражение Trx2. Клетки инфицировали лентивирусом, экспрессирующим Trx2 или Trx2-SIM. Экспрессию Trx2 подтверждали вестерн-блоттингом с анти-Trx2. Показаны PreTrx2, Trx2 из сверхэкспрессированных Trx2-WT и Trx2-SIM, а также эндогенный Trx2. (B, C) Влияние на генерацию ROS. Клетки, экспрессирующие Trx2-WT или Trx2-SIM, обрабатывали H ₂ O ₂ при 150 мкМ в течение 2 ч с последующим окрашиванием 20 нМ MitoTracker Green, 5 мкМ MitoSOX Red и 10 мкг / мл Hoechst в течение 30 мин.Были получены изображения флуоресценции и количественно определено соотношение MitoSOX Red-позитивных и MitoTracker Green-позитивных клеток. (D, E) Влияние на стареющие клетки. Репрезентативные изображения клеток, окрашенных SA-β-Gal (D) , с количественным определением% старения клеток (E) . Стрелки указывали на положительные клетки. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех независимых экспериментов. ^∗∗ P <0,01; ^∗∗∗ P <0,001. Масштабная линейка: 25 мкм (B) , 100 мкм (D) .

Чтобы дополнительно определить, влияет ли Trx2-SIM на функцию против старения Trx2, мы проанализировали ответ старения на H ₂ O ₂ в клетках, экспрессирующих Trx2-WT или Trx2-SIM, с помощью анализа SA-β-Gal. В соответствии с активностью против ROS, Trx2-WT подавлял индуцированное H ₂ O ₂ старение. Экспрессия Trx2-SIM не только слабо активировала базальную активность SA-β-Gal, но также сильно увеличивала индуцированное H ₂ O ₂ клеточное старение (фигуры 5D, E).Взятые вместе, эти данные указывают на то, что Trx2-SIM теряет активность по улавливанию ROS и против старения.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы демонстрируем, что Trx2 защищает эндотелиальные клетки от старения, а стимулы старения, такие как H ₂ O ₂ , нарушают процессинг Trx2 во время клеточного старения. Механически обработка Trx2 опосредуется сайтами распознавания MPP и MIP в MTS. Интересно, что SUMO-взаимодействующий мотив (SIM) в зрелом белке Trx2 также необходим для процессинга Trx2, не влияя на нацеливание на митохондрии Trx2.Примечательно, что ингибирование SUMOylation белка приводит к увеличению необработанного Trx2, указывая тем самым, что SUMOylation белка облегчает процессинг Trx2. Более того, необработанная форма Trx2 неспособна защитить клетки как от генерации АФК, так и от вызванного окислительным стрессом старения. Наше исследование идентифицирует новый механизм регуляции ROS Trx2 в клеточном старении посредством SUMOylation.

Как один из наиболее изученных митохондриальных белков, Trx2 представляет собой небольшой окислительно-восстановительный белок, повсеместно представленный в тканях с высокой метаболической активностью, таких как печень, мозг и сердце.Trx2 не только защищает от окислительного стресса в митохондриях, но также индуцирует клетки, нечувствительные к апоптозу, индуцированному АФК, путем регулирования молекул, связанных с апоптозом, и критических факторов транскрипции, таких как киназа, регулирующая сигнал апоптоза (ASK1) и ядерный фактор каппа B (NF- _{). k} B) (Zhang et al., 2004; Dai et al., 2009). Trx2 способен ингибировать апоптоз, индуцированный ASK1, как в клетках эндотелия, так и в кардиомиоцитах. Более того, сниженная экспрессия Trx2, повышенные уровни фосфорилированного ASK1 и активированной каспазы-3 обнаруживаются в кардиомиоцитах пациентов с дилатационной кардиомиопатией (DCM) по сравнению с таковыми у здоровых доноров органов (Huang et al., 2015). Однако роль Trx2 в старении не исследована.

В настоящем исследовании мы впервые выявили новую функцию против старения Trx2 в эндотелиальных клетках. В то время как окислительный стресс, вызванный H ₂ O ₂ , может привести к преждевременному старению (Toussaint et al., 2000; Huo et al., 2018), сверхэкспрессия Trx2 предотвращает, тогда как нокдаун Trx2 увеличивает H ₂ O ₂ -индуцированное старение эндотелия, на что указывает активность SA-β-gal и экспрессия связанных со старением маркеров, включая p-p53, p21 и p16.В подтверждение наших открытий сообщалось, что Trx2-взаимодействующий белок (TXNIP) может перемещаться в митохондрии, где он связывается и окисляет Trx2, что приводит к дисфункции митохондрий (Saxena et al., 2010). Кроме того, TXNIP способствует активации воспаления NLRP3 в стареющих эндотелиальных клетках (Yin et al., 2017), возможно, посредством ингибирования активности Trx2. Молекулярный механизм, с помощью которого Trx2 ингибирует старение эндотелия, еще предстоит выяснить.

Мы идентифицировали несколько уникальных мотивов внутри Trx2, критических для его митохондриального процессинга и антиоксидантной активности.Известно, что положительно заряженный MTS необходим для его закрепления в митохондриях (Gakh et al., 2002; Carapito et al., 2017), за которым следуют мотивы, расщепленные MPP, MIP и / или IMP для процессинга митохондриального белка. Мы показываем, что как MPP, так и MIP-мотивы опосредуют процессинг Trx2. Мутации в сайтах MPP и MIP, но не в сайте IMP, уменьшают зрелый Trx2 вместе с увеличением предшественников Trx2. Эти результаты согласуются с представлением, что IMP обычно участвует в созревании митохондриальных белков, доставленных в межмембранное пространство, тогда как MPP и MIP ответственны за созревание матриксных белков, таких как Trx2.

Наиболее важным открытием в нашем исследовании является то, что мы определили механизм, с помощью которого белок SUMOylation регулирует процессинг Trx2. Во-первых, ингибитор SUMOylation вызывает повышение уровня необработанного Trx2, тогда как агонист SUMOylation обращает вспять вызванную h3O2 непроцессинг Trx2, что коррелирует с их эффектами на клеточное старение. Во-вторых, мы неожиданно определили, что мотив SIM в зрелом Trx2 важен для процессинга Trx2 и антиоксидантной активности. Trx2 содержит потенциальную SIM-карту на основании анализа последовательностей, а мутация в мотиве SIM полностью блокирует процессинг Trx2, не нарушая нацеливания на митохондрии Trx2.Интересно, что Trx2-SIM блокирует расщепления как на сайтах MPP, так и на сайтах MIP, указывая тем самым, что домен Trx2 SIM (через связывание с SUMOs) является критическим для процессинга Trx2 в митохондриях. Это побудило нас изучить, являются ли сами MPP и / или MIP SUMOylated. В-третьих, наши данные показывают, что эндогенный α-MPP, фермент, который расщепляет пре-последовательность Trx2, SUMOylated как SUMO1, так и SUMO2 / 3 по множеству сайтов. Что еще более важно, либо Trx2-WT, либо мутант, улавливающий субстрат Trx2-MPP / MIP, но не Trx2-SIM, связываются с SUMOylated MPP.Мы предполагаем, что α-MPP связывает SIM-мотив Trx2 и рекрутирует Trx2 в комплекс MPP для его последующего расщепления (Figure 6: Модель роли SIM в процессинге и функции Trx2). Необходимо дополнительно изучить, является ли MIP также SUMOylated и модулирует ли SUMOylation ферментативную активность MPP и MIP во время процессинга Trx2.

Рисунок 6. Модель роли SIM в обработке и функционировании Trx2. Процессинг Trx2 опосредуется сайтами расщепления митохондриальной процессинговой пептидазой (MPP) и митохондриальной промежуточной пептидазой (MIP) в MTS.Мотив взаимодействия SUMO (SIM) в зрелом белке Trx2, хотя и не участвует в нацеливании на митохондрии, является критическим для процессинга Trx2. Субъединица α-MPP представляет собой SUMOylated белок, который потенциально рекрутирует Trx2 в комплекс MPP посредством связывания с SIM Trx2 для последующего расщепления. Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) приводят к генерации АФК и блокируют процессинг Trx2, что приводит к старению эндотелия и сердечно-сосудистым заболеваниям. Мотив взаимодействия SIM, SUMO; MTS, последовательность, направленная на митохондрии; MPP, митохондриальная процессинговая пептидаза.

Наше исследование обнаруживает новую, неожиданную связь между клеточным старением и процессингом митохондриального белка. Мы обнаружили, что стимулы старения вызывают старение эндотелиальных клеток одновременно с ослаблением митохондриального процессинга Trx2, что приводит к накоплению предшественника Trx2. Следует отметить, что в одном сообщении предполагается, что процессинг митохондрий Trx2 может регулироваться с помощью разобщения белка 3 (UCP3) посредством взаимодействия с MTS Trx2 (Hirasaka et al., 2011). Хотя процессинг Trx2 завершен, полученный в результате процессированный Trx2 не импортируется в митохондриальный матрикс, а скорее локализуется в межмембранном пространстве, где Trx2 может смягчать окислительный стресс, вызванный во время патологических состояний (Hirasaka et al., 2011). Необходимы дальнейшие исследования для изучения регуляции и функции процессинга Trx2 во время клеточного старения при старении и сердечно-сосудистых заболеваниях.

Доступность данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой рукописи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок любому квалифицированному исследователю.

Авторские взносы

Все авторы разработали и выполнили исследование и проанализировали данные. Рукопись написали CC, YC и WM.

Финансирование

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (U1601219 и 81600201), Научными грантами Гуанчжоу (№ 201604020131), а также грантами NIH R01 HL109420 и HL115148.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы ценим помощь Эла Менноне в получении изображений в Центре клеточной и молекулярной визуализации Йельского университета (CCMI).

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2019.01089/full#supplementary-material

Список литературы

Ambaye, N., Chen, C.H., Khanna, S., Li, Y.J., и Chen, Y. (2018). Стрептонигрин ингибирует SENP1 и вызывает деградацию индуцируемого гипоксией фактора 1альфа (HIF1альфа). Биохимия 57, 1807–1813. DOI: 10.1021 / acs.biochem.7b00947

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Боклер, Г., Бридье-Нахмиас, А., Загури, Дж. Ф., Саиб, А., и Замборлини, А. (2015). JASSA: комплексный инструмент для прогнозирования сайтов SUMOylation и SIM-карт. Биоинформатика 31, 3483–3491. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btv403

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бенджамин, Э. Дж., Блаха, М. Дж., Чиув, С. Е., Кушман, М., Дас, С. Р., Део, Р. и др. (2017). Обновление статистики сердечных заболеваний и инсульта за 2017 г .: отчет американской кардиологической ассоциации. Тираж 135, е146 – е603.

Google Scholar

Карапито, К., Кун, Л., Карим, Л., Ромпе, М., Рабилла, Т., Швенцер, Х. и др. (2017). Две протеомные методологии определения N-концов зрелых митохондриальных аминоацил-тРНК синтетаз человека. Методы 113, 111–119. DOI: 10.1016 / j.ymeth.2016.10.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коулман, П. Р., Хан, К. Н., Гримшоу, М., Лу, Ю., Ли, X., Brautigan, P.J., et al. (2010). Вызванное стрессом преждевременное старение, опосредованное новым геном SENEX, приводит к противовоспалительному фенотипу в эндотелиальных клетках. Кровь 116, 4016–4024. DOI: 10.1182 / кровь-2009-11-252700

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Dai, S., He, Y., Zhang, H., Yu, L., Wan, T., Xu, Z., et al. (2009). Эндотелиально-специфическая экспрессия митохондриального тиоредоксина способствует опосредованному ишемией артериогенезу и ангиогенезу. Артериосклер. Тромб. Васк. Биол. 29, 495–502. DOI: 10.1161 / ATVBAHA.108.180349

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дамдимопулос, А. Э., Миранда-Визуете, А., Пелто-Хукко, М., Густафссон, Дж. А., и Спайроу, Г. (2002). Митохондриальный тиоредоксин человека. Участие в митохондриальном мембранном потенциале и гибели клеток. J. Biol. Chem. 277, 33249–33257. DOI: 10.1074 / jbc.m203036200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дебаттисти, В., Геренцер, А.А., Саотоме, М., Дас, С., и Хайноцки, Г. (2017). АФК контролируют подвижность митохондрий через p38 и моторный адаптер Miro / Trak. Cell Rep. 21, 1667–1680. DOI: 10.1016 / j.celrep.2017.10.060

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Димри Г. П., Ли X., Базиль Г., Акоста М., Скотт Г., Роскелли К. и др. (1995). Биомаркер, идентифицирующий стареющие клетки человека в культуре и в стареющей коже in vivo. Proc. Natl. Акад.Sci. США 92, 9363–9367. DOI: 10.1073 / pnas.92.20.9363

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Finegold, J. A., Asaria, P., and Francis, D. P. (2013). Смертность от ишемической болезни сердца по странам, регионам и возрасту: статистика Всемирной организации здравоохранения и ООН. Внутр. J. Cardiol. 168, 934–945. DOI: 10.1016 / j.ijcard.2012.10.046

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фукуда, И., Ито, А., Хираи, Г., Нисимура, С., Кавасаки, Х., Сайто, Х. и др. (2009). Гинкголовая кислота ингибирует SUMO-илирование белка, блокируя образование промежуточного соединения E1-SUMO. Chem. Биол. 16, 133–140. DOI: 10.1016 / j.chembiol.2009.01.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гаро, Дж. Р. и Лима, К. Д. (2010). Путь SUMO: новые механизмы, которые формируют специфичность, конъюгацию и узнавание. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 861–871.DOI: 10.1038 / nrm3011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хендрикс, И. А., Лион, Д., Су, Д., Скотт, Н. Х., Даниэль, Дж. А., Йенсен, Л. Дж. И др. (2018). Сайт-специфическая характеристика эндогенного SUMOylation у разных видов и органов. Nat. Commun. 9: 2456. DOI: 10.1038 / s41467-018-04957-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хендрикс, И. А., Лион, Д., Янг, К., Йенсен, Л. Дж., Вертегаал, А.К., и Нильсен, М. Л. (2017). Сайт-специфическое картирование протеома SUMO человека выявляет совместную модификацию с фосфорилированием. Nat. Struct. Мол. Биол. 24, 325–336. DOI: 10.1038 / nsmb.3366

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хирасака К., Лаго К. У., Кенастон М. А., Фате К., Новински С. М., Никава Т. и др. (2011). Идентификация окислительно-восстановительного взаимодействия между разобщающим белком 3 и тиоредоксином 2 в митохондриальном межмембранном пространстве. Антиоксид. Редокс-сигнал. 15, 2645–2661. DOI: 10.1089 / ars.2011.3888

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Holzerova, E., Danhauser, K., Haack, T. B., Kremer, L. S., Melcher, M., Ingold, I., et al. (2016). Дефицит тиоредоксина 2 человека нарушает митохондриальный окислительно-восстановительный гомеостаз и вызывает раннее начало нейродегенерации. Мозг 139, 346–354. DOI: 10.1093 / мозг / awv350

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хорвич, А.Л., Калоусек Ф. и Розенберг Л. Э. (1985). Аргинин в лидерном пептиде необходим как для импорта, так и для протеолитического расщепления митохондриального предшественника. Proc. Natl. Акад. Sci. США 82, 4930–4933. DOI: 10.1073 / pnas.82.15.4930

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуанг, К., Чжоу, Х. Дж., Чжан, Х., Хуанг, Ю., Инодзоса-Киршенбаум, Ф., Фан, П., и др. (2015). Тиоредоксин-2 подавляет выработку митохондриальных активных форм кислорода и активность киназы-1 стресса апоптоза для поддержания сердечной функции. Тираж 131, 1082–1097. DOI: 10.1161 / CIRCULATIONAHA.114.012725

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хо, Дж., Сюй, З., Хосоэ, К., Кубо, Х., Мияхара, Х., Дай, Дж. И др. (2018). Коэнзим Q10 предотвращает старение и дисфункцию, вызванную окислительным стрессом в эндотелиальных клетках сосудов. Оксид. Med. Клетка. Longev. 2018: 3181759. DOI: 10.1155 / 2018/3181759

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кацууми, Г., Симидзу, И., Ёсида, Ю., Минамино, Т. (2018). Сосудистое старение при сердечно-сосудистых и метаболических заболеваниях. Фронт. Кардиоваск. Med. 5:18. DOI: 10.3389 / fcvm.2018.00018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, К., Ван, Л., Чжан, Дж., Хуанг, М., Вонг, Ф., Лю, X., et al. (2014). CERKL взаимодействует с митохондриальным TRX2 и защищает клетки сетчатки от апоптоза, вызванного окислительным стрессом. Biochim. Биофиз. Acta 1842, 1121–1129.DOI: 10.1016 / j.bbadis.2014.04.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Х., Сюй, К., Ли, К., Гао, X., Сугано, Э., Томита, Х. и др. (2017). Тиоредоксин 2 обеспечивает защиту от митохондриального окислительного стресса в клетках H9c2 и от гипертрофии миокарда, вызванной гипергликемией. Внутр. J Mol. Sci. 18: E1958. DOI: 10.3390 / ijms18091958

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Х., Ли Дж., Лу, Д., Ли, Дж., Лю, М., Хе, Ю. и др. (2018). Гинкголевая кислота, ингибитор сумоилирования, способствует фиксации адипоцитов, но подавляет терминальную дифференцировку адипоцитов стромальных клеток костного мозга мыши. Sci. Отчет 8: 2545. DOI: 10.1038 / s41598-018-20244-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нонн, Л., Берггрен, М., и Повис, Г. (2003). Повышенная экспрессия митохондриального пероксиредоксина-3 (тиоредоксинпероксидаза-2) защищает раковые клетки от гипоксии и лекарственно-индуцированного апоптоза, зависимого от перекиси водорода. Мол. Cancer Res. 1, 682–689.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Осебург, Х., Де Бур, Р. А., Буйкема, Х., Ван дер Харст, П., Ван Гилст, В. Х., и Силлье, Х. Х. (2010). Глюкагоноподобный пептид 1 предотвращает старение эндотелиальных клеток, вызванное активными формами кислорода, посредством активации протеинкиназы А. Arterioscler. Тромб. Васк. Биол. 30, 1407–1414. DOI: 10.1161 / ATVBAHA.110.206425

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цю, К., Wang, Y., Zhao, H., Qin, L., Shi, Y., Zhu, X., et al. (2017). Критическая роль SENP1-опосредованного десумоилирования GATA2 в стимулировании активации эндотелия при артериосклерозе трансплантата. Nat. Commun. 8: 15426. DOI: 10.1038 / ncomms15426

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Qiu, F., Dong, C., Liu, Y., Shao, X., Huang, D., Han, Y., et al. (2018). Фармакологическое ингибирование SUMO-1 гинкголевой кислотой облегчает сердечный фиброз, вызванный инфарктом миокарда у мышей. Toxicol. Прил. Pharmacol. 345, 1–9. DOI: 10.1016 / j.taap.2018.03.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сахин У., Де Зе Х. и Лаллеманд-Брайтенбах В. (2014a). Ядерные тела PML: сборка и сумоилирование, чувствительное к окислительному стрессу. Nucleus 5, 499–507. DOI: 10.4161 / 194.2014.970104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сахин, У., Ферхи, О., Жанна, М., Бенхенда, С., Бертье, К., Jollivet, F., et al. (2014b). Сборка ядерных тел PML, вызванная окислительным стрессом, контролирует сумоилирование белков-партнеров. J. Cell Biol. 204, 931–945. DOI: 10.1083 / jcb.201305148

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Саксена Г., Чен Дж. И Шалев А. (2010). Внутриклеточное перемещение и митохондриальная функция белка, взаимодействующего с тиоредоксином. J. Biol. Chem. 285, 3997–4005. DOI: 10.1074 / jbc.M109.034421

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Спайроу, Г., Энмарк, Э., Миранда-Визуете, А., и Густафссон, Дж. (1997). Клонирование и экспрессия нового тиоредоксина млекопитающих. J. Biol. Chem. 272, 2936–2941. DOI: 10.1074 / jbc.272.5.2936

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Танака Т., Хосои Ф., Ямагути-Иваи Ю., Накамура Х., Масутани Х., Уэда С. и др. (2002). Тиоредоксин-2 (TRX-2) является важным геном, регулирующим митохондриально-зависимый апоптоз. EMBO J. 21, 1695–1703. DOI: 10.1093 / emboj / 21.7.1695

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Туссен, О., Медрано, Э. Э., и фон Зглиницки, Т. (2000). Клеточные и молекулярные механизмы стресс-индуцированного преждевременного старения (SIPS) диплоидных фибробластов и меланоцитов человека. Exp. Геронтол. 35, 927–945. DOI: 10.1016 / s0531-5565 (00) 00180-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фогель, Г., Торин-Тресказес, Н., Фархат, Н., Нгуен, А., Вильнёв, Л., Мамарбачи, А. М. и др. (2007). Клеточное старение в эндотелиальных клетках пациентов с атеросклерозом ускоряется окислительным стрессом, связанным с факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний. мех. Aging Dev. 128, 662–671. DOI: 10.1016 / j.mad.2007.09.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сюэ, Б., Хед, Дж., И Макманн, А. (2017). Связь между выходом на пенсию и факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний в Китае: 20-летнее проспективное исследование. Am. J. Epidemiol. 185, 688–696. DOI: 10.1093 / aje / kww166

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Инь, Ю., Чжоу, З., Лю, В., Чанг, К., Сунь, Г., и Дай, Ю. (2017). Старение эндотелиальных клеток сосудов связано с активацией инфламмасомы, содержащей пириновый домен 3 (NLRP3) семейства NOD-подобных рецепторов, посредством пути реактивных форм кислорода (ROS) / тиоредоксин-взаимодействующего белка (TXNIP). Внутр. J. Biochem. Cell Biol. 84, 22–34. DOI: 10.1016 / j.biocel.2017.01.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhang, R., Al-Lamki, R., Bai, L., Streb, J. W., Miano, J. M., Bradley, J., et al. (2004). Тиоредоксин-2 ингибирует апоптоз, опосредованный ASK1 в митохондриях, JNK-независимым образом. Circ. Res. 94, 1483–1491. DOI: 10.1161 / 01.res.0000130525.37646.a7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжао, К., Се, Ю., Чжэн, Ю., Цзян, С., Лю, В., Mu, W., et al. (2014). GPS-SUMO: инструмент для предсказания сайтов сумоилирования и мотивов SUMO-взаимодействия. Nucleic Acids Res. 42, W325 – W330. DOI: 10.1093 / nar / gku383

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжоу, Х. Дж., Сюй, З., Ван, З., Чжан, Х., Саймонс, М., и Мин, В. (2018). SUMOylation VEGFR2 регулирует его внутриклеточный транспорт и патологический ангиогенез. Nat. Commun. 9: 3303. DOI: 10.1038 / s41467-018-05812-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжу, X., Ding, S., Qiu, C., Shi, Y., Song, L., Wang, Y., et al. (2017). SUMOylation негативно регулирует ангиогенез, воздействуя на эндотелиальный сигнал NOTCH. Circ. Res. 121, 636–649. DOI: 10.1161 / CIRCRESAHA.117.310696

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

YAP1-зависимая активация TRX2 необходима для ответа Saccharomyces cerevisiae на окислительный стресс гидропероксидами.

EMBO J. 1 февраля 1994 г .; 13 (3): 655–664.

Лаборатория генной регуляции, Императорский фонд исследования рака, Лондон, Великобритания.

Abstract

Исследована роль фактора транскрипции YAP1 в ответе клеток Saccharomyces cerevisiae на различные условия, вызывающие окислительный стресс. Клетки, дефицитные по YAP1, оказались сверхчувствительными к гидропероксидам и тиолоксидантам, тогда как сверхэкспрессия YAP1 придавала гиперрезистентность к тем же условиям. Эти обработки привели к увеличению YAP1-специфического связывания с ДНК вместе с увеличением YAP1-зависимой транскрипции.Наши результаты показывают, что это увеличение не связано с увеличением синтеза белка YAP1, а скорее является результатом модификации ранее существовавшего белка. С помощью специального генетического скрининга ген TRX2, один из двух генов S. cerevisiae, кодирующих белок тиоредоксин, был идентифицирован как важный для YAP1-зависимой устойчивости к гидропероксидам. Более того, эффективная экспрессия TRX2 зависела от YAP1 и усиливалась в условиях окислительного стресса.

Полный текст

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии.Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (2,1M) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей. Ссылки на PubMed также доступны для Избранные ссылки .

Изображения в этой статье

Щелкните изображение, чтобы увидеть его в увеличенном виде.

Избранные ссылки

Эти ссылки находятся в PubMed. Это может быть не полный список ссылок из этой статьи.

• Abate C, Curran T. Встречается с Фосом и Джуном по дороге к AP-1.Semin Cancer Biol. 1990 фев; 1 (1): 19–26. [PubMed] [Google Scholar]
• Abate C., Patel L, Rauscher FJ, 3rd, Curran T. Редокс-регуляция ДНК-связывающей активности fos и jun in vitro. Наука. 1990, 7 сентября; 249 (4973): 1157–1161. [PubMed] [Google Scholar]
• Amstad PA, Krupitza G, Cerutti PA. Механизм индукции c-fos активным кислородом. Cancer Res. 15 июля 1992 г .; 52 (14): 3952–3960. [PubMed] [Google Scholar]
• Ангел П., Карин М. Роль Jun, Fos и комплекса AP-1 в пролиферации и трансформации клеток.Biochim Biophys Acta. 1991, 10 декабря; 1072 (2-3): 129–157. [PubMed] [Google Scholar]
• Binétruy B, Smeal T, Karin M. Ха-Рас усиливает активность c-Jun и стимулирует фосфорилирование его домена активации. Природа. 1991 9 мая; 351 (6322): 122–127. [PubMed] [Google Scholar]
• Brot N, Weissbach H. Биохимия остатков сульфоксида метионина в белках. Биофакторы. 1991 июн; 3 (2): 91–96. [PubMed] [Google Scholar]
• Boyle WJ, Smeal T, Defize LH, Angel P, Woodgett JR, Karin M, Hunter T.Активация протеинкиназы C снижает фосфорилирование c-Jun в сайтах, которые негативно регулируют его ДНК-связывающую активность. Клетка. 1991 8 февраля; 64 (3): 573–584. [PubMed] [Google Scholar]
• Boyland E, Chasseaud LF. Катализируемые ферментами конъюгации глутатиона с ненасыщенными соединениями. Biochem J. Июль 1967, 104 (1): 95–102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Бриден Л., Нэсмит К. Контроль клеточного цикла дрожжевого гена HO: цис- и транс-действующие регуляторы. Клетка. 1987 13 февраля; 48 (3): 389–397.[PubMed] [Google Scholar]
• Dalton S, Treisman R. Характеристика SAP-1, белка, задействованного фактором ответа сыворотки на элемент ответа сыворотки c-fos. Клетка. 1992 7 февраля; 68 (3): 597–612. [PubMed] [Google Scholar]
• Девари Ю., Готтлиб Р.А., Лау Л.Ф., Карин М. Быстрая и предпочтительная активация гена c-jun во время УФ-ответа млекопитающих. Mol Cell Biol. 1991 Май; 11 (5): 2804–2811. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Фернандо М.Р., Нанри Х., Йошитаке С., Нагата-Куно К., Минаками С.Тиоредоксин регенерирует белки, инактивированные окислительным стрессом в эндотелиальных клетках. Eur J Biochem. 1992, 1 ноября; 209 (3): 917–922. [PubMed] [Google Scholar]
• Frame MC, Wilkie NM, Darling AJ, Chudleigh A, Pintzas A, Lang JC, Gillespie DA. Регуляция образования комплекса AP-1 / ДНК in vitro. Онкоген. 1991 Февраль; 6 (2): 205–209. [PubMed] [Google Scholar]
• Gan ZR. Гены тиоредоксина дрожжей. J Biol Chem. 1991 25 января; 266 (3): 1692–1696. [PubMed] [Google Scholar]
• Гонсалес Порке П., Бальдестен А., Райхард П.Участие тиоредоксиновой системы в восстановлении сульфоксида и сульфата метионина. J Biol Chem. 1970 10 мая; 245 (9): 2371–2374. [PubMed] [Google Scholar]
• Гриппо Дж. Ф., Холмгрен А., Пратт В. Б.. Доказательство того, что эндогенным, термостабильным фактором активации рецепторов глюкокортикоидов является тиоредоксин. J Biol Chem. 1985, 10 января; 260 (1): 93–97. [PubMed] [Google Scholar]
• Guarente L, Mason T. Heme регулирует транскрипцию гена CYC1 S. cerevisiae через расположенный выше сайт активации.Клетка. 1983 апр; 32 (4): 1279–1286. [PubMed] [Google Scholar]
• Харшман К.Д., Мой-Роули В.С., Паркер К.С. Активация транскрипции элементом распознавания AP-1 SV40 в дрожжах опосредуется фактором, подобным AP-1, который отличается от GCN4. Клетка. 22 апреля 1988 г.; 53 (2): 321–330. [PubMed] [Google Scholar]
• Hentze MW, Rouault TA, Harford JB, Klausner RD. Окисление-восстановление и молекулярный механизм регуляторного взаимодействия РНК-белок. Наука. 1989 21 апреля; 244 (4902): 357–359.[PubMed] [Google Scholar]
• Hertle K, Haase E, Brendel M. Ген SNQ3 Saccharomyces cerevisiae придает повышенную устойчивость к нескольким функционально не связанным химическим веществам. Курр Жене. 1991 июн; 19 (6): 429–433. [PubMed] [Google Scholar]
• Холмгрен А. Тиоредоксин. Анну Рев Биохим. 1985. 54: 237–271. [PubMed] [Google Scholar]
• Хуссейн М., Ленард Дж. Характеристика PDR4, гена Saccharomyces cerevisiae, который придает устойчивость к плейотропным препаратам в большом количестве копий: идентичность с YAP1, кодирующим активатор транскрипции [исправлено].Ген. 1991 15 мая; 101 (1): 149–152. [PubMed] [Google Scholar]
• Джонс Р. Х., Джонс, Северная Каролина. ЦАМФ-чувствительный элемент млекопитающих может активировать транскрипцию в дрожжах и связывает дрожжевой фактор (ы), который напоминает фактор транскрипции млекопитающих ANF. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1989 Apr; 86 (7): 2176–2180. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Джонс Р.Х., Морено С., медсестра П., Джонс, Северная Каролина. Экспрессия промотора SV40 в делящихся дрожжах: идентификация и характеристика AP-1-подобного фактора.Клетка. 20 мая 1988 г.; 53 (4): 659–667. [PubMed] [Google Scholar]
• ЛОРЕНТ ТК, МУР ЭК, РЕЙХАРД П. ФЕРМЕНТНЫЙ СИНТЕЗ ДЕОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ. IV. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ ТИОРЕДОКСИНА, ДОНОРА ВОДОРОДА ИЗ ESCHERICHIA COLI B. J Biol Chem. 1964 Октябрь; 239: 3436–3444. [PubMed] [Google Scholar]
• Лин Ю.С., Грин М.Р. Идентификация и очистка белка Saccharomyces cerevisiae со специфичностью связывания ДНК активирующего фактора транскрипции млекопитающих. Proc Natl Acad Sci U S A.1989 Янв; 86 (1): 109–113. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lin A, Frost J, Deng T., Smeal T, al-Alawi N, Kikkawa U, Hunter T., Brenner D, Karin M. Казеиновая киназа II является негативным регулятором связывания ДНК c-Jun и активности AP-1. Клетка. 1992 4 сентября; 70 (5): 777–789. [PubMed] [Google Scholar]
• Мицуи А., Хиракава Т., Йодой Дж. Реактивная активность по снижению кислорода и рефолдингу белков у фактора взрослого Т-клеточного лейкоза / тиоредоксина человека. Biochem Biophys Res Commun. 1992, 14 августа; 186 (3): 1220–1226.[PubMed] [Google Scholar]
• Мойе-Роули В.С., Харшман К.Д., Паркер С.С. YAP1 дрожжей кодирует новую форму семейства белков-активаторов транскрипции jun. Genes Dev. 1989 Март; 3 (3): 283–292. [PubMed] [Google Scholar]
• Нос К., Шибанума М., Кикучи К., Кагеяма Х., Сакияма С., Куроки Т. Транскрипционная активация генов раннего ответа перекисью водорода в линии остеобластных клеток мыши. Eur J Biochem. 1991, 1 октября; 201 (1): 99–106. [PubMed] [Google Scholar]
• Окамото Т., Огивара Х., Хаяси Т., Мицуи А., Кавабе Т., Йодой Дж.Человеческий тиоредоксин / фактор, происходящий от Т-клеточного лейкоза взрослых, активирует энхансер-связывающий белок вируса иммунодефицита человека типа 1 с помощью механизма тиолового окислительно-восстановительного контроля. Int Immunol. Июль 1992 г .; 4 (7): 811–819. [PubMed] [Google Scholar]
• Pulverer BJ, Kyriakis JM, Avruch J, Nikolakaki E, Woodgett JR. Фосфорилирование c-jun, опосредованное MAP-киназами. Природа. 1991, 17 октября; 353 (6345): 670–674. [PubMed] [Google Scholar]
• Schnell N, Entian KD. Идентификация и характеристика гена Saccharomyces cerevisiae (PAR1), придающего устойчивость к хелаторам железа.Eur J Biochem. 1991, 1 сентября; 200 (2): 487–493. [PubMed] [Google Scholar]
• Schnell N, Krems B, Entian KD. Ген PAR1 (YAP1 / SNQ3) Saccharomyces cerevisiae, гомолог c-jun, участвует в метаболизме кислорода. Курр Жене. 1992 апр; 21 (4-5): 269–273. [PubMed] [Google Scholar]
• Struhl K. ДНК-связывающие домены онкобелка jun и дрожжевого белка активатора транскрипции GCN4 функционально гомологичны. Клетка. 1987, 11 сентября; 50 (6): 841–846. [PubMed] [Google Scholar]
• Тагая Й., Маеда Й., Мицуи А., Кондо Н., Мацуи Х., Хамуро Дж., Браун Н., Араи К., Йокота Т., Вакасуги Х. и др.Фактор, производный от ATL (ADF), рецептор IL-2 / индуктор Tac, гомологичный тиоредоксину; возможное участие дитиол-редукции в индукции рецептора IL-2. EMBO J. 1989 Mar; 8 (3): 757–764. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Толедано МБ, Леонард В.Дж. Модуляция связывающей активности фактора транскрипции NF-каппа B путем окисления-восстановления in vitro. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1991, 15 мая; 88 (10): 4328–4332. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Тода Т., Шимануки М., Янагида М.Гены делящихся дрожжей, которые придают устойчивость к стауроспорину, кодируют AP-1-подобный фактор транскрипции и протеинкиназу, родственную ERK1 / MAP2 млекопитающих и киназы FUS3 и KSS1 почкующихся дрожжей. Genes Dev. 1991, январь; 5 (1): 60–73. [PubMed] [Google Scholar]
• Wollman EE, d’Auriol L, Rimsky L, Shaw A, Jacquot JP, Wingfield P, Graber P, Dessarps F, Robin P, Galibert F, et al. Клонирование и экспрессия кДНК тиоредоксина человека. J Biol Chem. 1988 25 октября; 263 (30): 15506–15512. [PubMed] [Google Scholar]

Статьи из журнала EMBO представлены здесь с любезного разрешения Европейской организации молекулярной биологии

Тиоредоксин 2 — обзор

5.2 Измерение окислительно-восстановительного баланса тиоредоксина с помощью анализа ПЭГилирования

Второй белок, который дает представление о окислительно-восстановительной среде тиола в митохондриях, — это Trx2 (Arner and Holmgren, 2000; Lee et al. ., 1999; Miranda-Vizuete et al . , 1999; Spyrou et al ., 1997). Trx2 играет важную роль в поддержании окислительно-восстановительного состояния белка в митохондриях. Он существует как в окисленной форме, характеризующейся внутримолекулярным дисульфидом, так и в восстановленной форме, в которой дитиол способен восстанавливать другие дисульфиды белка.Восстановление тиолов других белков с помощью Trx2 регенерирует окисленную форму, которая затем может быть восстановлена ​​с помощью TrxR2. Следовательно, соотношение восстановленных форм Trx2 к окисленным будет указывать на устойчивый уровень митохондриального пула Trx2. Был разработан ряд анализов для оценки окислительно-восстановительного состояния Trx2, которые функционируют путем разделения этих двух окислительно-восстановительных форм электрофорезом на нативном геле или геле мочевины и затем их идентификации с помощью иммуноблоттинга (Bersani et al ., 2002; Chen et al ., 2002). Мы обнаружили, что выборочная маркировка окисленной формы Trx2 полимерами полиэтиленгликоля (ПЭГ), модифицированными малеимидом (PEG) 2 кДа, приводит к значительной разнице в размерах между восстановленной и окисленной формами и означает, что они могут быть разделены на стандартном SDS-PAGE. Затем Trx2 переносится на мембрану для блоттинга и визуализируется с использованием специфических антител. Эта процедура имеет то преимущество, что, в зависимости от селективности и аффинности используемых антител, окислительно-восстановительный потенциал пула Trx2 может быть оценен в сложных смесях без какой-либо очистки.При этом жизненно важно гарантировать, что тушение восстановленной формы Trx2 происходит быстро и что во время обработки не происходит артефактного окисления или восстановления, чтобы гарантировать, что измеренное соотношение отражает это соотношение внутри митохондрий в условиях устойчивого состояния.

Принцип этого анализа описан на рис. 8.5. После воздействия прооксиданта изолированные митохондрии обрабатывают NEM для блокирования экспонированных тиолов, которые впоследствии лизируются, и белков, денатурированных с помощью SDS. После удаления NEM с помощью центробежной гель-фильтрации и восстановления всех окисленных тиолов добавлением DTT.Восстановленные тиолы затем реагируют с малеимидом полиэтиленгликоля (mPEG2). Это приводит к сдвигу молекулярной массы примерно на 4 кДа для полностью окисленного по сравнению с полностью восстановленным Trx2, а для монотиола — к сдвигу молекулярной массы примерно на 2 кДа. Образцы разделяют путем восстановления SDS-PAGE, переносят в PVDF и отдельные полосы Trx2, обнаруживаемые с помощью антитела αTrx2 и подходящего вторичного антитела. Эти эксперименты проводятся с использованием изолированных митохондрий или культивируемых клеток, но метод должен быть легко адаптирован к другим исходным материалам, таким как целые организмы, такие как мухи и нематоды.Пример оценки редокс-состояния Trx2 в изолированных митохондриях приведен ниже.

Митохондрии инкубируют в стандартных условиях (например, 1 мг белка / мл в буфере SHE, 250 мкл сахарозы M , 10 мкл M HEPES, 1 мкл M EGTA, pH 7,4) в присутствии и в отсутствие окислительно-восстановительный потенциал, такой как диамид. После инкубации добавляют 25–50 мл M NEM для предотвращения спонтанного окисления тиолов. Затем митохондрии выделяют центрифугированием и осадок ресуспендируют в 50 мкл буфера SHE, содержащего 50 мкл M NEM, инкубируют в течение 5 мин при 37 ° C.Затем добавляют SDS (1% мас. / Об.) И суспензию инкубируют еще 2,5 мин при 37 ° C. После алкилирования NEM удаляют с помощью эксклюзионной хроматографической колонки (Micro Bio-Spin ^® 6 Chromatography Columns, Bio-Rad), предварительно уравновешенной буфером SHE, содержащим SDS 1% (мас. / Об.). Затем образцы восстанавливают 2,5 м M DTT в течение 10 мин при комнатной температуре с последующим алкилированием 1 об. 2 кДа mPEG2 (50 мкМ M mPEG2 в буфере SHE, pH 7,4) в течение 30 мин при 37 ° C. Для определения концентрации белка в образцах проводится анализ BCA.Затем осаждают 50 мкг белка, используя 9 объемов. ледяной ацетон и инкубируют ~ 2 ч при -20 ° C. Осажденный белок осаждают центрифугированием (15000 × г, , 10 мин) и супернатант отбрасывают. Осадок промывают 80% (об. / Об.) Ацетоном в течение 10 мин при постоянном перемешивании, и образцы снова центрифугируют (15000 × г , 10 мин). Супернатант отбрасывают, осадки сушат на воздухе, а затем ресуспендируют в стандартном буфере для загрузки геля SDS – PAGE с DTT и разделяют на 12.5% SDS – PAGE в восстанавливающих условиях. После электрофореза гель промывают в течение 15 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании в буфере для переноса (48 мкл M Трис-основание, 39 мкл M глицин, 0,05% (мас. / Об.) SDS, 35% (об.) метанол). PVDF-мембрана с высоким сродством и низким размером пор (0,2 мкм Immobilon ™ -P ^SQ , Millipore) используется из-за низкой молекулярной массы Trx2. Мембрану сначала инкубируют при комнатной температуре в течение 15 с в абсолютном метаноле, а затем проводят 2-минутную стадию промывки в H ₂ O.Перенос проводят в ячейке для переноса Bio-Rad Mini Protean 3 с использованием буфера для переноса в течение 50 мин при 110 В и 4 ° C. После переноса мембрану инкубируют в блокирующем буфере (PBST) (137 м M NaCl, 10,2 м M NaHPO ₄ , 2,7 м M KCl, 1,8 м M KH ₂ PO ₄ , pH 7,4 и 0,05% (об. / об.) Tween 20 (NBS Biologicals, UK)) с 5% (мас. / об.) сухого обезжиренного молока при комнатной температуре в течение 1 часа. Блокирующий буфер удаляют, и мембраны инкубируют с первичным антителом αTrx2-антителом (1: 5000) (аффинно очищенное козье антитело против тиоредоксина2 / Trx2 человека / мыши / крысы, R&D Systems) в блокирующем буфере при комнатной температуре в течение 1 часа.После инкубации мембраны трижды промывают по 10 мин PBST (см. Блокирующий буфер), а затем инкубируют с подходящим вторичным антителом (1:20 000 в блокирующем буфере) (кроличий анти-козий IgG-пероксидаза, Sigma) при комнатной температуре в течение 1 часа.