Способ применения протеина: Как принимать протеин для набора массы и похудения

Содержание

Способ применения протеина. Виды протеина и цель применения

Протеин — научный термин, применяется для обозначения белка. Состав белка человеческого тела включает в себя 20 аминокислот.

Эти аминокислоты делятся на две группы: заменимые и незаменимые. Заменимые аминокислоты организм способен синтезировать самостоятельно из других элементов. Незаменимые аминокислоты должны поступать в организм с пищей или добавками. Если аминокислот не хватает в теле человека, то построение белка невозможно. Это плохо, ведь белок жизненно необходим. Виды, цель применения протеина и рекомендации к употреблению вы найдете ниже. Чем примечательно данное вещество?

Польза

Для чего нужен протеин спортсменам? Одной из функций белка является «моторная функция» — обеспечение сокращения и роста мышц. То есть при грамотно разработанной программе тренировок, без необходимого спортивного питания, мышцы расти не будут. Рекомендуется обеспечить организм теми самыми 10 незаменимыми аминокислотами. Для этого необходим прием вещества. Срок годности протеина для набора мышечной массы зависит от вида продукта.

Инструкция по применению

Как употреблять протеин? В человеческом организме находится большое количество белка, необходимого для жизни, усиливающего иммунную систему, придающего выносливости спортсменам на тренировках. Протеин — незаменимый источник белка.

Как пользоваться протеином? О том, что это нужно спортсменам, знают многие, но что это за вещество и как его принимать — интересуются далеко не все. Для каждого человека предназначена своя порция протеина, учитывая индивидуальные особенности организма, поэтому не стоит забывать о противопоказаниях.

Способ применения протеина: употребляют вещество примерно три раза в день. Выпивают протеиновый коктейль за один час до тренировки. Нормой считается 30-60 г в день. Добавлять можно в воду, сок, молоко, плавно помешивая. Не стоит использовать кипяток, который уничтожает полезные свойства белка. Дневную порцию можно делить на несколько приемов.

Важно! Чтобы набрать мышечную массу, протеин надо принимать между приемами пищи, а также после тренировки для восстановления и наращивания мышц. Для похудения протеином можно заменить несколько приемов пищи, что восполнит белок в организме. В день рекомендуется выпивать не более трех коктейлей. Протеин необходимо принимать в правильном количестве. Такой подход обеспечит необходимое поступление белка в организм и защитит от противопоказаний.

Рейтинг производителей протеина

В спортивном питании спортсменов и любителей бодибилдинга, заинтересованных в наращивании мышечной массы, протеины занимают ведущее положение. В мире существует много производителей этого нужного продукта, но среди спортсменов, употребляющих эти препараты, установлен негласный рейтинг, определяемый спросом. Общий рейтинг устанавливается также в соответствии с мнением различных спортивных изданий и определением соотношения цена-качество.

При выборе предпочтений той или иной фирме учитываются, прежде всего, легкость усвоения, эффективность выпускаемой продукции, оцениваемой по способности вызывать рост мышечной массы, продолжительность их действия в течение и после тренировки, вкусовые качества. Кроме того, ценятся такие свойства, как нейтрализация молочной кислоты, провоцирующей болевые ощущения после тренировки, положительное влияние на гормональный статус и обменные процессы, уменьшение подкожной жировой прослойки, рост иммунитета.

К отрицательным свойствам относят чаще всего высокую стоимость, наличие в составе красителей, подсластителей и ароматизаторов, негативное влияние на пищеварение и другие внутренние органы.

Анализируя рынок с учетом спроса и положительных отзывов покупателей, фирмы-производители протеинов можно расположить в следующем порядке:

  1. Optimum Nutrition.
  2. Nutrabolics.
  3. SAN.
  4. MusclePharm.

Порядок рейтинга этих ведущих фирм может меняться в зависимости от характера выпускаемого продукта. Срок годности протеина для набора мышечной массы находится в пределах трех недель.

Кроме того, при выборе фирмы-производителя необходимо учитывать, что каждая компания производит продукты со своими особенностями, преимуществами и недостатками. Поэтому при выборе стоит вначале детально ознакомиться с описанием, инструкцией и правилами приема протеина. Особенно внимательным должен быть подход к наличию противопоказаний и аллергенных свойств у продукта.

Концентрат сывороточного протеина

Сывороточный концентрированный протеин представляет собой подвид пищевой добавки, который состоит из концентрированных субфракций белка. Глобулярные белки получают из молочной сыворотки. Любые суфракции белка (альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин), которые получают из сыворотки, имеют поистине уникальный набор биологических свойств.

Концентрат сывороточного протеина – это наиболее доступная и выгодная форма современного сывороточного белка. Изготавливаемое из сывороточных протеинов спортивное питание очень популярно среди профессиональных атлетов, бодибилдеров и других людей, которые стремятся подтянуть свое тело. Данная пищевая добавка способствует сушке мышц, а также дает возможность быстро восстановить мышечную массу и привести их в нормальное состоянии, воздействуя на рычаги их развития и роста. Уникальным свойством сывороточного концентрированного протеина является его способность воздействия на уровень глутатиона — антиоксиданта и важного элемента трипептида, регулирующего функционирование иммунной системы. В результате выведения из сыворотки белка, в концентрате нередко могут оставаться жиры и лактоза. Это способствует снижению стоимости концентрата сывороточного протеина.

Казеин

Казеин представляет собой разновидность протеина – это особый белок, который имеет молочное происхождение. Данное вещество состоит из минералов, витаминов и аминокислот, которые нужны организму, регулярно подвергающемуся интенсивным тренировкам и нагрузкам. Кальций – это строительный материал, многосоставной белок, желеобразная масса, которая получается из-за створаживания молока ферментами.

Проще говоря, казеин – это разновидность спортивного питания, которое незаменимо при усиленных нагрузках. Это основной компонент спортпита, который используется в качестве специального вяжущего вещества. Он помогает довольно быстро получить удовлетворительный результат, постепенно совершенствуя и улучшая внешний вид тела. Попадая в желудок, казеин превращается в сгусток, который благодаря блокировке желудочного сока долго усваивается, на протяжении длительного времени обеспечивая организму необходимое количество аминокислот, а также чувство сытости.

Принимая казеин, важно учитывать его действие. Это даст возможность не допустить развития нежелательных и даже опасных последствий. Превышение указанной дозировки может привести к расстройству, появлению тошноты и некоторых заболеваний желудка. Также казеин не рекомендуется принимать людям, имеющим индивидуальную непереносимость, дабы не допустить возникновения аллергии, болей, диареи, вздутия и заболеваний желудка.

Гидролизат белка

Гидролизат белка — это простейшие компоненты белковой структуры, которые получены опытным путем на производстве. Их создание и выпуск относится к классу медицинских разработок и показан для введения через зонд, для парентерального питания.

К основным разновидностям гидролизированных продуктов относят протеин, способ применения которого разный:

  1. Гидролизин (Л-103) – получают из сыворотки крупного рогатого скота. Гидролиз ведется с применением соляной кислоты, которая разделяет компоненты кровяных сгустков на азотистое основание и минеральные соли, необходимые живому организму для полноценной жизнедеятельности.
  2. Гидролизат казеина (ЦОЛИПК) – этот компонент можно встретить почти в каждой адаптированной сухой смеси для детей. Он создается путем кипячения белка казеина и серной кислоты. После фильтрации с участием ионизирующих компонентов продукт получает новую форму, содержащую все основные микроэлементы: кальций, магний, железо, натрий, калий.
  3. Аминопептид – готовится из ферментов поджелудочной железы крупного рогатого скота. По своим питательным свойствам аналогичен всем вышеуказанным видам гидролизированного белка. Аминопептид назначается только тем людям, которые перенесли сложную операцию и не способны усваивать более сложные белковые компоненты даже в расщепленном виде.

Изолят сывороточного протеина

Изолят сывороточного протеина считается спортивной добавкой, образованной посредством обработки молочного белка. Эта сыворотка — не что иное, как второстепенный провиант процесса изготовления сыра и других снежных товаров питания. Сывороточный изолят протеина с целью питания в большинстве случаев получают ультра-микрофильтрационным методом. Используется, в основном, для набора массы и качественного роста мышц.

Основные группы

Сывороточный белок делится на три основные группы:

  • Сывороточный изолят – форма с высокой степенью очистки (свыше 86 % чистого белка), в которой практически не присутствует жир, холестерин и углеводы.
  • Сывороточный концентрат — выделяется малой стоимостью из-за легкости производства, включает в себя 61-86 % белка. Несмотря на это, нет фактов, указывающих на отставание по анаболическому воздействию и иным полезным характеристикам от изолятов.
  • Гидролизат — изготавливают путем уничтожения (гидролизации) изолята для того, чтобы увеличить скорость усваивания организмом. Имеет максимальные анаболические свойства, но и, естественно, высокую стоимость. Изолят сывороточного белка довольно быстро перерабатывается организмом и имеет высокое содержание аминокислот, которые доминируют в метаболизме мышечной массы.

Соевый протеин

Соевый протеин является наиболее бюджетным и доступным видом протеина. Его основными характеристиками является доступная цена, концентрация белка, а также наличие в данной добавке жиров, углеводов и лактозы. Это лучший вид протеинов для спортсменов, поскольку он способствует стимуляции роста мышечной массы. Регулярное потребление соевого протеина способствует снижению содержания жиров. Этот фактор необходимо учитывать в питании для формирования подкожного жира. Кроме того, соя снижает высокий уровень холестерина, который может приводить к появлению тромбоза. Потреблении соевого белка заметно снижает риск развития атеросклероза.

Данный вид протеина представляет собой популярный источник очень важных для организма аминокислот, причем их содержание здесь намного выше, нежели в яичном или сывороточном протеине. В соевом белке много аргинина, обеспечивающего укрепление иммунитета. Из-за низкого содержания в составе соевого протеина метионина производители дополнительно обогащают данный белок питательными смесями. Так, соевое питание для спортсменов по своему эффекту и качеству незначительно уступает яичному или молочному протеину.

В бодибилдинге соевый белок используют для сжигания лишнего жира и наращивания мышц. Максимальным эффектом обладают изоляты. Осуществляя обработку сырья, производители спортивных смесей в минимальном количестве используют антинутриенты – антипитательные вещества. Соевый протеин очень удобно использовать, и в нем содержатся белки, которые по своей пищевой ценности и питательности не уступают животным белкам. Способ применения протеина зависит от желаемого результата. В наше время производители выпускают протеин, который не содержит фитоэстрогенов.

Яичный протеин

Самым привычным и знакомым источника белка для людей, занимающихся силовыми видами спорта, являются куриные яйца. В этом продукте содержится животный белок, который прекрасно усваивается, помимо этого в состав куриных яиц входят аминокислоты и различные микроэлементы, которые тоже способствуют росту мышечной массы. Производители спортивных добавок предложили спортсменам более эффективный продукт — яичный протеин, благодаря которому мышечная масса наращивается гораздо быстрее. Яичный протеин представляет собой специальную пищевую добавку в виде порошка, которую получают из натурального куриного белка. Причем в процессе производства такой добавки из куриного белка удаляется жир и остальные лишние компоненты, а также уничтожаются все микробы под воздействием высоких температур. После такой переработки остается лишь чистый протеин, состоящий только из белка.

Достоинства яичного протеина

Эта пищевая добавка практически полностью и быстро усваивается. Кроме того, этот продукт можно использовать для сушки, а также для увеличения сухой мышечной массы. Женщины, которые хотели бы довести до идеала в спортзале свою фигуру, могут принимать эту пищевую добавку, которая поможет ускорить рост мышц в нужных местах.

Противопоказания к употреблению яичного протеина

Существуют некоторые противопоказания, которые нужно учесть тем, кто хочет принимать яичный протеин. В первую очередь, с большой осторожностью следует принимать такой продукт людям, имеющим индивидуальную непереносимость к белку. Кроме того, яичный протеин могут использовать те, кто активно занимается спортом, так как при нехватке физической активности избыточное количество протеина будет способствовать росту не мышечной массы, а жировых тканей.

Изолят молочного белка

Различные виды изолятов белка представляют собой выделенный из различных субстанций и очищенный от посторонних примесей белок. Такие продукты являются одним из главных компонентов спортивного питания. Белок в очищенном виде полезен при наращивании мышечной массы. Какие существуют способы применения протеина данного вида?

Один из лучших продуктов спортивного питания этой категории — изолят молочного белка. Этот продукт получают из натурального цельного молока с помощью специального приема ультрафильтрации, обеспечивающем удаление воды, жиров и углеводов. Конечный продукт содержит 85 % молочного белка, не отягощенного лишними калориями, включающим в себя около 80 % казеина и 20 % полезных для здоровья фракций молочной сыворотки, с благотворным воздействием на иммунную систему человека. Принимая во внимание тот факт, что, несмотря на всю полезность молока, его употребление в натуральном виде является проблематичным для взрослых людей, неоценимой является польза такого препарата, содержащего его главные компоненты в форме изолята.

Таким образом, изолят молочного белка может удовлетворить потребность спортсмена в белковом питании. Он способен заменить употребление цельного молока с его некоторыми негативными качествами, сохраняя самые полезные его свойства.

Сывороточный протеин Golden Whey 907 гр от Maxler

907 г

Размер порции: 33 г

Порций в упаковке: 27

В одной порции    
Калории 130 ккал  

Белки

24 г  
Углеводы 5 г  
Жиры 2 г  
   Насыщенные жиры 1 г  
Витамин А 50 мкг  
Витамин С 0 мг  
Натрий 100 мг  
Кальций 122 мг  
Калий 270 мг  
Железо 1 мг  
Аминокислоты    
Л-триптофан 405 мг  

Л-валин

1422 мг  
Л-треонин 1654 мг  

Л-изолейцин

1573 мг  
Л-лейцин 2531 мг  
Л-лизин 2233 мг  
Л-фенилаланин 748 мг  

Л-метионин

422 мг  
Л-аргинин 570 мг  

Л-цистеин

470 мг  
Л-тирозин 703 мг  

Л-гистидин

423 мг  
Л-пролин 1509 мг  

Л-глютаминовая кислота

3880 мг  
Л-аспарагиновая кислота 2400 мг  

Л-серин

1126 мг  
Л-глицин 440 мг  

Л-аланин

1160 мг  
Примечание: количество указано из расчета на 1 порцию (33 г)    

† Дневная норма не установлена

* Рекомендуемые дневные нормы основаны на 2000 ккал диете

Ингредиенты: протеиновая смесь (изолят сывороточного протеина, концентрат сывороточного протеина, сывороточные пептиды), искусственные ароматизаторы, лецитин, ацесульфам калия.

Способ применения: для получения одной порции смешайте 33 г порошка (1 мерную ложку) с 180-240 мл воды, молока или сока по Вашему

вкусу. Для приготовления менее насыщенной смеси, разведите одну ложку порошка в 250-300 мл жидкости.

Противопоказания: индивидуальная непереносимость компонентов продукта, беременным и кормящим женщинам, детям. Перед применением проконсультируйтесь со специалистом.

Примечание: не является лекарственным средством.

Условия хранения: хранить в закрытом состоянии в сухом, прохладном месте. Срок реализации указан на упаковке.

Maxler Golden Whey  – это чистый сывороточный белок премиум класса,который идеально подходит для интенсивных тренировок!

Продукт содержит 100% чистые концентрат, изолят и гидролизатсывороточного протеина высокого качества, обеспечивающий быстрое

всасывание и усваивание белка. Незаменим в период интенсивных тренировок, когда необходимо увеличить потребление белка для поддержки

положительного баланса азота и насыщения мышц необходимыми для роста и восстановления аминокислотами. 

 

Maxler Golden Whey  – это легко усваиваемый продукт, насыщенный незаменимыми аминокислотами (BCAA) для быстрого восстановления мышечной ткани после тренировок.

 

Maxler Golden Whey  — новинка от Maxler.

 

  • 100% ультрафильтрованный сывороточный протеин
  • высокая концентрация BCAA
  • рост мышечной массы, быстрая потеря жира
  • и моментальное восстановление
  • легко усваивающийся белок для тонуса мышц

Протеин, применение протеинов, протеины для мышц и роста

Протеин — Применение протеинов

Экспериментально доказано, что добавление сывороточного протеина в диету людей, уже потребляющих достаточно белка, обязательно приводит к росту мышечной массы тела. Читайте подробнее…

Главное условие мышечного роста — избыток белкового сырья в вашем желудке!

Вы не раз и не два слышали, что культуристу надо есть много натуральных белковых продуктов — мяса, рыбы, яиц и пр. Все это так, не буду спорить, однако у такой позиции есть один уязвимый пункт. Все природные продукты попутно содержат много холестерина. Ну а холестерин, сами знаете, первый враг сердца. Так что высокобелковая диета запросто может выйти вам боком.

С другой стороны, у нас в арсенале есть концентрированные белковые смеси. В них совсем нет холестерина, так что без всякого вреда вы можете принимать их сколько угодно. Тем не менее, многие опытные качки предпочитают порошкам натуральный белок — мол, эффект совсем не тот. А почему? Да потому, что повышенную потребность в белке нельзя покрывать за счет абы какого-протеина. Каждый вид белка имеет свои плюсы и минусы. В этом смысле разработка рациона питания в чем-то напоминает игру в шахматы; здесь нужно двинуть вперед королеву, там — увести из-под удара ладью. Это я к тому, что белковое питание — целая стратегия, которая состоит из неизбежных тактических компромиссов.

Сыворотка или казеин?

Знаете, в чем наша беда? Научное изучение воздействия белка на организм человека началось совсем недавно. И каждый новый эксперимент опрокидывает наши прежние «аксиомы».

Привычно мы считаем лучшим белком сывороточный. Больше того, производители сворачивают производство других белков и скоро на рынке, похоже, не останется ничего другого. Да, сывороточный белок усваивается куда быстрее любого другого. Да, он быстрее насыщает кровь аминокислотами. Но вот научный сюрприз! Быстрое усвоение вовсе не синоним высокого анаболизма, т.е. мышечного роста! Чтобы сывороточный протеин «заработал», его надо есть часто, очень часто — каждые полчаса!

Вот результаты опыта, который поставили на качках французские ученые. Первая группа раз в день получала молочный белок казеин, который, как известно, медленно переваривается в желудочно-кишечном тракте. Вторая группа — аминокислоты в свободной форме, тоже раз в день. Третья — сывороточный белок (раз в день). И четвертая — сывороточный белок, но небольшими порциями 13 раз каждые 20 минут. Спустя 7 часов после приема белка испытуемые обследовались на предмет лейцинового баланса — этот показатель характеризует уровень анаболизма.

Так вот, анаболизм был выше в первой группе, чем во второй. Казеин оказался лучше аминокислот. В третьей группе анаболизм был самым низким. Понятно почему. Сывороточный белок быстро усваивается, но так же быстро покидает кровь. В итоге остаток дня мышцы живут на голодном пайке — аминокислот в крови по минимуму. Ну а самым высоким был анаболизм в четвертой группе, где испытуемые получали сывороточный белок часто.

Итак, все ясно. Ученые, казалось бы, точно установили, какой белок и какой способ его приема наиболее эффективны с точки зрения прироста мышечной массы. Однако, речь идет о выводах науки, а в жизни все по-другому. Вот смотрите.

Сценарий первый. Допустим, вам предстоит напряженный учебный или рабочий день без обеденного перерыва. В этом случае лучший выход — «нагрузиться» казеином под завязку еще утром, до начала работы или учебы. Разовый прием сывороточного протеина посреди дня, вы уже знаете, вас не спасет. А вот казеин помалу будет отдавать в кровь аминокислоты, поддерживая относительно ровный уровень анаболизма.

Сценарий второй. Перед сном тоже лучше всего «заправиться» казеином. Если вы примете сывороточный протеин, то он «действует» от силы несколько часов. А вот казеин — это «долгоиграющий» белок. Он поддержит ваши мышцы до самого пробуждения.

Сценарий третий. Сразу после тренировки необходимо «вкачать» в мускулатуру побольше аминокислот. В данном случае принять надо сывороточный протеин. Тут мощный кратковременный аминокислотный всплеск как раз кстати.

Сценарий четвертый. Если вы ведете, так сказать, свободный образ жизни, то принимать надо сывороточный протеин, и как можно чаще. Разделите дневную норму белка на малые порции и составьте график частого приема порций. Промежуточный интервал — не дольше 3 часов.

Сценарий пятый. Если вы знаете, что в течение ближайших нескольких часов поесть не удастся, примите опять же казеиновый, а не сывороточный белок.

Главное — анаболизм!

По сути дела, все проблемы питания в бодибилдинге упираются в «раскрутку» анаболизма. Наша задача — любой ценой поддерживать организм в анаболическом состоянии. Ясно как день, что одного-единственного универсального белка, отвечающего нашей задаче, не существует. Как мы только что выяснили, каждая схема белкового питания хороша для какого-нибудь одного конкретного случая. Однако кроме основной, «анаболической» функции белки выполняют и другую роль. Например, сывороточный белок содержит (правда, в минимальных количествах) различные пептиды (вещества, также относящиеся к классу белковых соединений). Это альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин, иммунно-глобулины и лактоферрин. У каждого из этих пептидов в организме своя, полезнейшая, задача, Например, лактоферрин осуществляет антиокислительное и противомикробное действие.

Как показали опыты с животными, сывороточный белок способствует укреплению иммунитета. Он также повышает уровень глютатиона — а это один из самых главных антиоксидантов в организме человека. Экспериментально доказано, что добавление сывороточного протеина в диету людей, уже потребляющих достаточно белка, обязательно приводит к росту мышечной массы тела.

Соевый белок также имеет дополнительные преимущества. Соя оказывает антираковое действие и, по мнению ученых, может также способствовать мышечному росту. Например, эксперименты на животных показали, что содержащиеся в соевом белке изофлавоны оказывают ощутимый анаболический эффект.

Итак, подведем итоги. Выбор конкретного белка зависит от разных факторов. Казеин рекомендуется тем, кто ест урывками. Если можете позволить себе есть часто, выбирайте сывороточный белок. И не забывайте о других белках: их разнообразие позволит вам полностью удовлетворить «анаболические» потребности мышц. Кроме того белки, каждый по отдельности и все вместе, укрепят ваше здоровье.

Автор: Хосе Антонио

Спасибо за предоставленный материал Юрию Плеханову (Пресс Аташе Российской гребли).

какой лучше, виды и как выбрать для роста мышц

Вы можете годами ходить в тренажерный зал, но у вас не получится нарастить мышечную массу без правильной диеты.

По словам экспертов, в деле наращивания мышц от питания зависит 60-70% успеха и только 30-40% – от тренировок. О степени важности этих составляющих можно спорить, но ни без того, ни без другого в любом случае не обойтись.

Добавки, при правильном использовании, могут сыграть огромную роль в наращивании мышечной массы.

Сывороточный протеин является одной из самых известных и широко используемых добавок как среди профессиональных бодибилдеров, так и среди простых атлетов-любителей. На самом деле, большинство продуктов на рынке спортивного питания абсолютно бесполезны для наращивания мышечной массы и силы. Их красочные этикетки и громкие рекламные лозунги призваны лишь заставить доверчивого покупателя потратить деньги.

Однако существует одна добавка, которая действительно помогает нарастить мышечную массу, и поэтому должна стать частью вашего рациона. Речь идет, конечно, про сывороточный протеин, что это такое, как его принимать мы поговорим ниже.

Большинство из вас, наверняка, знает, что белок служит «строительным материалом» для мышц. Последние состоят из мелких волокон, которые во время тренировок разрушаются, а чтобы им восстановиться, стать больше и сильнее, как раз и нужен белок, причем в огромном количестве.

Получить достаточную порцию белка, делая 6-8 приемов качественной твердой пищи в день, не всегда просто. Вот здесь и приходит на выручку сывороточный протеин со своей высокой биодоступностью, аминокислотами с разветвленными цепями и анаболическими свойствами. Это очень удобный способ удовлетворить ежедневные потребности в белке.

Важно понять, что каждый вид протеина отличается по качеству и степени усвоения. Сегодня мы подготовили для вас полное руководство по выбору лучших сывороток, которые помогут достичь заметных успехов в наращивании мышечной массы.

Протеин в чистом виде

Специалисты знают, что в чистом виде протеин не особо вкусный, поэтому его ароматизируют разными вкусовыми добавками, например шоколадными или клубничными. При выборе протеина нужно обязательно читать состав, так как иногда в него могут добавить сахар, что снижает полезность продукта как такового. Его целевая аудитория — это бодибилдеры, культуристы, желающие похудеть или набрать мышечную массу. При приеме протеина на порядок можно увеличить количество ежедневно употребляемого белка. С осторожностью следует употреблять данную добавку тем, у кого не усваивается лактоза.

Сывороточный протеин: как принимать

Несколько необходимых правил:

Протеин — еще не решение проблемы

Всегда нужно держать в голове, что протеин является всего лишь добавкой, и его необходимо добавлять в пищу. Поэтому для того, чтобы все действовало именно так, как вам этого хочется, нужно соблюдать спортивную диету, которая содержит достаточное количество калорий и питательных веществ.

Протеин + сок = любовь

Если нужен быстрый набор мышечной массы, добавляйте протеин в сок, а не в воду, и получится почти что гейнер, только гораздо дешевле. Дело в том, что сок является источником простых углеводов.

Спокойствие и ожидание

Ни один вид сывороточного протеина не даст вам результатов на следующий день после первого приема. Это происходит лишь спустя 3-4 недели систематического употребления.

Пейте его до тренировки

После — тоже, еще больше. Но перед тренировкой протеин дает мышцам лишний заряд энергичности, что делает их более эффективными.

Виды белков и их эффективность

О Whey Protein отзывы потребителей только положительные.

Белки — это основа тела человека. Их них состоят ткани и органы, такие как кожа, сухожилия, мышцы и т. д.

Основных видов белка три, и различаются они по методу обработки:

  1. Концентрат содержит до 80 % сывороточного белка и неплохой состав аминокислот. Он быстро усваивается в организме.
  2. Изолят содержит от 90 % белков. В нем меньше жира и лактозы, а также полезных веществ по сравнению с концентратом.
  3. Гидролизат – самый хорошо очищенный вид белка, быстро всасывается и сильно увеличивает инсулиновый вброс.

Концентрат самый дешевый и самый вкусный из-за большого содержания лактозы. Однако его нельзя употреблять людям с плохой переносимостью данного вещества.

Преимущества сывороточного протеина

  • Сывороточный протеин – богатый источник белка и ВСАА (аминокислоты с разветвленной цепью), необходимых для роста и восстановления мышц. Особую роль в этом процессе играет содержащийся в нем лейцин.
  • Это удобный способ включить в рацион больше белка, без необходимости потреблять большое количество твердой пищи.
  • Благодаря своей чистоте, сывороточный протеин быстро усваивается, что делает его идеальным для употребления после тренировки.
  • Потребление протеина улучшает общее состояние здоровья и метаболизм.
  • Протеиновые коктейли бывают различных вкусов, что позволяет с их помощью разнообразить рацион, если вы сидите на строгой диете.
  • Сывороточный протеин сделает ваш любимый молочный коктейль дешевле и вкуснее.
  • Сыворотка быстро растворяется в воде и молоке, поэтому коктейль легко приготовить как после тренировки, так и в любое другое время дня.
  • Если вы испытываете нехватку времени по утрам, протеиновый коктейль позволит быстро приготовить богатый белком завтрак

Польза протеина


Этот продукт воздействует на мышцы следующим образом:

  1. Благодаря белкам и аминокислотам, в нем содержащимся, наращивается мышечная масса.
  2. Протеин обеспечивает вброс инсулина, что повышает метаболизм.
  3. Лейцин способствует синтезу белка на генетическом, молекулярном уровне.
  4. Сывороточный белок быстрее усваивается организмом, если сравнивать с другими видами белков. Максимальный эффект при употреблении Whey Protein, по отзывам респондентов, достигается, если пить его до или непосредственно после тренировки.

Следует принять во внимание тот факт, что если в вашем питании много белковой пищи, то эффект от приема протеиновых добавок будет минимальным. Во многом эффективность употребления протеина зависит от индивидуальных особенностей организма.

Белок также помогает в борьбе с лишним весом, благодаря активизации метаболизма.

Польза сывороточного протеина

Сывороточный протеин является белком, полученным в результате побочного продукта при изготовлении сыров. Оказывает колоссальную помощь тем, кто стремится увеличить объемы, или, напротив, тем, кто хочет сбросить вес.

Как следует из названия, сывороточный протеин производится из сыворотки, представляющая собой жидкость, которая остается после производства сыра. Производство сывороточного протеина можно разделить на два этапа. На первом этапе жиры и углеводы отделяются от протеина. На втором этапе белок отделяется от воды для получения сухого вещества. Иногда к белку добавляют ароматизаторы.

Такой эффект обусловлен тем, что продукт обладает всеми необходимыми глобулярными белками. Получаемый путем переработки молочной сыворотки, сывороточный протеин содержит в себе молочный сахар, различные полезные микроэлементы, и белок самой сыворотки. Спустя несколько этапов переработки, а именно снятия жира, сушки остатков продукта, а также пропуск высушенного вещества через несколько фильтров, мы получаем этот продукт. Самым последним этапом является добавление различных ароматизаторов для того, чтобы продукт имел различные вкусовые оттенки. Готовый протеин бывает 3 видов, каждый из которых отличается степенью своей очистки.

Эффекты от приема сывороточного протеина

Эффект от регулярного употребления сывороточного протеина – более быстрое наращивание мышечной массы. Этим свойством белок обязан наличию трех аминокислот – лейцина, валина и изолейцина (около 26% в составе).

Благодаря им мышцы не только строятся быстрее, но и быстрее протекают процессы регенерации.

Еще один положительный эффект от приема добавок – подавление процесса катаболизма. Вы должны знать, что во время интенсивных тренировок, а также после их завершения, ваше тело имеет тенденцию черпать энергию из мышц, что приводит к их сжиганию. Таким образом, использование сывороточного протеина делает ваши упражнения очень эффективными. Следует отметить, что сывороточный протеин часто является лучшим выбором, чем протеин пищевого происхождения, поскольку он усваивается быстрее и лучше.

Большим преимуществом сывороточного протеина является то, что он снижает уровень плохого холестерина и дополнительно снижает кровяное давление. Таким образом, его регулярное употребление может снизить вероятность сердечно-сосудистых заболеваний.

Кроме того, людям с диабетом следует принимать сывороточный протеин, поскольку он обладает способностью стабилизировать уровень сахара в крови. Особенно рекомендуется принимать его перед едой, гликемический индекс которой будет очень высоким

Интересно, что сывороточный протеин может быть полезен людям, страдающим астмой. В настоящее время считается, что белок может улучшить иммунный ответ организма. Потребление сывороточного протеина прописывается даже при таком тяжелом заболевании, как ВИЧ-инфекция. В этих случаях он помогает остановить быстрое похудение.

Виды сывороточного протеина

Концентрат – в малых количествах содержит жиры и холестерин. Имеет более молочный вкус, чем остальные виды. Не подходит каждому потребителю ввиду содержания высокого уровня лактозы.

Изолят белка используется атлетами в так называемый период сушки. Содержит большое количество активных веществ (90%). Имеет низкий уровень лактозы. Также можно принимать с аминокислотами.

Гидролизат имеет горьковатый привкус, что показывает максимальную степень очистки, в отличии от собратьев. Ввиду высокой усваиваемости порой может вызвать скачок инсулина. Не вызывает каких-либо аллергических реакций. Не рекомендуется употреблять, если ваша цель похудение.

Стоит перечислить все полезные свойства, которыми обладает протеин: прямое влияние на набор мышечной массы, успех при диетах, эффект восстановления.

Сывороточный протеин можно смешивать практически с чем угодно. Но следует принять во внимание, что каждый вид имеет различную скорость усвоения, и, ввиду содержания лактозы, некоторым лицам лучше воздержаться от этой добавки. Однако гидролизата эти ограничения не касаются.

Он полезен для тех, кто хочет увеличить свои силы и улучшить спортивные результаты. Однако научные данные об эффективности сывороточного протеина в наращивании мышечной массы неоднозначны. Этот тип белка применяется и как пищевая добавка, чтобы помочь предотвратить нездоровую потерю веса у людей с ВИЧ, иногда его можно использовать для предотвращения аллергии у очень маленьких детей. Научные данные об эффективности сывороточного белка различны.

Побочные действия и режим приема

Сколько в деть требуется принимать Whey Protein? В отзывах ресспонденты называют нормы — до пятидесяти граммов чистого протеина, это около двух столовых ложек. Бытует ошибочное мнение, будто белок становится причиной болезни почек и остеопороза. Однако в отношении остеопороза белки оказывают скорее противоположный эффект, при этом не влияя на состояние почек. Известно, что лишь чрезмерное употребление протеина вызывает побочные реакции. Так, может возникнуть диарея, спазмы, метеоризм и боли. Встречаются также аллергические реакции на сывороточный белок. В последнем случае стоит перейти на другие виды белка, безопасные для вашего организма.

Почему он может плохо усваиваться?

Плохое усвоение организмом протеина может быть по причине некачественных добавок. Некоторые производители добавляют в продукт разные химикаты, усилители вкуса и консерванты. Поэтому следует выбирать проверенные марки, не ориентируясь только на цену, но и интересуясь составом, популярностью компании-производителя. Касательно протеина Whey Protein отзывы это подтверждают.

Рейтинг

Подчас сложно оценить качество протеиновой пищевой добавки. Получение сывороточного белка происходит путем ряда химических реакций. От этого зависит то, насколько быстро будет усваиваться белок, а также его переносимость организмом. Поэтому, прежде чем определиться с выбором протеина, стоит поинтересоваться рейтингами различных марок. При их составлении учитываются следующие факторы:

  1. Мнения популярных и неоспоримо авторитетных изданий, связанных со спортом.
  2. Сравнительный анализ цен и качества.
  3. Отзывы о Ultrafiltration Whey Protein спортсменов.

Опираясь на вышеназванные факторы, стоит выделить следующие марки протеинов:

  1. ON 100% Casein Gold Standard. Казеин высокого качества, глубокой степени очистки. Содержит в порции дневную норму кальция, половину нормы белка, глютамин и аминокислоты при минимальном содержании углеводов и жиров. Представлен в пяти вкусовых вариациях, что отличает его от других производителей казеина. Недостаток данного вида протеина – очень высокая цена при не самой большой концентрации белка.
  2. UN Prostar 100% Casein Protein. Этот продукт выбирают профессиональные спортсмены. Он хорошо подходит для наращивания мышц, оптимален по содержанию углеводов и жиров. Использовать рекомендуется на ночь, так как казеин в нем мицеллярный, поэтому расщепляется до состояния аминокислот довольно долго. Из достоинств стоит отметить большое количество порций на одну банку протеина – 72 при относительно низкой цене. Недостатков у этого вида протеина фактически нет.
  3. Musclepharm Combat 100% Casein. Усваивается до семи часов, так как в составе — мицеллярный казеин. Производители добавили в состав ферменты, которые помогают аминокислотам попадать в кровь. Белка содержится 28 грамм на порцию, а вот глютен отсутствует во избежание непереносимости. Это лучший казеиновый протеин, помогающий набирать мышечную массу. Из недостатков — довольно высокая цена при маленьком содержании порций в одной банке.
  4. Dimension Nutrition Hydro Matrix. Бюджетный вариант гидролизата для тех, кто только начинает заниматься спортом. Низкое содержание углеводов и жиров, усваивается максимум за четыре часа, лучше всего употреблять между основными приемами пищи. Результат приема при условии активных тренировок будет заметен примерно через месяц. Цена относительно низкая и доступная. Существенным недостатком является присутствие в составе обработанного щелочью какао.
  5. Real Pharm Real Hydro 100. Гидролизат родом из Польши, обладает ускоренной абсорбцией, благодаря чему и стал популярен. При его употреблении мышцы постоянно подпитываются, что ускоряет их восстановление. Из преимуществ – вкусовое разнообразие (семь видов). Цена соответствует качеству и не является высокой. Недостаток — наличие консервантов.

  6. ON Platinum Hydro Whey. Данный гидролизат один из самых популярных среди профессиональных спортсменов. Питание мышц начинается через полчаса после его приема. Аминокислоты BCAA, содержащиеся в нем, увеличивают силовую и анаэробную выносливость. Цена высокая, но вполне оправданная и справедливая для такого уровня качества. Недостатков у данного вида добавки обнаружено не было.
  7. Ultimate Nutrition ISO Sensation 93. Представляет собой комплекс добавок, в нем есть не только белок, но и дополнительные элементы. Изолят производится при очень низких температурах путем инфильтрации. При таком виде производства сохраняется максимум питательных веществ. Одна порция содержит до тридцати граммов белка. Стоимость высока, но обусловлена высочайшим качеством данной продукции. Недостаток один: на начальном этапе может вызывать дискомфорт в пищеварительной системе.
  8. Syntrax Nectar. Очень качественно очищенный от посторонних примесей изолят. В нем практически нет углеводов и жиров. Имеет очень много положительных отзывов спортсменов-любителей. При употреблении данной добавки наблюдается довольно быстрый прирост мышечной массы. Цена высока, но ее оправдывает высокое качество и эффективность.
  9. Optimum Nutrition 100% Whey Gold Standard. Высокая степень усвояемости благодаря лактозе и аминогену, входящим в состав. Употреблять нужно между основными приемами пищи в качестве перекуса. Вкусы этой добавки разнообразны, что привлекает потребителей.
  10. Pure Protein от Whey Protein. По отзывам, это средний сывороточный протеин. Был выпущен в качестве очень бюджетного варианта. Содержание углеводов и жиров в нем высокое, а белка на порцию всего 21 грамм, что очень мало по сравнению с другими видами подобной продукции. При употреблении можно столкнуться с появлением проблем в пищеварительной системе.

Узнайте о пользе сывороточного белка для здоровья.

Восстановление мышечных волокон

Сывороточный белок наиболее известен как диетическая добавка, используемая спортсменами, бодибилдерами и всеми, кто хочет нарастить мышечную силу. Большинство проведенных исследований показали, что сывороточный белок может быть эффективен в улучшении спортивных результатов, если он используется правильно. Одним из заблуждений является идея, что сывороточный протеин будет автоматически наращивать мышечную массу без работы человека.

Если вы пьете протеиновый коктейль и сидите без движения, вы не увидите большого эффекта. Белок должен работать в сочетании с силовыми тренировками. Исследования показывают, что людям, сочетающим добавки и коктейли из сывороточного протеина с силовыми тренировками, это вещество помогает увеличить размер мышц, силу, общую мышечную массу тела и улучшить спортивные результаты. Добавки с сывороточным белком, по-видимому, улучшают восстановление после физической нагрузки и бега, они могут быть полезны для тех, кто только начинает заниматься. Исследования показывают, что сывороточный белок так же эффективен, как и белок из говядины, курицы или сои.

Способствует потере веса

Еще одним эффектом использования сывороточного протеина может стать более быстрая потеря ненужных килограммов. Вероятно, это связано с тем, что потребление белка значительно снижает аппетит (влияет на лептин и грелин, то есть гормоны, отвечающие за регулирование аппетита), что, очевидно, приводит к потере веса. Тем не менее, люди должны учитывать тот факт, что большое количество белка также содержится в повседневных пищевых продуктах. Введение в меню сывороточного протеина должно сопровождаться сокращением потребления других продуктов, богатых белком. Конечно, наилучших результатов можно достичь, сочетая прием сывороточного протеина с упражнениями.

Важно понимать что прием сывороточного белка сам по себе не поможет похудеть. Вещество не влияет на метаболизм или голод. Но у вас будет более здоровое соотношение мышц к жиру, которое поможет чувствовать себя более комфортно. Существуют научные данные, указывающие на то, что сывороточный белок можно использовать для снижения веса у пациентов со СПИДом и ВИЧ. У пациентов с ВИЧ, испытывающих истощение мышц, чаще возникают проблемы со здоровьем. Сывороточный протеин в сочетании с силовыми тренировками помогает восстановить мышечную массу.

Помогает понизить артериальное давление

Небольшое количество научных исследований указывает на то, что сывороточный белок снижает артериальное давление. Тем не менее, необходимы дополнительные анализы. В настоящее время проводится много исследований по этому вопросу. Если вы принимаете белок молочной сыворотки для снижения артериального давления, он всегда должен быть дополнением к назначенным врачом лекарствам. Вы должны сообщить врачу, если хотите начать употреблять протеин или растительные добавки.

Небольшое исследование с предварительными данными было опубликовано в 2021 году. В нем приняли участие 42 добровольца, у которых было незначительно повышено артериальное давление. Каждый участник выпивал два протеиновых коктейля в день. Для тех, кто пил 56 граммов молочной сыворотки в день, средние значения систолического артериального давления снизились примерно на 3 пункта, а диастолического — на 2 пункта.

Способствует восстановлению после упражнений

Одним из многих преимуществ белка молочной сыворотки является то, что он способствует восстановлению после тренировок. После выполнения вами некоторых упражнений, мышцы будут нуждаться в небольшом перерыве. Вот почему многие профессионалы рекомендуют выполнять упражнения медленно, не нанося вред мышцам. Спортсмены также рекомендуют чередовать нагрузку на разные группы мышц в разные дни, так как ежедневное постоянное напряжение одних и тех же мышц может привести к проблемам.

Сывороточный белок помогает уменьшить количество времени, которое люди должны потратить на восстановление. Белок помогает мышцам питаться и создавать новую массу. Без белка мышцам приходится иметь дело с огромной нагрузкой. Одним из преимуществ сывороточного белка является то, что организм переваривает его быстрее, чем любой другой белок, что означает более быстрое восстановление мышц. Эксперты рекомендуют употреблять сывороточные протеиновые коктейли или добавки в течение тридцати минут после тренировки. Это помогает организму стимулировать синтез мышечных белков. Мышечная боль после тренировки будет слабее.

Снижает уровень сахара в крови

Сывороточный протеин помогает контролировать уровень сахара в крови, хотя его не следует использовать в качестве замены любым лекарствам, назначенных врачом. Если вы намерены использовать сывороточные добавки в дополнение к своему обычному лечению, сообщите об этом врачу. Были проведены некоторые научные исследования, показывающие, что сыворотка помогает предотвратить повышение уровня сахара в крови после того как люди употребляли пищу с высоким содержанием углеводов, особенно если у них был диабет.

Участники исследования ели пищу с высоким содержанием углеводов вместе с сывороткой. По сравнению с теми, кто потреблял большое количество углеводов без сывороточных добавок, их сахар в крови не колебался так резко. Ученые полагают, что сыворотка может стимулировать выработку инсулина в организме.

Правила приема сывороточного протеина

Рекомендуется в первую очередь людям, которые хотят быстро нарастить мышечную массу, а также ускорить регенерацию мышц после тренировки. В отличие от других пищевых добавок для спортсменов, сывороточный протеин безопасен для большинства людей.

Правила приема весьма просты. Если цель сделать рельеф, то лучше всего употреблять в первой половине дня. Не рекомендуется употреблять больше двух порций в день.

Если же цель набрать массу, то конкретного времени приема нет, только следует считать белок, получаемый из непосредственного рациона питания.

Если у вас непереносимость сывороточного протеина, его употребление может вызвать проблемы с ЖКТ, диарею и даже рвоту с тошнотой. Поэтому строго отталкивайтесь от самочувствия и откажитесь в случае возникновения данных расстройств.

Когда пить протеин: до или после тренировки?

Протеин необходимо пить и до, и после тренировки, на самом деле все зависит от целей приема и вида протеина. Их существует два: медленного и быстрого действия. Отличаются они, прежде всего, временем усваивания. К протеинам медленного действия относят казеин, а к протеинам быстрого действия сывороточный белок. Оба продукта создаются на основе молочных продуктов и являются полностью натуральными. Для спортсмена важно употреблять и казеин, и сывороточный протеин. В тендеме они позволят правильно и полностью насытить организм белком. Первый вид усваивается до 12 часов, а второй начинает действовать уже спустя считанные минуты после приема.

Именно поэтому казеин нужно принимать с утра, до тренировки и на ночь. Это обеспечит мышцы необходимой для занятия энергией, повысит ее интенсивность. Кроме того, это питательное вещество известно положительным влиянием на нервную систему. Снимется умственная усталость, а значит, тренировка пройдет с максимальной эффективностью.

Принимая казеин на ночь, можно приостановить процесс катаболизма. Если нет возможности употребить этот вид протеина с утра или ночью, можно принимать его по вечерам или после физических нагрузок. Но не сразу и в таком случае нужно обязательно комбинировать его с быстрым белком.

Во время интенсивной тренировки запасы белка в организме резко сокращаются и если их сразу не пополнить, начнется процесс разрушения тканей. Чтобы способствовать их восстановлению принимают сывороточный протеин (или другие быстрые белки), который действует практически мгновенно. Если вовремя насытить мышцы протеином – это способствует их быстрому росту и сохранению всех результатов, достигнутых на занятии. Именно поэтому так важно принимать данный вид протеина сразу после тренировки.

Scitec Nutrition 100 % Whey Protein: отзывы

Эта добавка родом из Венгрии. Она одна из лучших в своей группе, что вполне заслуженно. Эта добавка проходит три стадии проверки качества. Уровень белка в ней составляет 22 грамма на порцию, что далеко от идеала, но этого достаточно для стабильного прироста мышечной массы.

Рассмотрим Ultimate Nutrition Prostar Whey Protein. По отзывам, это универсальный продукт, в котором есть элементы как концентрата, так и изолята. Он подходит не только начинающим спортсменам, но и профессионалам, быстро и без комков растворяется в воде, легко пьется. В его составе присутствуют пептиды, которые помогают тканям быстрее всасывать аминокислоты. Благодаря этому, даже при малой интенсивности тренировок мышечная масса будет прибавляться.

Что такое сывороточный протеин


Вы когда-нибудь обращали внимание на прозрачную жидкость, которая образуется на поверхности творога, если его хранить вне холодильника? Это и есть сыворотка. Она является побочным продуктом, образующимся после свертывания молока. Доля белка в сывороточном протеине может варьироваться от 20% до 90% процентов и зависит от конкретного продукта.
Типы сывороточного протеина классифицируются в зависимости от процесса фильтрации. Чем выше уровень фильтрации, тем чище сыворотка и тем больше в ней белка. Соответственно, это сказывается и на цене продукта.

Impact Whey Protein

Impact Whey Protein, отзывы о котором также весьма благоприятные, — это отличная находка для тех, кто занимается спортом, стремится иметь подтянутые, рельефные формы. Главным преимуществом такого продукта является то, что он подходит как для мужчин, так и для женщин.

В составе главный компонент – концентрат сывороточного белка высокого качества.

Мы рассмотрели различные виды протеиновых добавок. У каждой есть свои плюсы и минусы. Подбирая для себя подобный продукт, нужно определиться со своими приоритетами. Для одних людей важна цена, для других — скорость набора мышечной массы, для третьих — влияние добавок на здоровье. Важно также помнить, что только с помощью поедания протеина красивых форм добиться сложно. Для этого требуется прилагать усилия, заниматься спортом, выполнять физичекие нагрузки.

Сывороточный протеин: какой лучше?

Существует три самых популярных вида сывороточного протеина, и главное их различие в том, как они произведены.

@bodyaction.oficial

1. Концентрат:

около 70–80% белка; содержит немного лактозы (молочный сахар) и жира, и имеет лучший вкус.

2. Изолят:

90% белка или выше; содержит меньше лактозы и жира и не содержит такого количества полезных питательных веществ, содержащихся в концентрате сывороточного белка.

3. Гидролизат:

также известный как гидролизованная сыворотка, этот тип был предварительно переварен, чтобы быстрее усваиваться. Это вызывает увеличение уровня инсулина на 28–43% по сравнению с изолятом (11).

Концентрат сывороточного белка кажется лучшим вариантом.

Что лучше: изолят или концентрат сывороточного протеина?

Так однозначно ответить нельзя, разница в том, есть ли у вас непереносимость или ее нет.

Концентрат

— это самый дешевый вариант и при этом он сохраняет большинство полезных питательных веществ, которые содержатся в сыворотке. Многие люди также предпочитают этот вкус, вероятно, из-за лактозы и жира.

Если у вас есть проблемы с переносимостью концентрата (а также непереносимость лактозы или лактазная недостаточность) или вы пытаетесь выделить белок, сохраняя при этом низкое содержание углеводов и жиров, лучшим вариантом будет изолят сывороточного белка

или даже
гидролизат
.

Имейте в виду, что, хотя концентрат является наиболее популярной формой, в большинстве исследований изучался именно изолят сывороточного белка.

Лактомин 80 протеин со ВКУСОМ

     Концентрат сывороточного белка Лактомин 80 (Lactomine 80) представляет собой сухой сывороточный концентрат с содержанием в нем белка 78-82%, произведенный немецкой компанией Lactoprot. 
     Компания Lactoprot производит КСБ Лактомин 80 из сладкой или соленой сыворотки, используя в технологии микрофильтрацию и сушку. В итоге получается качественный концентрат сывороточного протеина, который в настоящее время нашел широкое применение в пищевой промышленности, в производстве детского питания, а также часто используется как основа для создания брендового спортивного питания.  Лактомин смешивают с дополнительными ингредиентами (ароматизаторами, вкусовыми добавками, загустителями, разрыхлителями, пеногасителями) для улучшения вкусовых качеств продукции, что приводит к удорожанию брендового продукта.
     Концентрат сывороточного белка Лактомин 80 без добавок — это выбор тех спортсменов, которые не желают переплачивать за красивую упаковку и различные химические примеси, так как они приобретают именно натуральную основу протеина. 
     Lactomine 80 имеет богатый основной аминокислотный состав, а также содержит полезные минералы, такие как кальций, калий, натрий, магний.  Лактомин является «быстрым» легко усваиваемым протеином, поэтому он нашел широкое применение у атлетов, занимающихся силовыми видами спорта, которые используют его для быстрого усвоения белка и поступления важных аминокислот в кровь.
     Протеин Лактомин 80, как и другие концентраты сывороточных белков,  ускоряет обмен веществ, поэтому используется для набора мышечной массы и при похудении, сушке тела.
     Лактомин 80 обладает еще рядом полезных свойств, влияющих на организм человека: общеукрепляющее действие на организм в целом, предотвращение разрушения мышечной ткани, её рост и восстановление после микротравм, снижение уровня плохого холестерина в крови, нормализация гормонального фона. Лактомин полезен всем, кто следит за своим здоровьем.
     Сухой сывороточный концентрат хорошо растворяется в воде имеет приятный слегка молочный (сливочный) вкус.
     Состав на 100 грамм сухой смеси: Белок (Protein) – 78-82 гр. в зависимости от партии), Жиры – 10 гр Углеводы (лактоза) – 6 гр. Минералы (зола) – 2 гр., Влага-2% Калорийность: 395 Ккал.
     Способ применения: 
     Стандартный прием сывороточного концентрата: 30 грамм протеина (2 столовые ложки с горкой) растворить в 300 мл воды, сока или молока. Употреблять следует в среднем 3-5 раз в день. Потребность в белке у спортсменов, имеющих силовые тренировки, составляет 2 грамма на 1 кг. массы тела регулярно. Примерный способ приема:

1) В дни тренировок за 30 минут до завтрака выпить 1 мерную ложку, разведенную в 250-30 мл. воды или 2 мерные ложки на 500 мл. воды. После тренировки через 30-60 минут выпить две мерные ложки на шейкер 500 мл воды.

2) В дни отдыха усиленный прием белка. Утром завтрак (не тяжелый), через 40-60 мин выпить две,три мерные ложки протеина на шейкер 500-700 мл воды. За час до обеда выпить две мерные ложки протеина на 500 мл воды. Через 1,5 часа после ужина выпиваете две мерных ложки белка на шейкер 500 мл.

     Не рекомендуем принимать большое количество белка при болезни или каких-либо отклонениях в работе почек.

     В нашем интернет-магазине Вы можете купить концентрат сывороточного белка Лактомин 80, а также другое спортивное питание оптом и на развес, оформив заказ через сайт, электронную почту и по телефону. В Москве заказ можно забрать после готовности в пункте самовывоза. Действует доставка по всем регионам России. По Москве курьер доставит заказ день в день в любое удобное для Вас время. Более подробную информацию смотрите в разделе «Доставка и оплата».

 

 

Протеин BioTech USA Iso Whey Zero — калорийность, полезные свойства, польза и вред, описание

Калории, ккал: 

362

Углеводы, г: 

2.9

Спортивное питание становится всё более качественным и безопасным для здоровья. Протеин Iso Whey Zero, по утверждению производителя BioTech USA, производится без использования трансжиров и сахара. Продукт содержит изолят сывороточного протеина, одна порция состоит из 22 г чистого протеина (calorizator). Протеин Iso Whey Zero выпускается в пластиковых банках или пакетах весом 980 г и 2,27 кг, имеется на выбор различные вкусы: шоколад, лимон, банан, ананас-манго, кокос, печенье-крем. Вместе с упаковкой сухого порошка продаётся мерная ложка для удобства приготовления напитка. Протеин Iso Whey Zero от BioTech USA идеально подходит для наращивания сухой мышечной массы, так как практически не содержит жиров.

Калорийность протеина BioTech USA Iso Whey Zero

Калорийность протеина Iso Whey Zero BioTech USA составляет 362 ккал на 100 грамм продукта.

Состав и полезные свойства протеина BioTech USA Iso Whey Zero

В составе продукта: изолят сывороточного протеина, гидролизат изолята сывороточного протеина, кросс-флоу ультра фильтрованный концентрат сывороточного протеина, ВСАА, лимонная кислота, ароматизаторы, загустители (E466, E415), подсластители (E951, E955), стабилизатор (E340), молочный белок, агент против слипания (E551), эмульгатор (Е471), красители (Е122, E110, E160a). Из положительных качеств продукта стоит отметить его лёгкую усвояемость, способность повышать иммунитет и активно наращивать мышечную массу. Протеин Iso Whey Zero BioTech USA не оказывает негативного влияние на деятельность желудочно-кишечного тракта.

Вред протеина Iso Whey Zero от BioTech USA

Протеин Iso Whey Zero может спровоцировать возникновение аллергических реакций, не следует употреблять продукт подросткам, не достигшим 18-ти лет.

Способ применения протеина BioTech USA Iso Whey Zero

Для приготовления порции белкового коктейля необходимо содержимое одной мерной ложки (25 г) сухого порошка тщательно размешать в стакане воды или обезжиренного молока. В день рекомендуется выпивать не более трёх порций коктейля, до и после тренировки и в течение дня, вместе с приёмом пищи.

Протеин. Исчерпывающее руководство. — статья avitasport.ru

Статьи >

Поделиться

Поделиться

Твитнуть

Класснуть

КАКУЮ ПОЛЬЗУ ИМЕЕТ ПРОТЕИН В ОРГАНИЗМЕ

Белок является важным питательным веществом и основным компонентом здорового питания. Он обеспечивает аминокислотами для многочисленных физиологических функций, включая построение и сохранение мышц, а также предотвращение потери мышц. Адекватное потребление белка может быть полезно для различных видов спортсменов и людей, ведущих активный образ жизни. Для бодибилдеров, или культуристов, адекватное потребление протеина является краеугольным камнем их диеты, и одним из главных инструментов для наращивания мышц и сухого телосложения. Для спортсменов, занимающихся видами спорта на выносливость, также может быть полезна диета, включающая оптимальное количество белков. Восстановление – это центральный элемент для спортсменов, занимающихся видами спорта на выносливость, и адекватное потребление протеина может помочь этому процессу. Спортсмены командных видов спорта, которые часто сочетают выполнение упражнений на выносливость и силу, также могут получить пользу от оптимального потребления белков по этим же причинам. Взрослое население, которое главным образом состоит из быстро увеличивающегося поколения людей, родившихся во время бума рождаемости, может столкнуться с уникальными проблемами, включающими потерю мышц и снижение силы, как часть нормального процесса старения. Белок совместно с силовыми тренировками, в качестве элемента здоровой диеты и программы упражнений, может иметь большую пользу для этой возрастной группы, так как может помочь сохранить мышечную массу и силу.  

КРАТКИЙ ОБЗОР РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ПРОТЕИНОВ

Каждый из представленых типов протеина можно купить в разделе Протеин на нашем сайте.

СЫВОРОТОЧНЫЙ ПРОТЕИН (Whey)

Около 20% белка в молоке составляет сыворотка. Сывороточные белки быстро и легко усваиваются (отсюда название «быстро действующие», которое им дают), а также они содержат незаменимые аминокислоты (EAA), включая три аминокислоты с разветвленной цепью (BCAA) и другие микрофракции. Сывороточный белок быстро переваривается, и поэтому аминокислоты быстро попадают в мышцы и помогают начать процесс наращивания мышечной ткани.

КАЗЕИНОВЫЕ ПРОТЕИНЫ (Casein)

Около 80% белка в молоке – это казеин. Он часто упоминается, как «медленно действующий» белок, из-за более медленного переваривания и всасывания, чем другие белки, такие как сыворотка, поэтому казеиновые белки особенно полезны при приеме перед сном или между приемами пищи, потому что они обеспечивают мышцы аминокислотами в течение более длительного периода времени. После приема казеина он попадает в желудок, где смешивается с желудочной кислотой с образованием «сгустка», который требует больше времени для переваривания и выхода из желудка по сравнению с другими белками, которые не образуют сгустков. Сыворотка не проявляет этих свойств, и поэтому усваивается быстрее, чем казеин.

ЯИЧНЫЕ ПРОТЕИНЫ (Egg)

Яйцо является полноценным белком, что означает, что он содержит все незаменимые аминокислоты, необходимые вашему организму для синтеза белка. Кроме того, яичные протеины не содержат молочных продуктов, имеют высокую биодоступность и являются отличной альтернативой сывороточным, казеиновым и цельномолочным протеинам для людей с аллергией на молоко или с непереносимостью лактозы.

СОЕВЫЕ ПРОТЕИНЫ (Soy)

Соевый белок является единственным естественным источником полноценного белка не животного происхождения. Это означает, что он содержит все незаменимые аминокислоты и подходит для вегетарианцев/веганов. Соя может стать прекрасной альтернативой для вегетарианцев, желающих дополнить свой рацион белком.

ГОВЯЖЬИ ПРОТЕИНЫ (Beef)

Говяжий белок является полноценным белком, который обеспечивает ваш организм всеми незаменимыми аминокислотами. Добавка говяжьего протеина является дополнительной альтернативой приему белковых молочных продуктов в рамках вашего режима приема протеиновых добавок.

РАСТИТЕЛЬНЫЕ ПРОТЕИНЫ

Растительными источниками белка потенциально могут быть рис, горох, конопля, картофель, люцерна, чиа, лен и многое другое. Растительный белок представляет собой дополнительный альтернативный источник белка из безмолочных добавок, и может содержать дополнительные полезные компоненты, встречающиеся в растениях. 

ТИПЫ ПРОТЕИНОВ В ДОБАВКАХ

КСП (WPC) Whey Protein Concentrate
Концентрат сывороточного протеина КСП (WPC) – это концентрированный сывороточный продукт, который содержит 40-90% сывороточного белка.

ИСП (WPI) Whey Protein Isolate
Изолят сывороточного протеина ИСП (WPI) представляет собой концентрированный сывороточный протеин, который содержит более 90% сывороточного белка. Изолят протеина содержит меньше жиров, холестерина и углеводов, чем его концентрат, так что ИСП может быть хорошим вариантом для людей, которые следят за потреблением жиров и углеводов.

ГИСП (HWPI) Hydrolyzed Whey Protein Isolate
Гидролизованный изолят сывороточного протеина ГИСП (HWPI) – это изолят сывороточного протеина, дополнительно разбитого на более мелкие компоненты, называемые пептидами, которые легче перевариваются, что позволяет им быстро поступать в кровоток.

КМП (MPC) Milk Protein Concentrate
Концентрат молочного протеина КМП (MPC) – это концентрированный молочный продукт, который содержит 40-90% молочного белка.

ИМП (MPI) Milk Protein Isolate
Изолят молочного протеина ИМП (MPI) – это концентрированный молочный продукт, содержащий более 90% молочного белка.

Мицеллярный казеин Micellar Casein
Мицеллярный казеин является самой медленно перевариваемой формой казеина. Его отделяют от молока с помощью процесса ультрафильтрации. Одним из уникальных свойств мицеллярного казеина является его способность образовывать гель во время пищеварения, благодаря чему он может высвобождать постоянное количество аминокислот в течение нескольких часов.

ИЗОЛЯТЫ СЫВОРОТОЧНЫХ И МОЛОЧНЫХ ПРОТЕИНОВ ОБЫЧНО СОДЕРЖАТ МЕНЬШЕ УГЛЕВОДОВ И ЖИРОВ, ЧЕМ ИХ КОНЦЕНТРАТЫ. ОНИ БОЛЬШЕ ПОДХОДЯТ ДЛЯ ЛЮДЕЙ, КОТОРЫЕ СТРЕМЯТСЯ ПОЛУЧАТЬ БЕЛОК БЕЗ ЛИШНИХ ЖИРОВ И УГЛЕВОДОВ. ТАКЖЕ ФОРМА ИЗОЛЯТА МОЖЕТ БЫТЬ ПОЛЕЗНОЙ ДЛЯ ТЕХ, КТО СТРЕМИТСЯ УПОТРЕБЛЯТЬ МЕНЬШЕ ЛАКТОЗЫ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВРЕМЕНИ ПРИЕМА ПРОТЕИНА

КОГДА ДЕЛО КАСАЕТСЯ ПРОТЕИНОВ, важно не только то, ЧТО вы принимаете, но и КОГДА вы это принимаете. Хотя человеческий организм перерабатывает белок каждый раз, когда вы его употребляете, существуют определенные случаи, когда ваша система более восприимчива к протеину. Точнее говоря, в разное время вы должны принимать разные виды белков. Не пропустите эти пять важных случаев.

КОГДА Я ДОЛЖЕН ПРИНИМАТЬ МОЙ ПРОТЕИН?

ПЕРВЫМ ДЕЛОМ УТРОМ: период между тем, когда вы ложитесь спать и просыпаетесь утром, является самым длинным, когда ваше тело остается без еды. Нарушьте «пост» с помощью протеина. В дополнение к обеспечению самыми необходимыми аминокислотами для поддержания и восстановления мышц, протеины дают энергию. Прием первым делом с утра является оптимальным для быстродействующих протеинов, таких как сыворотка.

ПЕРЕД ТРЕНИРОВКОЙ: Выпивая протеиновый коктейль примерно за час до тренировки, вы подготовите ваш организм к росту с помощью ВСАА и других незаменимых аминокислот. Сывороточные и яичные протеины являются хорошим выбором, потому они просты в применении и легко перевариваются.

ПОСЛЕ ТРЕНИРОВКИ: Интервал 30-60 минут после тренировки является критическим временным окном для употребления белка. Ферменты и гормоны активно репарируют и восстанавливают повреждения, вызванные тренировками, а так же, восполняют запасы гликогена, поэтому ваши мышцы особенно восприимчивы к питательным веществам. Принимая послетренировочный восстановительный протеин, содержащий сыворотку, казеин, яйцо и простые углеводы во время этого «окна», вы можете быть уверены, что вы будете заряжены и готовы к следующей тренировке.

МЕЖДУ ПРИЕМАМИ ПИЩИ: Прием протеинового коктейля между приемами пищи не только помогает поддерживать синтез мышечных белков, но также может помочь с насыщением – поэтому, если контроль веса является частью ваших целей, выбирайте продукт, содержащий один или несколько из этих протеинов.

ПЕРЕД СНОМ: В течение ночи организм может длительно находится без какой-либо пищи или питья. Казеиновый протеин расщепляется более медленно, помогая питать ваши мышцы, пока вы спите. Подготовьте ваш организм к этому длительному периоду с помощью казеинового протеинового коктейля за полчаса перед сном. В отличие от сыворотки, которая быстро расщепляется в кишечнике, казеин усваивается гораздо медленнее, высвобождая входящие в его состав аминокислоты в течение нескольких часов в течение ночи, пока вы спите. По этой причине, казеин часто упоминается как белок с медленным высвобождением.

ТЕХНИЧЕСКАЯ ИНФОРМАЦИЯ

ПРОЦЕНТ ЧИСТОГО БЕЛКА – еще один способ сравнить протеины. Тогда как данные о пищевой ценности говорят вам сколько протеина содержится в каждой порции, то процент белка говорит вам о том, насколько ваш протеин чистый. Чтобы рассчитать, разделите количество граммов белка в одной порции на размер порции и умножьте на 100. Вот пример использования двух разных протеинов. Первый содержит 24 грамма белка и имеет размер порции равный 29,4 грамма; второй содержит 26 граммов протеина в порции размером 35 граммов. На первый взгляд, второй вариант содержит больше белка. Однако, используя вычисление чистого протеина, вы получите, что в действительности первый протеин имеет более хорошее значение, потому что он имеет более высокий уровень чистоты. Этот расчет лучше всего работает для протеинов с одним источником. Заменители питания, смеси и гейнеры могут включать витамины, минералы и другие ингредиенты, которые изменяют конечный результат.

Белок №1

24 г белка / 29,4 г размер порции х 100 = 81,6% чистого белка

Белок №2

26 г белка / 35 г размер порции х 100 = 74,3% чистого белка

ЛУЧШИЕ ПРАКТИКИ

Основным источником белка всегда должно быть сбалансированное и здоровое питание. Тем не менее, временами (особенно во время периодов интенсивных упражнений) может быть полезно использовать протеиновые добавки для того, чтобы помочь вам достичь целевого потребления белка. Обязательно обсудите любую программу упражнений и протеиновые добавки с вашим врачом или тренером.

Существует несколько способов разнообразить консистенцию и вкус вашего протеинового коктейля. Во-первых, вы можете использовать молоко вместо воды для более сильного и сливочного вкуса. Во-вторых, вы можете использовать больше или меньше молока/воды, чтобы изменить интенсивность вкуса вашего коктейля. Используйте меньше жидкости для более интенсивного вкуса и аромата, и больше жидкости для более мягкого вкуса и менее густой текстуры.

Есть и другие интересные пути, с помощью которых вы можете изменить способы применения вашего протеина. Казеин имеет тенденцию к более вязкой текстуре, которая позволяет ему хорошо замерзать, образуя мороженое, таким образом, вы можете улучшить вкус вашего казеинового коктейля, заморозив его и употребляя в виде мороженого.

ЧИТАЕМ ЛЕЙБЛ-ЭТИКЕТКУ

Вопрос: в чем разница между концентратами, изолятами и гидролизатами?

Ответ: эти термины обозначают тип и степень обработки, которой был подвержен определенный протеин. Из концентратов удалена большая часть воды, углеводов, лактозы, минералов и жиров, поэтому количество белка является гораздо более концентрированным, чем оно было до обработки. В белковых концентратах содержание  белка варьирует от 34% до 85%, но большинство авторитетных производителей используют не менее 80%. Изоляты в дальнейшем подвергаются очистке от небелковых материалов для получения уровня чистоты 90% или выше. Из-за дополнительных этапов, энергозатрат и потерь при обработке, белковые изоляты стоят дороже, чем белковые концентраты. Гидролизованные белки или белковые гидролизаты – это белки (они также называются предварительно переваренными), которые частично были расщеплены на более мелкие части, известные как пептиды, поэтому они быстрее попадают в кровоток. Гидролизаты, как правило, дороже изолятов и концентратов из-за дополнительных этапов обработки. В конечном счете, все эти типы протеинов очень питательны, и, в основном, обладают аналогичными достоинствами, но изоляты и гидролизаты более чистые и эффективные, чем концентраты.

  1. КОЛИЧЕСТВО ПОРЦИЙ В УПАКОВКЕ.

Обратите внимание на это количество. Некоторые бренды сокращают расходы за счет дешевых ингредиентов «наполнителей». Таким образом, приобретая 2, 5 или 10 фунтов (1, 2 или 5 кг) какой-либо смеси, вы получаете значительно меньше порций, чем у более авторитетного продукта. Еще лучше выяснить, сколько всего белка вы получите, умножив массу белка в порции на количество порций в упаковке. Например, 24 грамма белка в порции х 80 порций/упаковка = 1,920 грамма белка/упаковка. Так же, как и формула для расчета процентного содержания чистого белка, эта формула наилучшим образом работает для простых протеиновых порошков.

  1. КОЛИЧЕСТВО БЕЛКА В ПОРЦИИ.

Количество граммов белка в порции является, вероятно, самым важным аспектом для протеиновых порошков. Это кажется очевидным, но многие люди упускают этот аспект, предполагая, что либо все протеины примерно одинаковы, либо, что самые дорогие порошки содержат больше белка. Не делайте эту ошибку; проверьте данные о питательной ценности, чтобы убедиться, что вы платите за протеин, а не только за хитрый маркетинг.

  1. ПОРЯДОК ИНГРЕДИЕНТОВ.

По закону, ингредиенты в продуктах питания или пищевых добавках должны быть перечислены от наиболее к наименее встречаемым, или говоря технически: в порядке убывания их содержания. Значение этого становится ясным, как только вы начинаете ходить по магазинам. Если, например, два продукта имеют аналогичную цену, но в одном из них содержится больше дешевого белка (вы знаете это, поскольку в списке ингредиентов более дешевый белок указан перед более дорогим источником белка), вы знаете, что этот продукт имеет меньшую ценность. Кроме того, не позволяйте обманывать себя раскрученными определениями, которые некоторые компании используют для описания обычных ингредиентов. Хлорид натрия – это просто соль; белковый экстракт птичьего зародыша – яичные желтки; все качественные концентраты сывороточного протеина ультрафильтрованные и содержат микрофракции, такие как альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин, лактоферрин и гликомакропептиды, а не только те добавки, у которых это указано.

  1. ИЗГОТОВЛЕНО КОМПАНИЕЙ ИЛИ ИЗГОТОВЛЕНО ДЛЯ КОМПАНИИ?

Вопреки тому, что вы можете подумать, многие компании не разрабатывают, не производят и даже не распространяют свои собственные продукты; они либо наклеивают свои этикетки на общих формулах, либо имеют уникальные формулы, созданные сторонним заводом. Обычно это приводит к значительным затратам, которые в конечном итоге перекладываются на их клиентов. Фразы типа «изготовлено для», «распространяется» или «упаковано для», дают вам знать, что кто-то, кроме компании, продукт которой вы покупаете, изготавливал этот продукт. Настоящие производители делают инвестиции в технологическое оборудование и процедуры контроля качества, необходимые для постоянного производства лучших продуктов. Поэтому, по возможности, выбирайте продукты «изготовленные компанией».

ВЫБОР ПРОДУКТА ДЛЯ КАЖДОГО

Ситуация для приемаВсе целиНаиболее популярныйНаиболее продвинутыйДиетические ограничения
Первым делом с утра
Optimum Nutrition, Protein Energy 

Optimum Nutrition, Protein Energy 

Optimum Nutrition, Protein Energy 

Optimum-Nutrition, Naturally Flavored Oats & Whey
Перед тренировкой
Optimum Nutrition, Performance Whey

Optimum Nutrition, 100% Whey Gold Standard

Optimum Nutrition, Platinum Hydro Whey

Optimum Nutrition, 100% Whey Gold Standard Naturally Flavored
После тренировки
Optimum Nutrition, Isolate

Optimum Nutrition, 100% Whey Gold Standard

Optimum Nutrition, Platinum HydroBuilder или
Optimum Nutrition, Pro Complex 

Optimum Nutrition, 100% Whey Gold Standard Naturally Flavored
Набор/наращиваниемассы
Optimum Nutrition, Serious Mass

Optimum Nutrition, Serious Mass

Optimum Nutrition, Pro Gainer

Optimum Nutrition, 100% Whey Gold Standard Naturally Flavored
Между приемами пищи
Optimum Nutrition, Performance Whey

Optimum Nutrition, Gold Standard 100% Casein
Optimum Nutrition, Platinum HydroBuilder или
Optimum Nutrition, Pro Complex 

Optimum Nutrition, 100% Whey Gold Standard Naturally Flavored
Перед сном
Optimum Nutrition, Gold Standard 100% Casein

Optimum Nutrition, Gold Standard 100% Casein
 
Optimum-Nutrition, Platinum Tri-Celle Casein

Optimum Nutrition, Gold Standard 100% Casein Naturally Flavored
Советы по приему протеинов
  • Убедитесь, что вы употребляете от 1 до 2 грамма белка на килограмм массы тела в сутки из комбинации продуктов с высоким содержанием белка и пищевых добавок. Если вы очень активны, пытаясь значительно увеличить сухую массу, или придерживаетесь плана питания, ориентированного на углеводы, нацельтесь на самый продвинутый сегмент этого руководства.
  • Распределите общее суточное целевое потребление протеина на 4-6 приемов пищи и перекусов. Это помогает обеспечить лучшее усвоение и постоянную доставку аминокислот днем и ночью.
  • Попытайтесь принимать быстро действующий протеин утром и перед тренировками, формулу для восстановления – после тренировок, а медленно усваиваемый протеин между приемами пищи и перед сном.
  • Внимательно читайте этикетки и отдавайте предпочтение авторитетному бренду, чтобы быть уверенным, что вы получаете то, за что платите.
  • Протеин предоставляет строительные блоки, но даже самые лучшие источники не построят новую мышцу без правильного стимула и достаточного восстановления. Итак, убедитесь, что вы придерживаетесь разумной диеты, тренируетесь регулярно и интенсивно, имеете хорошую гидратацию и получаете, по крайней мере, 7 часов сна каждую ночь.
Объяснение методов анализа белков

— ATA Scientific

Объяснение белков

Белки, также известные как полипептиды, представляют собой органические соединения, состоящие из аминокислот. Это большие сложные молекулы, которые играют в организме множество важных ролей.

Белки состоят из сотен тысяч более мелких единиц, которые расположены в линейную цепочку и свернуты в глобулярную форму.Существует 20 различных типов аминокислот, которые можно комбинировать для создания белка, и последовательность аминокислот определяет уникальную трехмерную структуру каждого белка и его конкретную функцию.

Белки выполняют большую часть работы в клетках и необходимы для структуры, функции и регулирования тканей и органов организма. Важнейшие части организмов, они участвуют практически во всех процессах внутри клеток. Многие белки представляют собой ферменты, катализирующие биохимические реакции и жизненно важные для метаболизма.Размер белка является важной физической характеристикой, и ученые часто используют анализаторы размера частиц в своих исследованиях, чтобы обсудить размер или молекулярную массу белка.

СТРУКТУРА БЕЛКОВ

Чтобы иметь возможность выполнять свою биологическую функцию, белки складываются в одну или несколько конкретных пространственных конформаций, управляемых рядом нековалентных взаимодействий, таких как водородные связи, ионные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобная упаковка. Это понимание является темой научной области структурной биологии, которая использует традиционные методы, такие как рентгеновская кристаллография, ЯМР-спектроскопия и спектрометрия кругового дихроизма для определения структуры белков.

Большинство белков складываются в уникальные трехмерные структуры. Форма, в которую белок складывается естественным образом, называется его нативной конформацией. В то время как большинство белков могут сворачиваться без посторонней помощи благодаря химическим свойствам своих аминокислот, другим требуется помощь молекулярных шаперонов. Есть четыре различных аспекта структуры белка:

  • Первичная структура : аминокислотная последовательность.
  • Вторичная структура : Регулярно повторяющиеся локальные структуры, стабилизированные водородными связями.
  • Третичная структура : Общая форма отдельной белковой молекулы; пространственное отношение вторичных структур друг к другу.
  • Четвертичная структура : Структура, образованная несколькими белковыми молекулами, которые функционируют как единый белковый комплекс.

Белковые структуры имеют размер от десятков до нескольких тысяч аминокислот. По физическому размеру белки классифицируются как наночастицы от 1 до 100 нм. Очень большие агрегаты могут быть образованы из белковых субъединиц.Например, многие тысячи молекул актина собираются в микрофиламент.

ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА БЕЛКОВ

Белки отличаются друг от друга по типу, количеству и последовательности аминокислот, составляющих основу полипептида. Следовательно, они имеют разные молекулярные структуры, питательные свойства и физико-химические свойства.

Существует три основных метода анализа белков: разделение белков, вестерн-блоттинг и идентификация белков.

1. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Белковый электрофорез — это процесс разделения или очистки белков путем помещения их в гелевую матрицу и последующего наблюдения за подвижностью белка в присутствии электрического поля. Это важный подход к изучению функции белков и влияния конкретного белка на развитие или физическую функцию путем введения его в организм.

Наиболее часто используемым методом разделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).Белки можно разделить по растворимости, размеру, заряду и сродству связывания. SDS-PAGE разделяет белки в основном на основе молекулярной массы, а не на основе заряда или фолдинга. Этот метод широко используется в биохимии, судебной медицине, генетике и молекулярной биологии.

Другие методы включают:

  • Изоэлектрическая фокусировка : В этом методе разные молекулы разделены различиями в их электрическом заряде. Этот метод представляет собой тип зонного электрофореза, который обычно проводится в геле и использует тот факт, что заряд молекулы изменяется в зависимости от pH окружающей среды.
  • Хроматические методы : Для разделения белков часто используются два хроматических метода — высокоэффективная жидкостная хроматография и тонкослойная хроматография. Оба эти метода являются особенно полезными дополнениями к подходам на основе геля. Хотя хроматография — распространенный метод в биохимических лабораториях, используемый для очистки, идентификации и количественного определения белковых смесей, лазерная дифракция традиционно используется для управления размером предколонок и полидисперсностью.
  • Двумерный гель-электрофорез : это мощный метод на основе геля, обычно используемый для анализа сложных образцов с целью характеристики всего диапазона белков в образце, а не только нескольких конкретных белков.

2. ЗАПАДНОЕ БЛОТТИНГ

Метод вестерн-блоттинга использует три элемента для идентификации конкретных белков из сложной смеси белков, извлеченных из клеток: разделение по размеру, перенос на твердую основу и маркировку целевого белка с использованием соответствующих первичных и вторичных антител для визуализации.

Самая распространенная версия этого метода — иммуноблоттинг. Этот метод используется для обнаружения конкретных белков в заданном образце гомогената или экстракта ткани. Образец белков сначала подвергается электрофорезу с помощью SDS-PAGE для разделения белков на основе молекулярной массы. Затем белки переносятся на мембрану, где они исследуются с помощью антител, специфичных к целевому белку.

3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКА

Существует два метода, которые обычно используются для идентификации белков: деградация по Эдману и масс-спектрометрия.

Деградация по Эдману, разработанная Пером Эдманом, представляет собой метод секвенирования аминокислот в пептиде. Здесь аминоконцевой остаток помечен и отщеплен от пептида без разрыва пептидных связей между другими аминокислотными остатками.

Масс-спектрометрия белка

— это аналитический метод, который измеряет отношение массы к заряду заряженных частиц для определения массы частиц и элементного состава образца молекул, а также для выяснения химической структуры молекул, таких как пептиды.Масс-спектрометрия белков — важный метод точного определения массы и характеристики белков, и для его многочисленных применений были разработаны различные методы и приборы. Применение масс-спектрометрии для изучения белков стало популярным в 1980-х годах после разработки MALDI и ESI. Эти методы ионизации сыграли важную роль в идентификации белков. Идентификация может быть произведена по телефону:

  • Фингерпринт массы пептидов использует массы протеолитических пептидов в качестве входных данных для поиска в базе данных предсказанных масс, которые возникают в результате переваривания списка известных белков.Основное преимущество этого метода заключается в том, что он не зависит от секвенирования белков для идентификации белков. Ограничение этого метода состоит в том, что он требует, чтобы в базе данных был белок, который уже охарактеризован для другого организма.
  • De novo секвенирование пептида выполняется без предварительного знания аминокислотной последовательности. Этот метод позволяет получать пептидные последовательности без базы данных белков и использует вычислительные подходы для определения последовательности пептида непосредственно из экспериментальных спектров МС / МС.Его можно использовать для несеквенированных организмов, антител, пептидов с посттрансляционными модификациями (PTM) и эндогенных пептидов.

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА БЕЛКОВ

Комплексный анализ белков включает обширную интерпретацию структуры и функций белков, которые присутствуют в сложных биологических образцах. Хотя современные методы анализа белковых комплексов эффективны для определения структуры белковых комплексов, существуют некоторые ограничивающие факторы.

Постоянно увеличивающееся количество альтернативных способов обнаружения белок-белковых взаимодействий (ИПП) красноречиво свидетельствует о творческом потенциале ученых в поисках оптимальной техники.Современные методы постоянно позволяют нам изучать белок более эффективно, результативно и с меньшими затратами и включают:

1. РАССЕЯНИЕ СВЕТА

Методы рассеяния света особенно чувствительны к более крупным молекулам в препаратах из более мелких молекул. Любое увеличение размера белка, скорее всего, будет результатом образования агрегатов. Чувствительность измерения светорассеяния к более крупным белкам означает, что самые ранние стадии денатурации, ведущие к образованию нескольких агрегатов, приведут к изменениям среднего гидродинамического размера.

Пакетное динамическое рассеяние света (DLS): Измерение размера — это первичное измерение белков, которое может быть выполнено с помощью пакетного режима DLS. Поскольку белки имеют очень постоянный состав и складываются в плотные структуры, гидродинамический размер предсказуемо связан с молекулярной массой. Активность и функция белка тесно связаны с правильной укладкой и структурой. Таким образом, активность также напрямую связана с размером белка, что означает, что размер также может использоваться в качестве предиктора активности.DLS — наиболее чувствительный метод обнаружения небольших количеств агрегатов в препаратах. В программе Zetasizer есть модель, позволяющая прогнозировать молекулярную массу белка на основе его гидродинамического размера с помощью DLS. Запросить демо.

Статическое рассеяние света (SLS): Следуя измерениям DLS, измерения SLS также могут быть выполнены для белков. Многие образцы белков высокой степени очистки должны быть применимы для серийных измерений молекулярной массы с использованием SLS, если их концентрации точно известны.Путем измерения количества света, рассеянного при различных концентрациях образца, молекулярная масса, которая пропорциональна количеству рассеянного света, может быть рассчитана путем создания графика Дебая. Наклон линии на графике Дебая составляет 2x 2-й вириальный коэффициент (мера молекулярного взаимодействия в растворе), поэтому этот метод также может быть полезен для изучения условий кристаллизации. Сильно положительное значение указывает на хорошую растворимость, а строго отрицательное значение указывает на склонность к агрегированию.Запросить демо.

Заряд и дзета-потенциал: Используя подходящие чувствительные инструменты, такие как Zetasizer Ultra, и соответствующий метод, такой как запатентованная техника диффузионного барьера, также возможно измерение дзета-потенциала белков. Значительное количество функциональных групп аминокислот может быть заряжено, и любая их комбинация может находиться в своем заряженном или незаряженном состоянии в белке. Это будет меняться в зависимости от условий в локальной среде, и важно отметить, что дзета-потенциал может отличаться от рассчитанного чистого заряда на основе вероятного состояния заряженных остатков в молекуле.

Заряд представляет особый интерес для химиков-протеинов, и дзета-потенциал должен быть в состоянии конкурировать с изоэлектрической фокусировкой, в настоящее время одним из основных методов определения заряда белка, поскольку он позволяет поддерживать белок в условиях, более близких к его естественному состоянию. . Однако следует отметить, что белки могут быть денатурированы приложенным электрическим полем, что может затруднить измерения дзета-потенциала. Метод диффузионного барьера — это метод, который используется для надежного измерения электрофоретической подвижности белков за счет снижения воздействия процесса измерения.Чтобы получить больше информации — свяжитесь с нами.

В целом, дзета-потенциал — это мера силы сил отталкивания между молекулами в растворе. Обычно это используется в качестве основного индикатора стабильности пробоподготовки. При высоком дзета-потенциале и, следовательно, высокой силе межмолекулярного отталкивания можно ожидать, что лекарственный или белковый препарат будет стабильным в течение более длительных периодов, чем аналогичный препарат с низким дзета-потенциалом. Запросить демо.

2. МУЛЬТИ-ОБНАРУЖЕНИЕ GPC / SEC

Хотя DLS можно использовать для характеристики олигомерного состояния белка, он не может разделить смесь олигомеров.Добавление возможностей SEC к детектору светорассеяния — это способ значительно улучшить его разрешение.

Система Malvern OMNISEC Resolve and Reveal разделяет молекулы в зависимости от их размера, что делает ее отличным партнером для светорассеяния. Разделив молекулы перед их измерением с помощью DLS или SLS, этот метод можно использовать для идентификации различных компонентов в смеси. При известных концентрациях, измеряемых показателем преломления или УФ-детектором, молекулярная масса может быть напрямую связана с количеством света, рассеянного молекулой.Это можно комбинировать с данными вискозиметра, который измеряет вязкость, позволяя определить размер и некоторые структурные аспекты. Таким образом, с помощью этого метода можно получить большой объем информации для одного образца белка.

Malvern OMNISEC также добавляет еще одно измерение к обнаружению агрегатов. Отделив их от первичного образца, можно дополнительно охарактеризовать и количественно оценить их. Производители белковых растворов обычно используют SEC в качестве заключительного этапа очистки.SEC используется для разделения образцов с целью удаления любых агрегатов, образующихся при пробоподготовке. То же самое верно и при очистке одного белка из биологических образцов. Запросите демо .

3. Спектрометрия кругового дихроизма

Круговой дихроизм (CD) — это метод абсорбционной спектроскопии, основанный на дифференциальном поглощении света с левой и правой круговой поляризацией. Оптически активные хиральные молекулы будут предпочтительно поглощать свет с круговой поляризацией в одном направлении.Разницу в поглощении света с левой и правой круговой поляризацией можно измерить и количественно оценить. УФ-КД используется для определения аспектов вторичной структуры белка. Вибрационный CD, IR CD, используется для изучения структуры небольших органических молекул, белков и ДНК. UV / Vis CD исследует переходы с переносом заряда в комплексах металл-белок.

Спектрометры CD серии

JASCO J1000 обеспечивают максимальное отношение сигнал-шум в условиях высокого поглощения и низкой интенсивности света в дальней УФ-области спектра для исследования структуры и стабильности биомолекул.Он обеспечивает непревзойденные оптические характеристики и универсальную гибкость для расширенной биомолекулярной характеристики и стереохимического анализа. Монохроматор с двойной поляризационной призмой покрывает всю область, необходимую для рутинного анализа биомолекул, с отличным подавлением паразитного света для получения точных результатов. Усовершенствованное измерение ультрафиолетового излучения в вакууме позволяет измерять спектр КД в вакуумном УФ-диапазоне, который может снижаться до 163 нм, что имеет решающее значение для биомолекул. Запросить демо

4.Изотермическая калориметрия титрования

Изотермическая калориметрия титрования (ITC) — это физический метод, используемый для определения термодинамических параметров взаимодействий в растворе. Чаще всего он используется для изучения связывания небольших молекул (например, лекарственных соединений) с более крупными макромолекулами (белками, ДНК и т. Д.). Он состоит из двух ячеек, заключенных в адиабатическую рубашку. Исследуемые соединения помещаются в ячейку для образца, тогда как другая ячейка, эталонная ячейка, используется в качестве контроля и содержит буфер, в котором растворяется образец.

MicroCal PEAQ-ITC обеспечивает высочайшую чувствительность для измерений сродства связывания и термодинамики без метки при низком расходе образцов для исследования биомолекулярных взаимодействий. Он обеспечивает прямое измерение всех параметров связывания в одном эксперименте и может анализировать связывающие вещества со слабым и высоким сродством, используя всего лишь 10 мкг образца. Полуавтоматическое обслуживание сводит к минимуму вмешательство оператора, а систему можно модернизировать до полностью автоматизированной системы MicroCal PEAQ-ITC Automated, что делает ее идеальной для лабораторий, где скорость, чувствительность и способность справляться с более высокими рабочими нагрузками в будущем имеют первостепенное значение.Запросить демо

ПРОСТОЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВ

Кристаллизация белков — необходимый шаг для выяснения их детальной трехмерной структуры. Кристаллизация — сложный процесс, который требует содержания высокоочищенного белка в идеальных условиях. В измерениях DLS полидисперсность является мерой чистоты образца. Образец белка с очень низкой полидисперсностью показывает, что он высокоочищен, что весь белок находится в одной конкретной олигомерной конформации и что его структура очень хорошо контролируется в этих условиях, все из которых необходимы для кристаллизации.Определив образец белка с наименьшей полидисперсностью, исследователь может найти наиболее подходящие условия для кристаллизации.

Размер также может быть использован в качестве предиктора активности, и четвертичная структура белка также может быть изучена. Когда белки олигомеризуются, их размер и молекулярная масса будут увеличиваться дискретными приращениями, соответствующими добавлению отдельных белков. Измеряя белок в различных условиях, можно оценить олигомерное состояние белка.Многие белки для своего функционирования полагаются на правильную четвертичную структуру, поэтому, опять же, гидродинамический размер может использоваться в качестве предиктора активности.

В неблагоприятных условиях, таких как экстремальные температуры и pH, белок становится денатурированным. Контролируя эти условия и измеряя гидродинамический радиус, можно установить точку плавления белка. Это связано со стабильностью белка и может использоваться в качестве предиктора срока годности.

Нужны подходящие инструменты для измерения? ATA Scientific предлагает полный набор инструментов для анализа белков различными способами, включая мультидетекционный GPC / SEC, круговой дихроизм (CD), микрокалориметрию (ITC / DSC), динамическое и статическое рассеяние света (DLS / SLS) и многое другое.Свяжитесь с нами сегодня, чтобы получить бесплатную консультацию и упростить анализ белка. Мы предоставляем инструменты и постоянную поддержку, чтобы вы были уверены в своих результатах.

Методы экстракции белков — BioChain Institute Inc.

Белок — это макромолекула, состоящая из цепочки аминокислотных остатков, которые выполняют жизненно важные функции в организме. От репликации ДНК до катализатора химических реакций и обеспечения структурной поддержки белки выполняют бесконечные задачи в организме, необходимые для выживания организма.Белки часто классифицируют по их структуре, которая учитывает, сколько цепочек аминокислот образуют его физическую форму и структуру. Это изображено на рисунке 1. Каждый аспект тела, начиная с отдельных клеток, заканчивая тканями и целыми органами, требует точного баланса белков для оптимального функционирования. В результате белки невероятно важны для изучения в биотехнологии.

Рисунок 1: Четыре порядка белковых структур (Академия Хана)

Изучение белков происходит по трем основным направлениям:

  • In Vivo : этот метод изучает белки в организме в целом, в частности, чтобы отслеживать, как они взаимодействуют с другими частями тела, а также белок-белковые взаимодействия. In vivo исследования являются необходимым аспектом любого клинического исследования.
  • In Vitro : Белки очищаются и изучаются в контролируемой среде, например в лаборатории или клинике. Это помогает изолировать любые мешающие эффекты, которые могут возникнуть во время исследования. In vitro Исследования жизненно важно завершить перед использованием живых моделей из-за потенциальных рисков, особенно при тестировании на наркотики.
  • In Silico : Более новый метод исследования белков с использованием компьютерного моделирования.Использование компьютерных моделей сокращает время, ресурсы и рабочую силу, необходимые для выполнения определенных проектов. Клеточный анализ, включая секвенирование генома и сворачивание белков, значительно выигрывает от моделей in silico . Образец модели in silico изображен на рисунке 2.

Рисунок 2: In Silico методы могут использовать вычислительное моделирование (Profacgen)

Есть определенные белки, которые чаще используются в исследованиях из-за того, насколько они важны для организма.Их можно сгруппировать по определенным категориям. Белки внеклеточного матрикса обеспечивают структурную поддержку клеток, такую ​​как эластин и коллаген. Глобулярный белок относится к образцу сворачивания и включает несколько разновидностей белков с различными функциями. Ниже приведены некоторые из наиболее распространенных типов глобулярных белков.


Методы изучения белков почти всегда включают необходимость очистки белка от других клеточных компонентов с последующим его выделением. Исторически этот процесс требовал много времени и усилий.Две основные причины, по которым белки очищаются, — это либо для препаративного использования (производство больших количеств одного и того же белка для использования, такого как инсулин или лактаза), либо для аналитического использования (извлечение небольшого количества белка для использования в структурных или функциональных исследованиях).

Использование изолированных белков

Как одна из наиболее широко изучаемых молекул в биологических исследованиях, экстракция белка находит широкое применение. От коммерческих продуктов до исследований — первый шаг, как правило, состоит в полной очистке белка.Процесс очистки белка требует многих этапов, прежде чем белок станет пригодным для использования, как показано на Рисунке 3.

Рисунок 3: Достижение высоких уровней чистоты (Руководство)

Обнаружение присутствия белков является сложной задачей из-за их небольшого размера. Методы определения общего белка включают оптическую плотность с использованием амидного черного или коллоидного золота, определение азота и такие анализы, как протеин Брэдфорда. Конкретные методы определяют количество присутствующего отдельного белка.Главными из них являются спектрометрия и методы, зависимые от антител.

В клинической практике выделение белков можно использовать для диагностики заболеваний. Например, наличие инсулина в моче может быть индикатором диабета. Кроме того, очищенные белки часто имеют жизненно важное значение для лечения заболеваний или косметических процедур, таких как использование коллагена для ухода за кожей.

В исследованиях есть несколько последующих применений к очистке белков, которые требуют высококачественных полированных экстрактов, некоторые из которых являются методами обнаружения.

  • Иммунопреципитация ( IP ): этот процесс создает антиген из иммобилизованных белковых антител и отверждает его из раствора с использованием твердой подложки. Первоначально этот метод был разработан с использованием агарозной смолы, но в современных процедурах очистки используются магнитные шарики из-за повышенной скорости, удобства и автоматизации. IP часто является первым шагом перед методами анализа или блоттинга.
  • Протеомика : Протеом организма описывает полный набор белков, которые он может создавать или использовать.Исследования протеомики на людях сосредоточены на идентификации всех белков, присутствующих в организме человека, а также их количества, функции и структуры. Это помогает быстрее находить интересующие белки.
  • Enzyme Assay : Чаще всего проводится либо для выявления присутствия определенного фермента, либо для определения общего / специфического количества ферментов, анализы жизненно важны для измерения ферментативной активности. Эксперименты могут быть непрерывными или прерывистыми, и часто необходимо контролировать точные мешающие факторы, такие как pH или температура, как показано на рисунке 4.

Рисунок 4. Эксперименты с ферментной активностью — обычное использование белков (Science Direct)

Анализы классифицируются отдельно:

  • Initial Rate Experiments: Начальная скорость специфических реакций ферментов, смешанных с субстратами.
  • Эксперименты с кривой прогресса: используется в кинетике ферментов, изучает ферментативные реакции после начальной реакции.
  • Эксперименты с переходной кинетикой: Этот сложный эксперимент изучает поведение ферментов от начальной реакции до достижения устойчивого состояния.
  • Эксперименты по релаксации: Эти эксперименты нарушают равновесие раствора фермента для анализа реакций, происходящих по мере того, как раствор возвращается в состояние равновесия.
  • Вестерн-блот: также известный как иммуноблот белков, Вестерн-блот использует гель-электрофорез для обнаружения одного специфического белка в образце ткани или клеток. Применение вестерн-блоттинга варьируется от обнаружения белков после клонирования до отслеживания запрещенных веществ у спортсменов и диагностики заболеваний на основе наличия антител.
  • Гель-электрофорез : Это метод разделения и анализа белка в зависимости от размера и заряда. Используя гелевую основу, такую ​​как полиакриламид, можно анализировать белки. Распространенными типами методов являются SDS-PAGE, QPNC-PAGE и 2-D гель-электрофорез.
  • Поиск биомаркеров: Биомаркеры — это индикаторы определенных биологических процессов, которые имеют место, например, отслеживание болезни или измерение терапевтического вмешательства.Хотя месторождение все еще находится в стадии разработки, процесс от открытия до коммерциализации является инновационным, но дорогостоящим, как показано на Рисунке 5.

Рисунок 5: Трубопровод биомаркеров (MDPI)

Наборы для экстракции белка BioChain

CNMCS Compartmental Protein Extraction Kit : Этот тщательно протестированный набор изготовлен с использованием самых высоких стандартов чистых химикатов. Набор BioChain содержит достаточно реагентов для извлечения белков из 5 граммов тканей или 125 миллионов клеток.Набор тестируется на эффективность с использованием методов SDS-PAGE и иммуноблоттинга на различных типах маркерных белков, присутствующих в организме человека. Кроме того, все четыре фракции экстрагированных белков подвергаются дальнейшему электрофорезу и иммуноблоттингу для проверки качества. Набор извлекает четыре типа белков:

  • Цитоплазма: эти белки присутствуют в цитозоле цитоплазмы клетки. Эта жидкая область отвечает за такие процессы, как гликолиз или деление клеток.
  • Ядерный: это относится к белкам, присутствующим внутри ядра клетки, включая те, которые образуют хромосомы.
  • Мембрана: эти белки образуют внешние слои клеток и тканей. Их функции включают транспортировку / связь между внутренней и внешней средой клетки и прикрепление к липидному бислою других белков.
  • Цитоскелет: белки этого компартмента состоят из структуры клетки, например, для поддержки, транспорта и деления.

Разделение сложных белковых смесей часто является сложным и трудоемким процессом. Этот набор упрощает процесс за счет использования готовых реагентов и удобного для пользователя эффективного протокола.Этот рентабельный метод обеспечивает высококачественные последовательные экстракции, которые можно использовать во многих последующих приложениях, включая SDS-PAGE, вестерн-блоттинг, IP, анализ подвижности геля и анализы белков.

Запатентованный протокол

BioChain способствует согласованности и стандартизации и может использоваться со свежими или замороженными клетками. Рабочий процесс для набора CNMCS обычно включает несколько простых шагов, поскольку для извлечения различных типов белков требуются уникальные уровни обработки.

Комплект CNMCS: извлечение из тканей . Из-за неравномерной концентрации белков на разных участках важно выбирать ткани, в которых белки распределяются выше для максимальной экстракции. Первым шагом при извлечении из ткани является измельчение ткани и ее гомогенизация перед лизисом. Это механическое нарушение разрушает поверхность и структуру ткани. После центрифугирования ткани первым доступным белком является цитоплазматический .Затем, используя химические буферы при ледяных температурах и дальнейшее центрифугирование, становятся доступными ядерный белок . Добавляется еще химический буфер, и третье вращение центрифуги обеспечивает мембранных белков, белков. Наконец, с помощью дополнительного буфера оставшийся осадок можно центрифугировать в последний раз для белков цитоскелета .

CNMCS: извлечение из культуральных клеток . Этот метод отличается от экстракции из тканей, поскольку клеткам требуется только лизис внешней мембраны для извлечения белков, что сокращает некоторые этапы.Сначала культуральные клетки центрифугируют с ледяным буфером, затем пропускают через основание иглы, чтобы разрушить клеточную мембрану и высвободить ядра клеток. Следует использовать микроскоп, чтобы контролировать уровень разрушения. Затем вращайте клеточную смесь, чтобы высвободить цитоплазматических белков . Осадок клеток снова суспендируют в ледяном буфере и многократно центрифугируют, чтобы высвободить ядерных белков . Используя другой буфер и центрифугирование, можно получить мембранных белков .Наконец, использование теплого буфера и вращение при комнатной температуре высвобождает белков цитоскелета .

Упрощение задач экстракции белков. Экстракция белков — сложный процесс, который часто требует точного управления. Часто в процессе лизиса клеток белки могут денатурироваться из химических буферов, что может привести к появлению бесполезных белков, которые не могут повторно складываться или складываться в неправильную форму. Присутствие протеиназ также может вызывать переваривание белка; это необходимо учитывать при очистке.Перекрестное заражение также имеет тенденцию быть серьезной проблемой. Комплект BioChain CNMCS Kit тщательно разработан и проверен на качество, чтобы избежать этих проблем, а подробные инструкции по устранению неисправностей включены в руководство.

Набор для экстракции общего белка : Этот набор поставляется с расширенным протоколом, разработанным для максимальной экстракции белка. Последующие применения высококачественного белка включают SDS-PAGE, 2-мерное разделение гелей, изоэлектрическое фокусирование, вестерн-блоттинг, анализ сдвига подвижности геля, исследования взаимодействия ДНК-белок, выработку антител, анализы ферментативной активности, исследования взаимодействия белок-белок, IP, и тканеспецифический анализ экспрессии белка.

Рекомендуемый минимальный образец для экстракции может составлять всего 0,1 г ткани или 2,5 миллиона клеток, но в некоторых случаях использование меньшего количества реагента может быть эффективным с образцом еще меньшего размера. В комплект Total Protein Extraction Kit входит коктейль из ингибиторов протеазы для предотвращения деградации белка. Белки, извлеченные из набора, не повреждены и могут иметь массу более 200 кДа. Замораживание, оттаивание или обработка ультразвуком не требуются.

Dr.P Kit: выделение РНК, ДНК и белка : BioChain’s Dr.P Kit — это эффективная система, которая может изолировать РНК, ДНК и белок из одного и того же участка ткани одновременно до 150 раз. Набор может использоваться для извлечения до 5 граммов ткани и обеспечивает общий белок, который можно использовать для вестерн-блоттинга.

[cta id = ”10109 ″ vid =” 0 ″]

Обзор методов анализа белков | Thermo Fisher Scientific

Количественное определение концентрации белка является неотъемлемой частью любого лабораторного рабочего процесса, включающего экстракцию, очистку, маркировку или анализ белка.Тесты Pierce Protein Assays предоставляют широкий спектр возможностей для точного определения концентрации белка на основе времени анализа, чувствительности, совместимости, линейности стандартной кривой и вариации от белка к белку. Хотя в этой статье в качестве примеров используются продукты Pierce Protein Assay, обсуждаемые принципы и химический состав в целом применимы к большинству доступных колориметрических или флуориметрических методов анализа белка.

Вступление

Количественное определение белка часто необходимо перед обработкой образцов белка для выделения, разделения и анализа с помощью хроматографических, электрофоретических и иммунохимических методов.В зависимости от требуемой точности, количества и чистоты доступного белка для определения концентрации белка подходят разные методы.

Самый простой и самый прямой метод определения концентрации белка в растворе — это измерение оптической плотности при 280 нм (УФ-диапазон). Аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи (т. Е. Тирозин, триптофан и фенилаланин), обладают сильным поглощением УФ-света. Белки и пептиды поглощают УФ-свет пропорционально содержанию в них ароматических аминокислот и общей концентрации.Другой метод, традиционно используемый в аминокислотном анализе с помощью ВЭЖХ, заключается в маркировке всех первичных аминов (то есть N-конца и боковой цепи остатков лизина) цветным или флуоресцентным красителем, таким как нингидрин или о-фталевый альдегид (OPA). Подходы с прямым поглощением УФ-света и реагентами ВЭЖХ имеют особые недостатки, которые делают эти методы непрактичными для использования с типичными образцами белков в рабочих процессах протеомики. Метод УФ-поглощения не идеален для белковых смесей, поскольку разные белки имеют разное содержание ароматических аминокислот, что приводит к разным характеристикам поглощения.Кроме того, любое небелковое вещество, поглощающее УФ-свет, будет мешать измерениям.

Чтобы преодолеть эти недостатки, было разработано несколько колориметрических и флуоресцентных методик анализа белков на основе реагентов, которые используются почти в каждой лаборатории, занимающейся исследованиями белков. К реагенту добавляют образцы белка, вызывая изменение цвета или усиление флуоресценции пропорционально добавленному количеству. Концентрацию протеина определяют по стандартной кривой, состоящей из известных концентраций очищенного эталонного протеина.Эти методы анализа белка можно разделить на две группы в зависимости от типа химии.

Таблица 1. Типы, преимущества, недостатки и примеры методов определения белка.

с белками

33 смеси или сложные образцы (например,грамм. клеточные лизаты)

Метод Преимущества Недостатки Пример реагентов для анализа
УФ-поглощение
  • Простой, не требует каких-либо аналитических реагентов
  • 33

Биуретовые методы: Белок-медное хелатирование и вторичное обнаружение восстановленной меди
  • Совместимость с большинством поверхностно-активных веществ (детергентов)
  • Кривая линейного отклика (R2> 0,95)
  • Меньше белок-белковая вариация по сравнению с анализами на основе красителя Кумасси
  • Несовместимость с веществами, снижающими медь
  • Несовместимость с обычными восстановителями, такими как DTT
BCA Assays
Lowry Assays
Colorimetric методы: Связывание белка с красителем и прямое обнаружение изменения цвета
  • Быстрое и простое выполнение
  • Выполняется при комнатной температуре
  • Совместим с большинством солей, растворителей, буферов, тиолов, восстанавливающих веществ и хелатирующих агентов
  • Несовместимость с поверхностями ctants (детергенты)
  • Высокая вариабельность белок-белок по сравнению с анализами на основе меди
Брэдфорд (Кумасси)
Методы флуоресцентного красителя: Связывание белок-краситель и прямое обнаружение увеличения флуоресценции, связанного с связанный краситель
  • Превосходная чувствительность, для количественного анализа требуется меньше образца белка
  • Время не является критическим фактором, поэтому анализы можно адаптировать для автоматизированной обработки в высокопроизводительных приложениях
  • Требуется специализированное оборудование
Флуоресцентный анализ EZQ
Анализ Qubit Protein

Выбор анализа белка

Ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка.У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Выбор среди доступных анализов белка обычно основан на совместимости метода анализа белка с образцами. Кроме того, необходимо учитывать потенциальные мешающие вещества, включенные в образцы, которые могут повлиять на определенные методы анализа, а также на точность, воспроизводимость и желаемое время инкубации. Следовательно, успешное использование анализов белка включает выбор метода, который наиболее совместим с анализируемыми образцами, выбор подходящего стандарта анализа, а также понимание и контроль конкретных допущений и ограничений, которые остаются.

Цель состоит в том, чтобы выбрать метод, который требует минимальных манипуляций или предварительной обработки образцов для размещения веществ, которые мешают анализу. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Поскольку ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка для всех обстоятельств, большинство исследователей имеют в своих лабораториях более одного типа анализа белка.

Важными критериями для выбора анализа являются:
  • Совместимость с типом образца и компонентами
  • Диапазон анализа и требуемый объем образца
  • Однородность белка к белку (см. Ниже)
  • Скорость и удобство для количества образцов подлежит тестированию
  • Наличие спектрофотометра или планшет-ридера, необходимого для измерения цвета (поглощения) при анализе

Некоторые распространенные вещества, которые потенциально мешают методам анализа белка, являются восстановителями (например, восстанавливающие агенты).я. DTT) и моющие средства (например, Triton X-100). Как правило, образцы, содержащие восстанавливающие агенты или хелатирующие медь агенты, предпочтительно анализируются с помощью тестов на основе красителя Кумасси (метод Брэдфорда). Это связано с тем, что анализы на основе красителя кумасси, такие как анализы Пирса Кумасси (Брэдфорд) и Пирса Кумасси Плюс (Брэдфорд), совместимы с восстановителями и не требуют реакций связывания медь-белок. Для тех образцов, которые содержат детергенты, лучше всего подходят анализы белков на основе меди, такие как анализ BCA Pierce Rapid Gold, поскольку они не ингибируются малыми или умеренными количествами детергента.

Помимо совместимости образцов, анализы белка также обычно группируются по диапазону концентраций белка, которые они могут обнаружить. Для образцов, в которых ожидается низкая концентрация белка (<20 мкг / мл), может потребоваться использование альтернативного протокола анализа на микропланшете или специализированного анализа, такого как анализ белка Pierce Micro BCA, который специально разработан для разбавленные образцы. Если общая концентрация белка в образцах высока (> 2000 мкг / мл), часто можно использовать разбавление образца для решения любых проблем, связанных с известными мешающими веществами.Иногда образец содержит вещества, которые делают его несовместимым с любым из методов анализа белка. Предпочтительный метод борьбы с этими типами мешающих веществ — просто удалить их.

Анализ белков BCA Pierce Rapid Gold и анализ белка Кумасси (Брэдфорд) дополняют друг друга и обеспечивают два основных метода анализа большинства образцов. Различные дополнительные реагенты и альтернативные версии этих двух анализов позволяют удовлетворить многие другие потребности в образцах.


Выбор стандарта белка

Поскольку белки различаются по аминокислотному составу, каждый из них по-разному реагирует на каждый тип анализа белка. Таким образом, лучший выбор для эталонного стандарта — это очищенная, известная концентрация белка, наиболее распространенного в образцах. Обычно этого невозможно достичь, и это редко бывает удобно или необходимо. Во многих случаях цель состоит в том, чтобы просто оценить общую концентрацию белка, и небольшая вариабельность между белками является допустимой.

Если высокоочищенная версия интересующего белка недоступна или слишком дорога для использования в качестве стандарта, альтернативой является выбор белка, который будет давать очень похожую кривую цветового отклика в выбранном методе анализа белка и легко доступны для любой лаборатории в любое время. Как правило, бычий сывороточный альбумин (БСА) хорошо подходит для стандарта белка, поскольку он широко доступен в высокой чистоте и относительно недорого. В качестве альтернативы, бычий гамма-глобулин (BGG) является хорошим стандартом при определении концентрации антител, поскольку BGG дает кривую цветового ответа, которая очень похожа на кривую иммуноглобулина G (IgG).

Для максимальной точности оценки общей концентрации белка в неизвестных образцах важно включать стандартную кривую каждый раз при проведении анализа. Это особенно верно для методов анализа белка, которые дают нелинейные стандартные кривые. Выбор количества стандартов и повторов, используемых для определения стандартной кривой, зависит от степени нелинейности стандартной кривой и требуемой степени точности. Как правило, требуется меньше точек для построения стандартной кривой, если цветовая характеристика является линейной.Обычно стандартные кривые строятся с использованием как минимум двух повторов для каждой точки кривой.


Подготовка проб для анализа белка

Перед анализом образца на общее содержание белка его необходимо растворить, обычно в забуференном водном растворе. Часто принимаются дополнительные меры предосторожности, чтобы подавить рост микробов или избежать случайного загрязнения образца посторонними предметами, такими как пыль, волосы, кожные или телесные масла.

В зависимости от исходного материала, который используется в процедурах перед проведением анализа белка, образец будет содержать множество небелковых компонентов.Знание этих компонентов имеет решающее значение для выбора подходящего метода анализа и оценки причины аномальных результатов. Например, ткани и клетки обычно лизируются буферами, содержащими поверхностно-активные вещества (детергенты), биоциды (антимикробные агенты) и ингибиторы протеаз. Также могут быть включены различные соли, денатурирующие агенты, восстанавливающие агенты и хаотропы. После фильтрации или центрифугирования для удаления клеточного мусора типичные образцы по-прежнему будут включать нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые соединения.

На каждый тип анализа белка отрицательно влияют вещества того или иного вида. Компоненты белкового раствора считаются мешающими веществами в анализе белка, если они искусственно подавляют ответ, усиливают ответ или вызывают повышенный фон на произвольно выбранную степень (например, на 10% по сравнению с контролем).

Неточность из-за небольшого количества мешающего вещества может быть устранена путем приготовления стандарта белка в том же буфере, что и анализируемый белок.Для более высоких, несовместимых уровней мешающих веществ необходимы другие стратегии:

  • Выберите другой метод анализа белка или версию того же метода анализа, которая включает компоненты для преодоления помех.
  • Диализ или обессоливание пробы для удаления мелких мешающих веществ (т.е. менее 1000 дальтон), таких как восстановители.
  • Осаждение белка в TCA или другом подходящем реагенте, удаление раствора, содержащего мешающий компонент, и повторное растворение белка для анализа.На этой иллюстрации представлен обзор того, как методы диализа белка используются для удаления веществ, которые могут загрязнять образцы белка и мешать последующим применениям.

Рис. 1. На схеме показано, как диализную кассету можно использовать для очистки белка. 3 мл 1 мг / мл IgG в 0,1 М трис-буфере, pH 7, внутри диализной кассеты помещают в 1000 мл 100 мМ PBS, с pH 7,6. Старый диализат удаляют и заменяют 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7.6. IgG слишком велик для проникновения в поры мембраны; следовательно, количество IgG внутри кассеты остается постоянным. Концентрация Трис-буфера внутри кассеты падает ниже 0,01 М по мере диффузии Трис-буфера и диффузии буфера PBS. Опять же, старый диализат отбрасывается и заменяется 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7,6. IgG внутри кассеты остается постоянным. Уровень трис-буфера внутри кассеты падает почти до неопределяемого уровня. Буфер внутри кассеты представляет собой 100 мМ PBS с pH 7.6.


Различия между белками

Каждый белок в образце отвечает уникальным образом в данном анализе белка. Такое изменение от белка к белку относится к различиям в степени окраски (оптической плотности), получаемой при одновременном анализе одной и той же массы различных белков одним и тем же методом. Эти различия в цветовой реакции связаны с различиями в аминокислотной последовательности, изоэлектрической точке (pI), вторичной структуре и присутствием определенных боковых цепей или простетических групп.

В зависимости от типа образца и цели проведения анализа, вариация от белка к белку является важным фактором при выборе метода анализа белка и при выборе подходящего стандарта анализа (например, BSA по сравнению с BGG). Методы анализа белков, основанные на аналогичном химическом составе, имеют схожие вариации от белка к белку.

Рисунок 2. Стандартные кривые. Примеры стандартных кривых с использованием очищенного BSA и BGG с набором для анализа белков Pierce BCA Protein Assay Kit, иллюстрирующие различия в интенсивности окраски двух разных белков.


Вариация белково-белковых анализов на белок

Протеиновые анализы различаются по своей химической основе для определения специфичных для белков функциональных групп. Некоторые методы анализа обнаруживают пептидные связи, но ни один анализ не делает этого исключительно. Вместо этого каждый анализ белка обнаруживает одну или несколько различных конкретных аминокислот с большей чувствительностью, чем другие. Следовательно, белки с различным аминокислотным составом дают окраску с разной скоростью или интенсивностью в любом данном анализе белка.

В следующей таблице сравнивается вариабельность цветового ответа от белка к белку в нескольких анализах протеина Thermo Scientific Pierce. Эти данные служат в качестве общего руководства для оценки различий в ответах между образцами белка. Однако, поскольку сравнения проводились с использованием одной концентрации белка и буфера, их не следует использовать в качестве точных калибровочных коэффициентов.

Эта информация о вариабельности полезна при выборе стандарта белка. Например, когда анализируемый образец представляет собой очищенное антитело, бычий гамма-глобулин (BGG, белок № 5) будет более точным стандартом, чем бычий сывороточный альбумин (BSA, белок № 1).Эти данные также указывают на важность указания того, какой стандарт анализа использовался при сообщении результатов анализа белка.

Для каждого из представленных здесь анализов белков было проанализировано 14 белков с использованием стандартного протокола пробирки. Было рассчитано чистое (скорректированное на холостое значение) среднее поглощение для каждого белка. Чистое поглощение для каждого белка выражается как отношение к чистому поглощению для BSA (например, отношение 0,80 означает, что белок дает 80% цвета, полученного для эквивалентной массы BSA).Все концентрации белка составляли 1000 мкг / мл, за исключением анализа Micro BCA, концентрация которого составляла 10 мкг / молоко.

Таблица 2. Обзор протеиновых анализов.

.7% Среднее соотношение 00 альфа-химотрипсиноген

905 95 11креулин Яичный альбумин — —
Результаты BCA
(Примечание 1)
Micro
BCA
Модифицированный
Lowry

Coomassie

Coomassie
Pierce
660 нм
Относительная однородность Высокая Высокая Высокая Средняя Низкая (Примечание 2) Низкая 11,4% 11,9% 28,8% 38,2% 37%
Стандартное отклонение 0,15 0,12 0,13 0,21 0,21 0,21 1,02 1,05 1,09 0,73 0,68 0,74
Протестированные белки
1. Альбумин, бычья сыворотка 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
2. Альдолаза, мышцы кролика 0,85 0,80 0,94 0,75 0,94 0,75 0,94 0,75 1,14 0,99 1,17 0,52 0,48
4. Цитохром С, сердце лошади 0,83 1.11 0,94 1,03 1,07 1,22
5. Гамма-глобулин, бычий 1,11 0,95 1,14 0,58 0,56 1,21 1,12 1,29 0,63 0,58
7. IgG, человек 1,09 1,03 1,13 5 0,6663 0,57
8. IgG, мышь 1,18 1,23 1,20 0,62 0,59 0,48
9. IgG, кролик 1 0,43 0,37 0,38
10. IgG, овцы 1,17 1,14 1,28 0,57 0,53

1,22 1,12 0,67 0,60 0,81
12. Миоглобин, сердце лошади 0,74 0,92 0,90 1,15 0,90 1,15 0,90 1,15 0,93 1,08 1,02 0,68 0,32 0,54
14. Трансферрин человеческий 0,89 0,98 0.92 0,90 0,84 0,8
15. альфа-лактальбумин 0,82
0,79
17. Ингибитор трипсина, соевые бобы 3 0,38 3 0,38 анализов Thermo Scientific Pierce Protein Assays Примечания:
1.Анализ совместимости с восстанавливающими агентами (BCA-RAC) также показал низкий коэффициент вариации.
2. Протеиновый анализ Bio-Rad Bradford, протестированный с теми же белками, что и наш анализ Кумасси (Брэдфорд), показал очень высокий коэффициент вариации (46%), соответствующий очень низкой относительной однородности.

Расчеты и анализ данных

В большинстве анализов белка концентрации белка в образце определяются путем сравнения их результатов анализа с ответами на серию разведений стандартов, концентрации которых известны.Образцы белка и стандарты обрабатываются таким же образом, смешивая их с реагентом для анализа и используя спектрофотометр для измерения оптической плотности. Отклики стандартов используются для построения или расчета стандартной кривой. Затем значения абсорбции неизвестных образцов интерполируются на график или формулу для стандартной кривой для определения их концентраций.

Очевидно, что наиболее точные результаты возможны только тогда, когда неизвестные и стандартные образцы обрабатываются одинаково.Это включает их анализ в одно и то же время и в одних и тех же буферных условиях, если это возможно. Поскольку задействованы разные этапы дозирования, повторения необходимы, если кто-то хочет рассчитать статистику (например, стандартное отклонение, коэффициент вариации) для учета случайной ошибки.

Рис. 3. Сравнение стандартных кривых для двухточечной и линейной аппроксимации. Интерполяция и расчет для исследуемого образца, имеющего оптическую плотность 0,6, приводят к значительно разным значениям концентрации белка.В этом случае метод «точка-точка» явно обеспечивает более точную контрольную линию для расчета тестового образца.

Хотя большинство современных спектрофотометров и планшет-ридеров имеют встроенное программное обеспечение для анализа данных анализа белков, технические специалисты часто неправильно понимают некоторые факторы. Потратив несколько минут на изучение и правильное применение принципов, задействованных в этих расчетах, можно значительно расширить возможности разработки анализов, дающих наиболее точные результаты (см. Соответствующие технические советы и ссылки).

Количественный анализ пептидов

Для рабочих процессов, использующих протеомику с использованием масс-спектрометрии, важно измерять концентрацию пептидов после этапов расщепления, обогащения и / или очистки C18, чтобы нормализовать вариации от образца к образцу. В частности, для экспериментов с использованием изобарической маркировки критически важно обеспечить маркировку равных количеств образца перед смешиванием, чтобы получить точные результаты.

Подобно методам анализа белка, доступны различные варианты определения концентрации пептида.Исторически для измерения концентраций пептидов использовались методы анализа белков в УФ-видимой области (A280) или колориметрические, основанные на реагентах. Часто используются анализы BCA и микро-BCA. Хотя эти стратегии хорошо работают с образцами белков, эти реагенты не предназначены для точного определения пептидов. Альтернативно, количественные анализы пептидов — в колориметрическом или флуорометрическом формате — доступны для специфического количественного определения смесей пептидов. При выборе формата колориметрического или флуорометрического анализа на микропланшете для количественного анализа пептидов необходимо учитывать следующие важные критерии:

  • Совместимость с типом образца, компонентами и рабочими процессами
  • Диапазон анализа и требуемый объем образца
  • Скорость и удобство для количество образцов для тестирования
  • Наличие спектрофотометра или флуорометра, необходимого для измерения результатов анализа

Эти репрезентативные данные сравнивают результаты, полученные с помощью колориметрических и флуориметрических анализов.

Рис. 4. Количественное сравнение колориметрического и флуориметрического анализа пептидов. Триптические пептидные гидролизаты получали из двенадцати клеточных линий. Концентрации перевариваемых пептидов определяли с использованием количественного колориметрического анализа пептидов Thermo Scientific Pierce и наборов для количественного флуориметрического анализа пептидов Pierce в соответствии с инструкциями. Каждый образец анализировали в трех экземплярах, и концентрацию каждого гидролизата рассчитывали по стандартной кривой, построенной с использованием стандарта анализа протеинового переваривания.


Рекомендуемая литература

  1. Брэдфорд, ММ. (1976) Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель. Аналитическая биохимия. 72, 248-254.
  2. Смит П.К., Крон Р.И., Хермансон Г.Т. и др. (1987) Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты. Аналитическая биохимия. 150, 76-85.
  3. Крон, Р.И. (2002). Колориметрическое определение и количественное определение общего белка, Current Protocols in Cell Biology, A.3H.1-A.3H.28, John Wiley & Sons, Inc.
  4. Крон, Р.И. (2001). Колориметрическое определение общего белка, Текущие протоколы аналитической химии пищевых продуктов, B1.1.1-B1.1.27, John Wiley & Sons, Inc.
  5. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., et al. (1951) Измерение белка с помощью реагента фолин-фенол. Журнал биологической химии. 193, 265-75.
  6. Legler G, Müller-Platz CM, Mentges-Hettkamp M, et al. (1985) На химической основе определения белка Лоури.Аналитическая биохимия. 150, 278-87.

Статьи по Теме

Границы | Методы экстракции белков формируют большую часть экстрагированных протеомов

Белки, отсутствующие в протеомном анализе растений

В последнее время технические достижения, особенно в жидкостной хроматографии (ЖХ) и масс-спектрометрии (МС), улучшили чувствительность, охват, надежность и производительность протеомного анализа (Boersema et al., 2015). Новые методы протеомики, такие как таргетированная протеомика (Marx, 2013), деградомика (Stoehr et al., 2013), структурная протеомика (Walzthoeni et al., 2013), химическая протеомика (Rudolf et al., 2013) и микропротеомика (Kasuga et al., 2017) становятся важными инструментами для углубленного анализа биологических систем и такие явления, как рост, развитие растений и реакция на стрессовые факторы.

Количество растительных белков, обнаруженных с помощью протеомики на основе МС, остается намного ниже, чем ожидалось. Например, улучшенный эталонный геном кукурузы содержит 39 324 гена, кодирующего белок, в среднем 3.3 транскрипта на ген (Jiao et al., 2017), каждый из которых может продуцировать как минимум несколько разных белков. Более того, дополнительные белки могут быть синтезированы протеолизом других существующих белков. На сегодняшний день в UniProtKB (http://www.uniprot.org/uniprot/?query=organism:»maize ») (получено 6 февраля 2018 г.) собрано только 947 проверенных и 169 813 непроверенных записей о кукурузном белке. Аналогичным образом, анализ записей UniProtKB для белков органелл кукурузы выявляет несколько проанализированных белков по сравнению с большим количеством непроверенных записей (дополнительная таблица 1).Важной причиной этого явления является то, что протеомные данные кукурузы не собирались и не собирались в качестве аннотации непроверенных записей о белках. Определенно, многочисленные «недостающие (скрытые) белки», которые предсказываются на уровне транскриптов, остаются неидентифицированными на уровне белков у растений.

Хотя многие факторы способствуют отсутствию белков, одной из основных причин является использование неэффективных методов экстракции белков, особенно гидрофобных мембранных белков и белков с низким содержанием (LAP) (Thelen and Peck, 2007; Libault et al., 2017). Качество пробы имеет решающее значение для охвата, надежности и производительности протеомного анализа растений, хотя передовые подходы к обнаружению (особенно ЖХ-МС / МС) могут значительно повысить чувствительность и надежность идентификации белков. Здесь, с учетом текущих подходов и тенденций в протеомике растений, мы подчеркиваем важность использования нескольких методов экстракции белков для получения более полной картины протеома растений. Более того, чтобы способствовать выявлению большего количества «недостающих белков», мы обсуждаем ключевые аспекты методов экстракции белков на тканевом, одноклеточном и органелльном уровнях.

Экстракция общих белков для сравнительного протеомного анализа

Сравнительный протеомный анализ в основном проводится с использованием общих белков, экстрагированных из тканей, органов или целых растений. Такие подходы эффективны для понимания активности растений на соответствующем уровне, но страдают от эффекта «разбавления», который маскирует уникальные биологические свойства отдельных клеток и типов клеток (Libault et al., 2017).

Основной проблемой протеомики растений является эффективное и всестороннее извлечение белков из тканей растений из-за высокого динамического диапазона растительных белков и высоких уровней мешающих веществ (например,g., фенолы, липиды, органические кислоты, углеводы, терпены и пигменты) (Wang et al., 2008). Поэтому для экстракции общего белка из тканей растений важно учитывать каждый из следующих шагов.

Во-первых, масштаб добычи должен быть определен на ранней стадии. Ткани растений можно легко гомогенизировать кварцевым песком в экстракционном буфере или измельчить жидким N 2 в ступке. Для протеомного анализа обычно достаточно небольшого количества растительного сырья (0,1–1,0 г сырой массы, в зависимости от типа ткани) (Wu et al., 2014а).

Во-вторых, удаление мешающих веществ необходимо для получения качественных образцов белка. С этой целью в настоящее время используются два подхода: основанный на осаждении ацетоном / TCA и на основе экстракции фенолом (Wang et al., 2008). Многие новаторские работы способствовали развитию, оценке и оптимизации этих подходов (Santoni et al., 2000; Giavalisco et al., 2003; Wang et al., 2003; Friso et al., 2004; Rose et al., 2004; Carpentier et al., 2005; Isaacson et al., 2006). Метод осаждения ацетон / TCA хорошо работает почти для тканей растений (Wang et al., 2008). После осаждения ацетоном / TCA органические растворимые вещества смываются, оставляя белки и другие нерастворимые вещества в осадке. Белки экстрагируются с использованием буфера, подходящего для разделения на основе 2DE, iTRAQ или LC. Метод экстракции фенолом работает путем избирательного извлечения белков из водных экстрактов во время разделения фаз (Wu et al., 2014a). Профили экстрагированного протеома сильно зависят от используемых буферов для экстракции (Chatterjee et al., 2012; Петриччионе и др., 2013; Wu et al., 2014b). Кроме того, при использовании этого подхода необходимо также учитывать температуру (Wu et al., 2014b), pH (Sari et al., 2015) и время экстракции (Feiz et al., 2006). Изменение любого из этих параметров повлияет на профиль извлеченного протеома (например, Sari et al., 2014, 2015; Zhang et al., 2014). Успех методов осаждения ацетоном / ТХК и экстракции фенолом зависит от полного измельчения растительной ткани (Wu et al., 2014a).

В-третьих, образцы сложных белков могут быть предварительно фракционированы для истощения белков с высоким содержанием, чтобы улучшить обнаружение «недостающих» белков с низким содержанием (LAP). Например, истощение запасов RuBisCO в листьях (Kim et al., 2013; Gupta, Kim, 2015) и запасных белков в семенах (Xiong et al., 2014) и клубнях (Wu et al., 2012; Kim et al. ., 2015; Lee et al., 2015; Gupta et al., 2016) значительно улучшили разделение и обнаружение LAP.

Наконец, каждый метод экстракции дает различные белковые комплементы.Следовательно, объединение применения различных методов экстракции улучшит покрытие протеомом. Действительно, важность использования нескольких методов экстракции белков для получения всестороннего протеомного покрытия подчеркивалась несколькими исследователями (например, Karthikaichamy et al., 2017; Takác et al., 2017).

Экстракция белка для протеомики органелл

Низкое содержание белков в определенных субклеточных участках может привести к их отсутствию в образцах белков тканей, органов или цельного растения (Libault et al., 2017). Таким образом, выделение чистых органелл позволяет анализировать LAP, которые специфически накапливаются в них.

Использование изолированных органелл для экстракции белка значительно снижает сложность экстрагированного протеома. Этот подход также обогащает фракцию LAP экстрактами белка, что позволяет улучшить их разделение и обнаружение. Обширные протеомные исследования очищенных органелл, таких как хлоропласты (Hall et al., 2011; Piro et al., 2015), ядер (Sikorskaite et al., 2013), митохондрии (Lang et al., 2011; Salvato et al., 2014) и гранулы крахмала (Xing et al., 2016) охарактеризовали ряд белков органелл и определили информацию об их локализации.

Предыдущие исследования клеточной биологии и биохимии разработали протоколы для выделения и очистки органелл, включая фильтрацию гомогената, дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в градиентах плотности (Таблица 1). Чистоту и целостность экстрагированных органелл можно проверить с помощью анализа активности ферментов, световой и электронной микроскопии, иммуноблоттинга и идентификации МС / МС.В отличие от измельчения растительной ткани для экстракции общего белка, экстракция белков органелл требует осторожного измельчения для получения чистых и / или интактных органелл перед экстракцией белка.

Таблица 1 . Примеры выделения органелл и анализа субпротеома у растений.

Некоторые органеллы относительно легко изолировать от других, особенно органеллы с запасающими функциями (например, липидные тела и гранулы крахмала) и крупные органеллы с мембранной структурой (например,g., хлоропласты и митохондрии). Постоянно разрабатываются новые методы выделения сложных органелл для субпротеомного анализа, например сочетание методов центрифугирования по плотности и разделения поверхностного заряда для выделения чистых мембран Гольджи (Parsons et al., 2012), центрифугирование в градиенте Перколла с последующим центрифугированием в градиенте сахарозы для выделения пероксисомы (Reumann and Singhal, 2014) и протокол простого (ультра-) центрифугирования в градиенте плотности для выделения интактных вакуолей (Ohnishi et al., 2018) из суспензионных культивированных клеток Arabidopsis.

После выделения органелл можно использовать стандартные методы экстракции белка. Состав буферов для экстракции белков может быть изменен в соответствии со свойствами целевых белков (например, растворимость, гидрофобность или гидрофильность, p I и степень, связанная с мембранами). Важно отметить, что для органелл с мембранной структурой мембраны необходимо разрушать измельчением, обработкой ультразвуком, ферментативным расщеплением или лизисом детергента для высвобождения растворимых белков (Lang et al., 2011; Пиро и др., 2015).

Для органелл со сложной структурой раздельная экстракция белков из каждой фракции суборганелл позволяет получить более подробные профили субпротеома. Например, субпротеомный анализ, включающий выделение хлоропластов Arabidopsis в виде фракций стромы, тилакоидной мембраны и просвета (Hall et al., 2011) и раздельное выделение фракций внутренней и внешней митохондриальной мембраны (Duncan et al., 2011; Schikowsky et al. ., 2018) также предоставили информацию о специфической локализации белков внутри органелл.

Наконец, по сравнению с белками во внутриклеточных компартментах, основной технической проблемой при извлечении белков клеточной стенки (CWP) является приготовление чистого образца клеточной стенки. Это особенно сложно, потому что значительные количества внутриклеточных белков неизбежно связываются с клеточной стенкой в ​​процессе гомогенизации ткани или клеток (Rose and Lee, 2010). Методы выделения клеточной стенки были оптимизированы (Feiz et al., 2006; Zhang et al., 2011; Printz et al., 2015), и в целом протеом клеточной стенки состоит из sensu stricto CWP, белков апопласта, секретируемых белки и белки ксилемного сока (Wu et al., 2018). Большинство слабосвязанных белков клеточной стенки можно растворить с использованием раствора с низкой ионной силой, тогда как прочно связанные белки клеточной стенки устойчивы к экстракции солей (Jamet et al., 2008). Кроме того, важные достижения были достигнуты в экстракции и протеомном анализе белков апопласта, секретируемых белков и белков ксилемного сока (Soares et al., 2007; Kim et al., 2014).

Экстракция белка для протеомики на одноклеточном уровне

Другая причина того, что белки могут отсутствовать в протеомном анализе растений, заключается в том, что некоторые LAP (например,g., транскрипционные и регуляторные факторы) накапливаются в специализированных типах клеток или тканей и на определенных стадиях развития (Dubos et al., 2010). При анализе всего органа или всего растения присутствие этих белков часто маскируется присутствием белков с высоким содержанием. Следовательно, протеомика или микропротеомика на уровне отдельных клеток минимизирует клеточную сложность анализируемого образца (Libault et al., 2017). Однако методы подготовки образцов и экстракции белков для микропротеомного анализа тканей растений остаются сложной задачей.

Микропротеомные методы основаны на точном и точном отборе образцов, подготовке, удалении и экстракции белка (Feist and Hummon, 2015). Лазерная микродиссекция (LCM) является многообещающим методом отбора проб на клеточном уровне. LCM позволяет изолировать интересующие типы клеток от фиксированного образца при прямой микроскопической визуализации с помощью лазерного луча. LCM успешно использовался в протеомном анализе Arabidopsis (Schad et al., 2005), кукурузы (Dembinsky et al., 2007), ячменя (Kaspar et al., 2010) и томата (Zhu et al., 2016). Лучшим примером применения LCM в сочетании с катапультированием под давлением было изолирование ядерных выступов и клеток переноса эндосперма развивающегося зерна ячменя через 8 дней после цветения. Белковые экстракты анализировали с помощью разделения наноУПЖХ в сочетании с ESI-Q-TOF MS, которая успешно идентифицировала 137 и 44 белка в проекции нуцеллы и в клетках, переносящих эндосперм, соответственно (Kaspar et al., 2010). Кроме того, у Arabidopsis был разработан метод механического разделения эпидермальных, сосудистых и мезофилловых тканей листа (Falter et al., 2015), помидоры и маниока (Svozil et al., 2016), а отдельные образцы тканей можно использовать для количественного микропротеомного анализа с помощью LCM.

Для получения достаточного количества клеток из ограниченного количества образцов с помощью LCM требуется много времени и усилий. Следовательно, необходимо разработать методы экстракции белков на микромасштабах, совместимые с уменьшенным размером образца (100 мкг и менее), чтобы использовать их параллельно с этим подходом для создания высококачественных данных МС для «отсутствующих» LAP.

Заключительные замечания

Многие «недостающие» белки не были доказаны на уровне белка.Таким образом, мы подчеркнули важность оптимизации методов экстракции белков для улучшения обнаружения недостающих белков в протеомике растений. Конечно, одной протеомики на основе МС недостаточно для исследования и идентификации всех недостающих белков. Комплексные мультиомные подходы облегчат идентификацию многих недостающих белков (Chang et al., 2014).

Необходимо отметить, что цель данной статьи — не обзор предыдущих исследований, а подчеркивание важности разработки новых подходов к установлению протеомов растений.Особое внимание всегда следует уделять разработке количественных, воспроизводимых и сопоставимых методологий протеомики растений. В частности, подходящие методы экстракции белков в сочетании с методами выделения органелл, конкретных клеток и тканей значительно улучшат протеомный анализ растений и позволят идентифицировать больше «недостающих белков». Хорошая экстракция белка — хороший протеом.

Авторские взносы

Все авторы участвовали в написании рукописи.LN и WW отредактировали рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы признательны за финансовую поддержку Национальному фонду естественных наук Китая (грант № 31230055) Программе инновационных исследований (в области науки и технологий) Университета провинции Хэнань (грант №15IRTSTHN015).

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018.00802/full#supplementary-material

Список литературы

Бансель, Э., Роньо, Х., Дебитон, К., Шамбон, К., и Бранлар, Г. (2010). Экстракция и протеомный анализ белков, связанных с гранулами крахмала, в зерне зрелой пшеницы ( Triticum aestivum L.). J. Proteome Res. 9, 3299–3310.DOI: 10.1021 / pr25

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бурсема П. Дж., Кахраман А. и Пикотти П. (2015). Протеомика за пределами широкомасштабного анализа экспрессии белков. Curr. Opin. Биотех. 34, 162–170. DOI: 10.1016 / j.copbio.2015.01.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Карпентье, С. К., Виттерс, Э., Лаукенс, К., Декерс, П., Свеннен, Р., и Панис, Б. (2005). Приготовление белковых экстрактов из непокорных тканей растений: оценка различных методов анализа с помощью двумерного гель-электрофореза. Proteomics 5, 2497–2507. DOI: 10.1002 / pmic.200401222

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chang, C., Li, L., Zhang, C., Wu, S., Guo, K., Zi, J., et al. (2014). Систематический анализ транскриптома, трансатома и протеома обеспечивает глобальный взгляд и потенциальную стратегию для C-HPP. J. Proteome Res. 13, 38–49. DOI: 10.1021 / pr4009018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чаттерджи, М., Гупта, С., Бхар, А., и Дас, С. (2012). Оптимизация эффективного протокола экстракции белка, совместимого с двумерным электрофорезом и масс-спектрометрией, из непокорных корней нута, богатых фенолами ( Cicer arietinum L.). Внутр. J. Proteomics 2012: 536963. DOI: 10.1155 / 2012/536963

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Daher, Z., Recorbet, G., Valot, B., Robert, F., Balliau, T., Potin, S., et al. (2010). Протеомный анализ пластид корня Medicago truncatula. Proteomics 10, 2123–2137. DOI: 10.1002 / pmic.200

5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дембинский Д., Волл К., Салим М., Лю Ю., Фу Ю., Борсук Л. А. и др. (2007). Транскриптомный и протеомный анализ клеток перицикла первичного корня кукурузы. Plant Physiol. 145, 575–588. DOI: 10.1104 / стр.107.106203

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Dubos, C., Stracke, R., Grotewold, E., Вайсхаар, Б., Мартин, К., и Лепиниц, Л. (2010). Факторы транскрипции MYB у Arabidopsis. Тренд. Plant Sci. 15, 573–581. DOI: 10.1016 / j.tplants.2010.06.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дункан, О., Тейлор, Н. Л., Кэрри, К., Юбель, Х., Кубишевски-Якубяк, С., Чжан, Б. и др. (2011). Множество доказательств локализуют механизмы передачи сигналов, морфологии и биосинтеза липидов на внешней мембране митохондрий Arabidopsis. Plant Physiol. 157, 1093–1113. DOI: 10.1104 / стр.111.183160

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фальтер К., Эллингер Д., фон Хюльсен Б., Хайм Р. и Фойгт К. А. (2015). Простая подготовка эпидермальной ткани растений для лазерной микродиссекции и последующего количественного протеомного и углеводного анализа. Фронт. Plant Sci. 6: 194. DOI: 10.3389 / fpls.2015.00194

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Файст, П., и Хаммон, А. Б. (2015). Протеомные проблемы: методы подготовки образцов для анализа содержания белка в микрограммах из биологических образцов. Внутр. J. Mol. Sci. 16, 3537–3563. DOI: 10.3390 / ijms16023537

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фейс, Л., Иршад, М., Понт-Лезика, Р. Ф., Канут, Х. и Жамет, Э. (2006). Оценка препаратов клеточных стенок для протеомики: новая процедура очистки клеточных стенок от гипокотилей Arabidopsis. Методы растений 2:10.DOI: 10.1186 / 1746-4811-2-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фризо, Г., Джакомелли, Л., Иттерберг, А. Дж., Пельтье, Дж. Б., Руделла, А., Сан, К., и др. (2004). Углубленный анализ протеома тилакоидной мембраны хлоропластов Arabidopsis thaliana: новые белки, новые функции и база данных протеомных пластид. Растительная клетка 16, 478–499. DOI: 10.1105 / tpc.017814

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джавалиско, П., Nordhoff, E., Lehrach, H., Gobom, J., and Klose, J. (2003). Извлечение белков из тканей растений для анализа методом двумерного электрофореза. Электрофор. 24, 207–216. DOI: 10.1002 / elps.2003

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гупта Р., Ким С. Т. (2015). Истощение белка RuBisCO с использованием метода осаждения сульфатом протамина. Methods Mol. Биол. 1295, 225–233. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-2550-6_17

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гупта, Р., Мин, К. В., Ван, Ю., Ким, Ю. К., Агравал, Г. К., Раквал, Р. и др. (2016). Ожидайте неожиданного обогащения «скрытого протеома» семян и клубней за счет истощения запасных белков. Фронт. Plant Sci. 7: 761. DOI: 10.3389 / fpls.2016.00761

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Холл М., Мишра Ю. и Шредер В. П. (2011). Подготовка фракций стромы, тилакоидной мембраны и просвета хлоропластов Arabidopsis thaliana для протеомного анализа. Methods Mol. Биол. 775, 207–222. DOI: 10.1007 / 978-1-61779-237-3_11

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Isaacson, T., Damasceno, C. M., Saravanan, R. S., He, Y., Catal, á, C., Saladi, é, M., et al. (2006). Методы экстракции образцов для расширенного протеомного анализа тканей растений. Nat. Protoc. 1, 769–774. DOI: 10.1038 / nprot.2006.102

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джайн Р., Катавич, В., Агравал, Г. К., Гузов, В. М., и Телен, Дж. Дж. (2008). Очистка и протеомная характеристика пластид развивающихся эмбрионов Brassica napus. Proteomics 8, 3397–3405. DOI: 10.1002 / pmic.200700810

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Жаме, Э., Албен, К., Боудар, Г., Иршад, М., Канут, Х., и Понт-Лезика, Р. (2008). Последние достижения в протеомике клеточных стенок растений. Proteomics 8, 893–908. DOI: 10.1002 / pmic.200700938

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Jiao, Y., Peluso, P., Shi, J., Liang, T., Stitzer, M.C., Wang, B., et al. (2017). Улучшенный эталонный геном кукурузы с использованием одномолекулярных технологий. Природа 546, 524–527. DOI: 10.1038 / природа22971

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Karthikaichamy, A., Deore, P., Rai, V., Bulach, D., Beardall, J., Noronha, S., et al. (2017). Пришло время использовать несколько методов экстракции в протеомике? сравнение трех методов экстракции белка у Eustigmatophyte alga Microchloropsis gaditana CCMP526. OMICS 21, 678–683. DOI: 10.1089 / omi.2017.0128

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Каспар, С., Вейер, Д., Вешке, В., Мок, Х. П., и Матрос, А. (2010). Анализ белков микроткани, рассеченных лазерным захватом, выявил специфические биологические функции клеточного типа в развивающихся зернах ячменя. Анал. Биоанал. Chem. 398, 2883–2893. DOI: 10.1007 / s00216-010-4120-y

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Касуга, К., Катох, Ю., Нагасе, К., и Игараси, К. (2017). Микропротеомика с микрофлюидной сортировкой клеток: применение к 1000 и 100 иммунным клеткам. Протеомика 17: 1600420. DOI: 10.1002 / pmic.201600420

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Kim, J. Y., Wu, J., Kwon, S. J., Oh, H., Lee, S. E., Kim, S. G., et al. (2014). Протеомика риса и взаимодействие грибов Cochliobolus miyabeanus : понимание белков внутриклеточного и внеклеточного пространства. Proteomics 14, 2307–2318. DOI: 10.1002 / pmic.201400066

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ким, Ю. Дж., Ли, Х. М., Ван, Ю., Ву, Дж., Ким, С. Г. и др. (2013). Истощение обильного растительного белка RuBisCO с использованием метода осаждения сульфатом протамина. Proteomics 13, 2176–2179. DOI: 10.1002 / pmic.201200555

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ким, Ю. Дж., Ван, Ю., Гупта, Р., Ким, С.W., Min, C.W., Kim, Y.C., et al. (2015). Метод осаждения протаминовым сульфатом истощает обильные запасы белков семян растений: тематическое исследование бобовых растений. Proteomics 15, 1760–1764. DOI: 10.1002 / pmic.201400488

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Клеффманн, Т., Рассенбергер, Д., фон Зихлински, А., Кристофер, В., Шеландер, К., Груиссем, В. и др. (2004). Протеом хлоропласта Arabidopsis thaliana обнаруживает изобилие путей и новые функции белка. Curr. Биол . 9, 354–362. DOI: 10.1016 / j.cub.2004.02.039

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ланде, Н. В., Субба, П., Баруа, П., Гайен, Д., Кешава Прасад, Т. С., Чакраборти, С., и др. (2017). Рассечение протеома хлоропластов нута ( Cicer arietinum L.) позволяет по-новому взглянуть на классические и неклассические функции. J. Proteomics 165, 11–20. DOI: 10.1016 / j.jprot.2017.06.005

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ланг, Э.Г., Мюллер, С. Дж., Хернштейн, С. Н., Поранкевич-Асплунд, Дж., Вервлит-Шибаум, М., и Рески, Р. (2011). Одновременное выделение чистых и интактных хлоропластов и митохондрий из мха как основа субклеточной протеомики. Rep. Растительных клеток 30, 205–215. DOI: 10.1007 / s00299-010-0935-4

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, Х. М., Гупта, Р., Ким, С. Х., Ван, Ю., Раквал, Р., Агравал, Г. К. и др. (2015). Обильное истощение запасного белка из белков клубней с использованием метода осаждения этанолом: пригодность для изучения протеомики. Proteomics 15, 1765–1769. DOI: 10.1002 / pmic.201400526

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Либо, М., Пинго, Л., Зогли, П., и Шифельбейн, Дж. (2017). Биология систем растений на одноклеточном уровне. Trends Plant Sci. 22, 949–960. DOI: 10.1016 / j.tplants.2017.08.006

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мальтман, Д. Дж., Саймон, В. Дж., Уиллер, К. Х., Данн, М. Дж., Уэйт, Р., и Слабас, А.Р. (2002). Протеомный анализ эндоплазматической сети развивающихся и прорастающих семян клещевины (Ricinus communis). Электрофорез 23, 626–639. DOI: 10.1002 / 1522-2683 (200202) 23: 4 <626 :: AID-ELPS626> 3.0.CO; 2- #

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Николовски Н., Шляха П. В., Гатто Л., Дюпри П. и Лилли К. С. (2014). Количественная оценка белка без этикеток для определения локализации и изобилия белка Гольджи в растениях. Plant Physiol. 166, 1033–1043. DOI: 10.1104 / стр.114.245589

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ohnishi, M., Yoshida, K., and Mimura, T. (2018). «Анализ протеома вакуолярной мембраны (тонопласта)», в Plant Membrane Proteomics Methods in Molecular Biology , Vol 1696, eds HP Mock, A. Matros, and K. Witzel (New York, NY: Humana Press), 107–116 .

    Google Scholar

    Парсонс, Х. Т., Кристиансен, К., Книрим, Б., Кэрролл, А., Ито, Дж., Батт, Т. С., и др. (2012). Выделение и протеомная характеристика Arabidopsis Golgi определяет функциональные и новые компоненты, участвующие в биосинтезе клеточной стенки растений. Plant Physiol. 159, 12–26. DOI: 10.1104 / стр.111.193151

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Петриччионе, М., Ди Чекко, И., Арена, С., Скалони, А., и Скортичини, М. (2013). Протеомные изменения в побеге Actinidia chinensis во время системной инфекции пандемией Pseudomonas syringae pv.actinidiae. J. Proteomics 78, 461–476. DOI: 10.1016 / j.jprot.2012.10.014

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Пиро, А., Серра, И. А., Спадафора, А., Кардилио, М., Бьянко, Л., Перротта, Г. и др. (2015). Очистка интактных хлоропластов морских растений Posidonia oceanica , пригодных для протеомики органелл. Протеомика 15, 4159–4174. DOI: 10.1002 / pmic.201500246

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Принц, Б., Дос Сантос Мораис, Р., Винкооп, С., Сержант, К., Латтс, С., Хаусман, Дж. Ф. и др. (2015). Улучшенный протокол для изучения протеома клеточной стенки растений. Фронт. Plant Sci. 6: 237. DOI: 10.3389 / fpls.2015.00237

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Reumann, S., Babujee, L., Ma, C., Wienkoop, S., Siemsen, T., Antonicelli, G.E., et al. (2007). Протеомный анализ пероксисом листьев арабидопсиса выявил новые целевые пептиды, метаболические пути и защитные механизмы. Растительная клетка 19, 3170–3193. DOI: 10.1105 / tpc.107.050989

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Рейман, С., Сингхал, Р. (2014). Выделение пероксисом листьев Arabidopsis для анализа протеома органелл. Methods Mol. Биол. 1072, 541–552. DOI: 10.1007 / 978-1-62703-631-3_36

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Роуз, Дж. К., Башир, С., Джованнони, Дж. Дж., Ян, М. М., и Сараванан, Р.С. (2004). Решение проблемы протеома растений: практические подходы, препятствия и экспериментальные инструменты. Plant J. 39, 715–733. DOI: 10.1111 / j.1365-313X.2004.02182.x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Роуз, Дж. К., и Ли, С. Дж. (2010). Отклонение от магистрали: торговля секретируемыми растительными белками и сложность протеома клеточной стенки растений. Plant Physiol. 153, 433–436. DOI: 10.1104 / стр.110.154872

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Рудольф, Г.К., Хейденройтер В. и Зибер С. А. (2013). Химическая протеомика: лигирование и расщепление модификаций белков. Curr. Opin. Chem. Биол. 17, 110–117. DOI: 10.1016 / j.cbpa.2012.11.007

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Salvato, F., Havelund, J. F., Chen, M., Rao, R. S., Rogowska-Wrzesinska, A., Jensen, O. N., et al. (2014). Митохондриальный протеом клубней картофеля. Plant Physiol. 164, 637–653. DOI: 10.1104 / стр.113.229054

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сантони, В., Киффер, С., Дескло, Д., Массон, Ф., и Рабийуд, Т. (2000). Мембранная протеомика: использование дополнительных основных эффектов с моделью мультипликативного взаимодействия для классификации белков плазматической мембраны в соответствии с их растворимостью и электрофоретическими свойствами. Электрофор 21, 3329–3344. DOI: 10.1002 / 1522-2683 (20001001) 21:16 <3329 :: AID-ELPS3329> 3.0.CO; 2-F

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сари, Ю. В., Алтинг, А. К., Флорис, Р., Сандерс, Дж.П. М., Брюинз М. Е. (2014). Производство глутаминовой кислоты из побочных продуктов пшеницы с использованием ферментативного и кислотного гидролиза. Biomass Bioenerg. 67, 451–459. DOI: 10.1016 / j.biombioe.2014.05.018

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сари Ю. В., Сяфитри У., Брюинз М. Э. и Сандерс Дж. П. М. (2015). Как состав биомассы определяет экстрагируемость белка. Ind. Crop. Prod. 70, 125–133. DOI: 10.1016 / j.indcrop.2015.03.020

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шад, М., Липтон, М. С., Джавалиско, П., Смит, Р. Д., и Кер, Дж. (2005). Оценка результатов двумерного электрофореза и жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии для тканеспецифического профилирования белков образцов растений, подвергнутых лазерному микродиссекции. Электрофорез 26, 2729–2738. DOI: 10.1002 / elps.200410399

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шиковски, К., Тал, Б., Браун, Х. П. и Эубель, Х. (2018). Подготовка проб для анализа протеома митохондриальной мембраны растений. Methods Mol. Биол. 1696, 163–183. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-7411-5_11

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Симаока Т., Охниши М., Сазука Т., Мицухаси Н., Хара-Нисимура И., Симадзаки К. и др. (2004). Выделение интактных вакуолей и протеомный анализ тонопласта из культивированных в суспензии клеток Arabidopsis thaliana . Physiol растительных клеток. 45, 672–683. DOI: 10.1093 / pcp / pch099

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сикорскайте, С., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., and Valkonen, J. P. (2013). Протокол: оптимизированная методология выделения ядер из листьев видов семейств Solanaceae и Rosaceae. Растительные методы 9, 31–40. DOI: 10.1186 / 1746-4811-9-31

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Соарес, Н. К., Франциско, Р., Рикардо, К. П., и Джексон, П. А. (2007). Протеомика ионно связанных и растворимых внеклеточных белков в листьях Medicago truncatula. Proteomics 7, 2070–2082. DOI: 10.1002 / pmic.200600953

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Стоер, Г., Шааб, К., Грауман, Дж., И Манн, М. (2013). Подход, основанный на SILAC, идентифицирует субстраты зависимого от каспазы расщепления при TRAIL-индуцированном апоптозе. Mol. Cell Proteomics 12, 1436–1450. DOI: 10.1074 / mcp.M112.024679

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Svozil, J., Gruissem, W., и Беренфаллер, К. (2016). Meselect — быстрый и эффективный метод отделения основных типов тканей листа. Фронт. Plant Sci. 7: 1701. DOI: 10.3389 / fpls.2016.01701

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Вердонк, Дж. К., Хатфилд, Р. Д., и Салливан, М. Л. (2012). Протеомный анализ клеточных стенок двух стадий развития стеблей люцерны. Фронт. Plant Sci. 13: 279. DOI: 10.3389 / fpls.2012.00279

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Вальцтоени, Т., Лейтнер А., Стенгель Ф. и Эберсольд Р. (2013). Масс-спектрометрия подтвердила определение структуры белкового комплекса. Curr. Opin. Struc. Биол . 23, 252–260. DOI: 10.1016 / j.sbi.2013.02.008

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Wang, S., Zhang, G., Zhang, Y., Song, Q., Chen, Z., Wang, J., et al. (2015). Сравнительные исследования митохондриальной протеомики выявляют интимную белковую сеть мужской стерильности у пшеницы ( Triticum aestivum L.). J. Exp. Бот. 66, 6191–6203. DOI: 10.1093 / jxb / erv322

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Wang, W., Scali, M., Vignani, R., Spadafora, A., Sensi, E., Mazzuca, S., et al. (2003). Экстракция белка для двумерного электрофореза из листьев оливы, растительной ткани, содержащей высокие уровни мешающих соединений. Электрофорез 24, 2369–2375. DOI: 10.1002 / elps.200305500

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ван, В., Тай, Ф., и Чен, С. (2008). Оптимизация экстракции белка из тканей растений для расширенного протеомного анализа. J. Sep. Sci. 31, 2032–2039. DOI: 10.1002 / jssc.200800087

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Wu, X., Gong, F., and Wang, W. (2014a). Экстракция белка из тканей растений для 2DE и его применение в протеомном анализе. Протеомика 14, 645–658. DOI: 10.1002 / pmic.201300239

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Wu, X., Xiong, E., An, S., Gong, F., and Wang, W. (2012). Последовательная экстракция приводит к улучшенному протеомному профилированию клубней лекарственного растения Pinellia ternata , которые содержат большое количество белков с высоким содержанием белка. PLoS ONE 7: e50497. DOI: 10.1371 / Journal.Pone.0050497

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ву X., Xiong, E., Wang, W., Scali, M., and Cresti, M. (2014b). Универсальный метод подготовки проб, объединяющий осаждение трихлоруксусной кислотой / ацетоном с экстракцией фенолом для протеомного анализа сельскохозяйственных культур. Nat. Protoc. 9, 362–374. DOI: 10.1038 / nprot.2014.022

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    У, X., Чжан, Q., Wu, Z., Tai, F., и Wang, W. (2018). Субклеточные местоположения потенциальных белков клеточной стенки в растениях: предикторы, базы данных и перекрестные ссылки. Краткое. Биоинформ. DOI: 10.1093 / bib / bbx050

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Син, С., Мэн, X., Чжоу, Л., Муджахид, Х., Чжао, К., Чжан, Ю., и другие. (2016). Протеомный профиль гранул крахмала, очищенного из эндосперма риса ( Oryza sativa ). PLoS ONE 11: e0168467. DOI: 10.1371 / journal.pone.0168467

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Xiong, E., Wu, X., Yang, L., Gong, F., Tai, F., and Wang, W. (2014). Экстракция фенола с помощью хлороформа улучшает профилирование протеома зародышей кукурузы за счет избирательного истощения запасных белков в большом количестве. PLoS ONE 9: e112724.DOI: 10.1371 / journal.pone.0112724

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чжан К., Сандерс Дж. П. М. и Брюинз М. Э. (2014). Критические параметры в рентабельной щелочной экстракции для высокого выхода белка из листьев. Biomass Bioenerg. 67, 466–472. DOI: 10.1016 / j.biombioe.2014.05.020

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Zhang, Y., Giboulot, A., Zivy, M., Valot, B., Jamet, E., and Albenne, C. (2011). Комбинирование различных стратегий для увеличения покрытия гликопротеома клеточной стенки растений. Фитохимия 72, 1109–1123. DOI: 10.1016 / j.phytochem.2010.10.019

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Zhu, Y., Li, H., Bhatti, S., Zhou, S., Yang, Y., Fish, T., et al. (2016). Разработка инструмента одноклеточной протеомики на основе микроскопа с лазерным захватом для изучения протеомов отдельных слоев клеток корней растений. Hortic. Res. 3, 16026–16034. DOI: 10.1038 / hortres.2016.26

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    границ | Сравнительный метод экстракции белков и 2-D гель-электрофореза из разных тканей Cajanus cajan

    Введение

    Индия является крупнейшим потребителем и производителем голубиного гороха ( Cajanus cajan ), тропического бобового растения, благодаря его диетическим свойствам.Он также культивируется в других тропических и субтропических странах (Мьянма, Кения, Мальваи, Танзания, Уганда и Непал) и обогащает почву за счет симбиотической фиксации азота. В Индии он широко известен как архар или тур, его площадь составляет 4,6 га, а урожайность составляет 762,4 кг / га –1 соответственно (FAOSTAT, 2015). Благодаря высокому содержанию белка (18–30%) и легкости переваривания (68%) он является основным источником белков, особенно для значительной части населения Индии, которое строго зависит от вегетарианской пищи (Reddy et al., 1979; Читра и др., 1996; Шарма и др., 2011). В этом контексте голубиный горох стал приоритетной культурой в Индии, где были предприняты усилия по созданию высокоурожайных сортов с помощью традиционных методов селекции и / или биотехнологических вмешательств. Эти подходы важны тем более, что это выносливая культура и часто подвергается различным биотическим и абиотическим стрессам (Варшней и др., 2010). Создание протеомного атласа с использованием современных технологий, таких как 2-DE, MALDI, iTRAQ, аффинная метка с изотопным кодом (ICAT) и орбитальная ловушка, становятся все более привлекательной парадигмой для идентификации новых белков (Agrawal et al., 2013; Заргар и др., 2015). Это ускорило потенциальное использование этих белков-кандидатов дополнительными атомными подходами. Pigeonpea — это первое семенное растение бобовых, геном которого был секвенирован в рамках глобального исследовательского консорциума (Singh et al., 2012; Varshney et al., 2012). Это дало дополнительный импульс развитию этого бобового растения, которое было бы устойчивым к различным биотическим и / или абиотическим стрессам и показывало бы высокий потенциал урожайности в неблагоприятных агроклиматических условиях.

    Различные вегетативные и репродуктивные ткани наделены разными метаболомами, которые регулируются в процессе развития видоспецифическим образом.Кроме того, клеточные белки из разных тканей часто различаются по своим свойствам в отношении заряда, размера, протеолиза, гидрофобности, взаимодействий лигандов и локализации (Isaacson et al., 2006). Кроме того, ткани растений обычно содержат небольшое количество белков с высоким содержанием протеаз, что ограничивает растворение тканей и последующее изоэлектрическое фокусирование (IEF; Wu and Wang, 1984). Вероятность разработки общего протокола экстракции белка из различных тканей таксономически различных видов растений часто имела лишь ограниченный успех.Поэтому были предприняты глобальные усилия по разработке простого в использовании протокола для оптимальной экстракции белков из различных тканей различных видов растений (Saravanan and Rose, 2004; Isaacson et al., 2006; Wang et al., 2008). В целом, по общему мнению, экстракция белка на основе ТСА-ацетона эффективна для более молодых тканей (Damerval et al., 1986; Santoni et al., 1997). В то время как экстракция фенолом с последующим осаждением ацетата аммония в метаноле считается более подходящей для довольно непокорных тканей (Wang et al., 2003; Carpentier et al., 2005). Тем не менее, остается предметом предположений, могут ли протоколы, разработанные для молодых и / или устойчивых тканей для различных видов, быть успешно использованы для создания всеобъемлющего протеомного атласа голубиного гороха из его вегетативных и репродуктивных тканей.

    Таким образом, чтобы определить, требуют ли тканеспецифические метаболические компоненты голубиного гороха особый протокол экстракции белка, в настоящем исследовании оценивались различные методы экстракции белка (фенол, ТСА-ацетон и фосфат-ТЦА-ацетон) для собранных зрелых листьев, цветов и семян. из голубиного гороха, выращиваемого в полевых условиях.Результаты явно продемонстрировали эффективность различных протоколов экстракции белка в зависимости от метаболических компонентов тканей. Далее обсуждаются достоинства этих тканеспецифичных методов экстракции белков в отношении количественных и качественных свойств экстрагированных белков и их дискретного разрешения во время IEF.

    Материалы и методы

    Растительный материал

    В настоящем исследовании использовался

    Pigeonpea ( Cajanus cajan , сорт ASHA, ICPL-87119).Различные образцы тканей (зеленый лист и полностью раскрытый цветок) были собраны с растений, выращенных и поддерживаемых Департаментом генетики Индийского института сельскохозяйственных исследований, Нью-Дели, после 8 месяцев посева. Семена брали от полностью зрелого растения, т. Е. Через 9 месяцев посева. Собранные ткани хранили при –80 ° C до дальнейшего использования.

    Реагенты

    Химические вещества и реагенты, использованные в экспериментах, были чистыми для ВЭЖХ и были закуплены у Sigma-Aldrich (≥99,93%). Для приготовления всех растворов использовали воду из системы обратного осмоса Millipore Milli-RO4.

    2-Меркаптоэтанол (2-ME, Sigma-Aldrich, номер по каталогу M6250), 3 — [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат (CHAPS, Sigma-Aldrich, номер по каталогу C3023), ацетон ( Sigma-Aldrich, каталожный номер 650501), уксусная кислота (Sigma-Aldrich, каталожный номер V800018), агароза (Sigma-Aldrich, каталожный номер A9539), ацетат аммония (Sigma-Aldrich, каталожный номер A7262 ), Реагент Брэдфорда (Sigma-Aldrich, каталожный номер B6916), бромфеноловый синий (BPB, Sigma-Aldrich, каталожный номер B0126), бычий сывороточный альбумин (BSA, Sigma-Aldrich, кат.нет. 05470), бриллиантовый синий кумасси (CBB, Bioworld, каталожный номер 742083), дитиотреитол (DTT, Sigma-Aldrich, каталожный номер D9779), этилендиаминтетрауксусная кислота, 0,5 M, pH 8,0 (EDTA, Sigma- Aldrich, № по каталогу E7889), глицерин (Sigma-Aldrich, № по каталогу G5516), глицин (Sigma-Aldrich, № по каталогу 50046), хлористый водород (HCl, Sigma-Aldrich, № по каталогу h2758). , Immobiline TM Сухая полоска, pH 3-10, 13 см (GE Healthcare, Великобритания, кат. № 17-6001-14), буфер IPG, pH 3-10 NL (GE Healthcare, UK, cat. 17-6000-88), йодацетамид (IAA, Sigma-Aldrich, cat.нет. I3750), метанол (Sigma-Aldrich, номер по каталогу 322415), фенилметансульфонилфторид (PMSF, Sigma-Aldrich, номер по каталогу P7626), хлорид калия (KCl, Sigma-Aldrich, номер по каталогу P9541), Фосфатный буфер, 1M, pH 7,5 (Sigma-Aldrich, каталожный номер P3619), полный коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА (Roche, каталожный номер REF 11 875 580 001), додецилсульфат натрия (SDS, Sigma-Aldrich, кат. № L4390), сахароза (Sigma-Aldrich, кат. № S9378), тиомочевина (Sigma-Aldrich, кат. № T8656), трихлоруксусная кислота (TCA; Sigma-Aldrich, кат.нет. 522082), Трис (основание Trizma, Sigma-Aldrich, каталожный номер T1503), раствор фенола в трис-буфере (хранится при 4 ° C, pH 7,8–8,0; Sigma-Aldrich, номер по каталогу P 4557), Tris- HCl, 1,5 M, pH 8,8 (Amresco, каталожный номер M195), мочевина (Sigma-Aldrich, каталожный номер U6504).

    Буферы для экстракции

    Экстракции белков из разных тканей проводили с использованием трех экстракционных / буферов:

    • Фенольный буфер

      Сахароза (0,7 М), Трис (0,5 М), HCl (30 мМ), ЭДТА (50 мМ), KCl (0.1 М).

    • Буфер TCA-ацетон

      TCA (10%, мас. / Об.) В ацетоне с 2-меркаптоэтанолом (0,07%).

    • Фосфатно-ТСА-ацетоновый буфер

      Фосфатный буфер (0,1 М, pH 7,5), TCA (10%, мас. / Об.) В ацетоне с 2-меркаптоэтанолом (0,07%).

    Экстракция белка

    Протокол 1 (экстракция фенола)

    Протокол экстракции мембранных белков из корней ячменя (Hurkman and Tanaka, 1986) был модифицирован для экстракции белков из 1 г каждой свежих тканей (зеленые листья и полностью раскрытые цветы) и зрелых семян голубиного гороха.Ткани измельчали ​​в предварительно охлажденном пестике и ступке с использованием жидкого азота, и порошок ресуспендировали в 3 мл буфера для экстракции и хранили при 4 ° C. Непосредственно перед использованием в предварительно охлажденный буфер добавляли 2-ME и 1 мМ PMSF. Суспензию инкубировали 10 мин при непрерывном встряхивании при 4 ° C. Затем добавляли равный объем трис-забуференного фенола и раствор снова инкубировали на шейкере в течение 10 минут при 4 ° C. Водную и органическую фазы разделяли центрифугированием при 13000 об / мин в течение 15 мин при 4 ° C.Фенольную фазу осторожно выделяли и повторно экстрагировали равным объемом буфера для экстракции. Образцы интенсивно встряхивали и центрифугировали для разделения фаз при 13000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C. Фенольный слой переносили в свежую пробирку для осаждения белков добавлением ацетата аммония (0,1 М) в холодном метаноле с последующей инкубацией в течение ночи при –20 ° C. Осадок / осадок белка трижды промывали раствором для осаждения (хранили при –20 ° C), а окончательную промывку проводили предварительно охлажденным чистым ацетоном.Осадок сушили на воздухе и затем растворяли в буфере для регидратации (7 М мочевина, 2 М тиомочевина и 2% (мас. / Об.) CHAPS).

    Протокол 2 (буфер трихлоруксусная кислота-ацетон)
    Образцы

    измельчали ​​аналогично тому, как описано для Протокола 1, а затем гомогенизировали с 3 мл раствора, содержащего TCA (10%) в ацетоне с 2 ME (0,07%). Общий белок осаждали в течение ночи при –20 ° C. Осадок встряхивали и центрифугировали при 13000 об / мин при 4 ° C в течение 15 мин. Полученный осадок трижды промывали ацетоном с добавлением 2 ME (0.07%), ЭДТА (2 мМ) и 1 таблетка полного ингибитора протеазы без ЭДТА. Для каждой промывки добавляли 500 мкл охлажденного промывочного буфера, интенсивно встряхивали и центрифугировали при 13000 об / мин при 4 ° C в течение 15 минут. Окончательную промывку проводили предварительно охлажденным ацетоном (100%). Высушенный на воздухе осадок оставляли на ночь при –80 ° C для удаления оставшихся следов ацетона. Затем осадок растворяли в буфере для регидратации.

    Протокол 3 (буфер фосфат-ТСА-ацетон)

    Образцы ткани были тонко измельчены с использованием жидкого азота.Затем порошкообразные образцы гомогенизировали с использованием фосфатного буфера (0,1 М, pH 7,5). Супернатант переносили в свежую пробирку, содержащую 2 мл TCA (10%) в ацетоне с 2 ME (0,07%) для осаждения белка. Осадок белка получали после центрифугирования при 13000 об / мин при 4 ° C в течение 15 минут. Осадок очищали трехкратной промывкой охлажденным ацетоном с добавлением 2 ME (0,07%), EDTA (2 мМ) и 1 таблеткой полного ингибитора протеазы без EDTA. Окончательная промывка производилась чистым ацетоном.Гранулы выдерживали при –80 ° C в течение ночи. Осадок без ацетона растворяли в буфере для регидратации и определяли количественно.

    Количественное определение белка

    Высушенный осадок ресуспендировали в буфере для регидратации и обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин. Нерастворимые частицы удаляли центрифугированием при 14000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C. Белки, выделенные из различных тканей с использованием протоколов 1-3, были количественно определены, как описано (Bradford, 1976).

    Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле

    Пробы белка (250 мкг белка в 250 мкл буфера для регидратации), содержащие буфер IPG (0.5%, pH 3–10) загружали в лоток для повторного набухания. Полоски с иммобилизованным линейным градиентом pH (pH 3–10, 13 см, GE Healthcare, UK) регидратировали в течение ночи. ИЭФ проводился с использованием изоэлектрической фокусирующей системы Ettan IPGPhor3 (GE Healthcare, Великобритания) при следующих условиях: 100 В в течение 1 часа с шагом и удержанием, 500 В в течение 2 часов с шагом и удержанием, 1000 В в течение 1 часа в градиентном режиме. , 8000 В в течение 2,30 ч в градиентном режиме и 8000 В в течение 30 мин с шагом и удержанием. После IEF полоски инкубировали в течение 15 мин каждая в буфере для уравновешивания SDS (6 М мочевина, 75 мМ Tris HCl, pH 8.8, глицерин 29,3%, SDS 2%, BPB 0,002%) сначала добавляли DTT (10 мг / мл –1 ), а затем заменяли уравновешивающим буфером, содержащим IAA (25 мг / мл –1 ). Уравновешенные полоски затем помещали на 12,5% трис-глицин SDS-PAGE (18 × 16 см), как описано (Laemmli, 1970). Полоски герметизировали герметизирующим раствором [буфер Лэммли, агароза (0,5%) и бромфеноловый синий (0,002%)]. Электрофорез во втором измерении проводили с использованием установки для электрофореза Hoefer SE 600 Ruby (GE Healthcare, Великобритания) при 30 мА / гель при 25 ° C.Гели окрашивали в течение ночи раствором CBB, как описано (Newsholme et al., 2000), а затем обесцвечивали раствором, содержащим 10% уксусную кислоту и 35% метанол, в течение 8 часов.

    Анализ изображения геля

    Все гели, окрашенные двумерным CBB, сканировали с помощью сканера высокого разрешения (GE Image Scanner III). Изображения гелей (формат mel) анализировали с помощью программного обеспечения ImageMaster 2-D Platinum V.7.0 (GE Healthcare, Великобритания). Для оптимальной четкости белковые пятна были обнаружены путем регулировки различных параметров, т.е.е., гладкость, выпуклость и минимальная площадь. Пятна, обнаруженные у краев геля, удаляли вручную, чтобы избежать ошибочной интерпретации. Соответствующие наборы 2-D гелей были сгруппированы в классы в соответствии с задачами анализа. Впоследствии каждое из выявленных пятен было помечено и пронумеровано. Совпадения со значением ANOVA <0,05 считали значимыми для анализа, и регистрировали общее количество белковых пятен в каждом образце. Данные для белков, экстрагированных протоколами 1-3 из разных тканей, были получены из трех технических повторений.

    Результаты и обсуждение

    В более ранних исследованиях использовались разные протоколы экстракции белка для разных тканей разных видов. Например, экстракция фенолом белка плазматической мембраны из ячменя (Hurkman and Tanaka, 1986), TCA-ацетон из листьев риса, Arabidopsis , кукурузы и огурца (Cho et al., 2006). Из этих исследований стало очевидно, что протокол экстракции белка должен быть тканевым и / или видоспецифичным. Однако до сих пор не сообщалось об оптимальном извлечении высококачественных белков из различных тканей вегетативных и репродуктивных органов голубиного гороха.Поэтому в этом исследовании мы попытались определить протокол, наиболее подходящий для каждой ткани гороха, сравнивая выход и разрешение белковых пятен на 2-мерном геле, полученном с помощью различных протоколов экстракции. Оптимизирована экстракция белка с использованием трех различных методов: из вегетативных (листья) и репродуктивных (цветы и семена) тканей, собранных из выращиваемого в полевых условиях голубиного гороха. Поскольку ожидалось, что метаболический компонент будет тканеспецифичным, вероятность того, что общий протокол экстракции белка обеспечит оптимальный выход белка высокого качества из всех этих онтогенетически разнообразных тканей, была маловероятной.Поэтому в этом исследовании желаемые ткани взвешивали и гомогенизировали, а затем подвергали различным процедурам экстракции в зависимости от используемых буферов (протокол 1, 2 и 3). На представленной здесь блок-схеме (рис. 1) показаны различные этапы протеомики, включая осаждение белка, количественное определение и изоэлектрическое фокусирование, 2-мерный гель-электрофорез, окрашивание и сканирование геля и, наконец, анализ изображений. Белки обычно экстрагируются водным буфером, детергентами или прямым осаждением (Michaud and Asselin, 1995).Для протеомных исследований, помимо обычно используемого метода осаждения трихлоруксусной кислотой (ТХК) / ацетоном (Cho et al., 2006), также была показана эффективность экстракции фенолом с последующим осаждением метанолом / ацетатом аммония (Hurkman and Tanaka, 1986).

    Рис. 1. Блок-схема, изображающая этапы экстракции белка из семян, листьев и цветов с использованием трех различных протоколов .

    В настоящем исследовании определялись и сравнивались качество и количество белков, экстрагированных с использованием протоколов 1–3 из разных тканей.Независимо от ткани, используемой для экстракции белка, протокол, основанный на экстракции фенолом, дал оптимальный выход по сравнению с двумя другими протоколами для вегетативных и репродуктивных тканей (таблица 1, рисунок 2). Метод экстракции фенолом обычно используется для извлечения белков из непокорных тканей различных видов растений (Wang et al., 2003; Saravanan and Rose, 2004; Carpentier et al., 2005). В более ранних исследованиях сообщалось об эффективности протоколов на основе TCA / ацетона и фенола для извлечения белков из непокорных тканей, причем последний метод был относительно более эффективным в удалении мешающих веществ (Saravanan and Rose, 2004; Carpentier et al., 2005).

    Таблица 1. Выходы белка и количество пятен из семян, листьев и цветков голубиного гороха с методами экстракции фенолом, P + TCA-ацетоном и TCA-ацетоном .

    Рис. 2. Осадки тканеспецифического белка с использованием методов экстракции белков фенолом, P + TCA ацетоном и TCA ацетоном. Ткани зрелого семени, зеленого листа и полностью раскрытого цветка голубиного гороха сорта ASHA измельчали ​​до мелкого порошка в жидком азоте, а затем промывали фенолом (A, D, G) , P + TCA ацетон (B, E, H) и TCA ацетон (C, F, I) .

    Белки, экстрагированные разными методами, различаются по растворимости. Например, фенольный метод облегчает экстракцию растворимых белков, тогда как метод TCA относительно больше подходит для экстракции общего белка, включая нерастворимые (Carpentier et al., 2005, например, запасные белки семян семейства глобулинов). В этом контексте добавление фосфатного буфера к TCA-Acetone помогло поддерживать pH раствора, что привело к экстракции высококачественного белка из семян.

    После извлечения белков из разных тканей с использованием протоколов 1, 2 и 3 их затем разделяли с помощью 2-DE в идентичных условиях в линейном диапазоне pH от 3 до 10. Сравнение проводилось на основе фокусировки и разрешения пятна, количества разрешенных пятен и интенсивности пятен. Хотя белки, экстрагированные с использованием протоколов 1 и 3, дали лучшие результаты по сравнению с протоколом 2 (рис. 3), а протоколы 1 и 3 оказались лучше подходят для относительно мягких (листья и цветы) и твердых (семена) тканей, соответственно.Однако в соответствии с протоколом 2 был получен осадок светло-желтого цвета с цветками, поэтому он не подходит для 2-DE (Wu et al., 2014). Примечательно, что Протокол 1 может не только очищать белки из листьев и цветов, которые обогащены фенольными соединениями и флавоноидами (Stalikas, 2007), но также обладает способностью лучше очищать, что приводит к более высокому выходу гликопротеина (Saravanan and Rose, 2004). ). Меньшее количество пятен, наблюдаемых в соответствии с Протоколом 2, могло быть связано с присутствием примесей в этих образцах белка, которые, возможно, способствовали появлению некоторых горизонтальных и вертикальных штрихов в этих гелях.Далее общее количество белковых пятен, обнаруженных на геле, сравнивали для семян, листьев и цветов, которые были обработаны согласно протоколам 1, 2 и 3 (таблица 1). Протокол 1 дал большее количество пятен как для листьев, так и для цветов по сравнению с протоколами 2 и 3. Было сообщено о явном различии в структуре белковых пятен с использованием различных методов на семенах, листьях и цветках, как показано в области рисунка 3, выделенной рамкой. Наши результаты согласовывались с более ранним исследованием, в котором также сообщалось о более высокой эффективности Протокола 1 при извлечении белков из пыльцевых зерен томатов (Saravanan and Rose, 2004).Однако протокол, подходящий для одного растения одного вида, может не подходить для другого. Это подтверждается исследованиями, которые показали пригодность обоих протоколов 1 и 2 для различных частей Arabidopsis thaliana и банановых листьев (Maldonado et al., 2008), в то время как только Протокол 2 оказался подходящим для семян Brassica (Carpentier et al., 2005; Devouge et al., 2007). Различия в количестве пятен также были очевидны в исследовании, в котором использовались различные методы экстракции белка (Saravanan and Rose, 2004).

    Рис. 3. Сравнение двух гелей DE, полученных с использованием метода экстракции фенолом, ацетоном P + TCA и ацетоном TCA. Ткани зрелого семени, зеленого листа и полностью раскрытого цветка голубиного гороха сорта ASHA измельчали ​​до мелкого порошка в жидком азоте, а затем промывали фенолом (A, D, G) , P + TCA ацетон (B, E, H) и TCA ацетон (C, F, I) . Конечные белки растворяли в буфере для регидратации. Равный белок (приблизительно 250 мкг) был разделен с помощью IEF с использованием линейных полосок IPG 13 см (pH 3–10), а затем разделен с использованием 12.5% гели SDS. Гели окрашивали CBB. Видимые различия, отмеченные прямоугольниками, сравнение основано на методах экстракции белков фенолом, P + TCA ацетоном и TCA ацетоном.

    Из этого исследования очевидно, что практически невозможно определить единый протокол экстракции белка для разных тканей, наделенных метаболитами, специфичными для развития. Подобные взгляды были предложены в более ранних исследованиях (Stalikas, 2007; Maldonado et al., 2008; Wu et al., 2014). Несмотря на различную эффективность экстракции белка из разных тканей в соответствии с протоколами 1, 2 и 3, большинство белковых пятен (с использованием IPG-полосок с pH 3–10) оставались концентрированными с молекулярной массой / pI в диапазоне от 36 до 175 кДа / 4.5–7,5 (рисунки 3A – F, таблица 2), демонстрирующие преобладание кислых белков и белков с высоким молекулярным весом для всех протеомов. В целом, это исследование показало, что Протокол 3 хорошо работает для семян, а Протокол 1 — для листьев и цветов голубиного гороха. Оптимальная стандартизация тканевого и видоспецифичного протокола экстракции белков для обеспечения разработки всеобъемлющего протеомного атласа крайне необходима для голубиного гороха. Ожидается, что доступность протеомного атласа в открытом доступе станет полезным инструментом для определения конкретных молекулярных свойств, которые потенциально могут быть использованы для создания «умного» голубого гороха, устойчивого к абиотическим и / или биотическим стрессам.

    Таблица 2. Количество белковых пятен с соответствующими гелями в различных диапазонах pH .

    Заключение

    В настоящем исследовании для экстракции белка использовались три различных протокола экстракции белка, то есть методы экстракции белка фенолом, TCA-ацетоном и P + TCA-ацетоном были оценены в семенах, листьях и цветках голубиного гороха с помощью электрофореза 2-DE. Результаты продемонстрировали повышенную эффективность протокола на основе фенола по сравнению с экстракцией ацетоном TCA на основе выхода белка, качества геля, количества и количества пятен.Это может быть связано с тем фактом, что фенол является одним из самых сильных диссоциирующих агентов, которые, как известно, уменьшают молекулярные взаимодействия между белками и другими материалами, в дополнение к его селективности в качестве растворителя. Метод экстракции фенолом дал максимальный выход белка и был особенно эффективен для трудно поддающихся лечению тканей. Что касается метода экстракции TCA-ацетоном, этот осадитель очень эффективен и позволяет мгновенно удалить протеолитические и другие модифицирующие ферменты. Однако недостатком белков, экстрагированных TCA, является то, что они трудно растворяются повторно.В сравнительном протеомном анализе настоящая цель состоит в том, чтобы увеличить количество белков, которые могут быть разрешены, оба протокола 1 и 3 оказались комплементарными, поскольку каждый протокол позволяет извлекать определенные белки.

    Авторские взносы

    NS разработал все эксперименты и внес значительный вклад во все влажные и сухие лабораторные эксперименты; Нью-Джерси и Р.К. помогали в экспериментах с влажной лабораторией; НС, Нью-Джерси, РК подготовили рукопись; AJ отредактировал рукопись; NKS и VR разработали исследование, его дизайн и координацию, а также помогли составить рукопись.Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Это исследование финансировалось Индийским советом сельскохозяйственных исследований ICAR — Национальный проект по трансгенным культурам-3021. Мы благодарим Департамент генетики Индийского института сельскохозяйственных исследований, Нью-Дели, за предоставленные нам образцы тканей.

    Список литературы

    Агравал, Г. К., Тимперио, А. М., Золла, Л., Бансал, В., Шукла, Р., и Раквал, Р. (2013). Открытие и применение биомаркеров для пищевых продуктов и напитков: от протеомики до нанопротеомики. J. Proteomics 93, 74–92. DOI: 10.1016 / j.jprot.2013.04.014

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Брэдфорд, М. М. (1976). Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель. Анал. Biochem. 72, 248–254. DOI: 10.1016 / 0003-2697 (76)

    -3

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Карпентье, С. Б., Виттерс, Э., Лаукенс, К., Декерс, П., Свеннен, Р., и Панис, Б. (2005). Приготовление белковых экстрактов из непокорных тканей растений: оценка различных методов анализа с помощью двумерного гель-электрофореза. Proteomics 5, 2497–2507. DOI: 10.1002 / pmic.200401222

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Читра, У., Сингх, У., и Венкатешвара, Р. П. (1996). Фитиновая кислота, усвояемость белков in vitro, пищевые волокна и минералы зернобобовых в зависимости от методов обработки. Растительная пища Human Nutr. 49, 307–316. DOI: 10.1007 / BF01091980

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чо К., Торрес Н. Л., Субраманьям С., Дипак С. А., Сардесай Н. и Хан О. (2006). Протокол экстракции / солюбилизации белков для протеомики на основе геля однодольных и двудольных растений. J. Plant Biol. 49, 413–420. DOI: 10.1007 / BF03031120

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Damerval, C., De Vienne, D., Zivy, M., and Thiellement, H. (1986). Технические усовершенствования в двумерном электрофорезе увеличивают уровень генетической изменчивости, обнаруживаемой в белках проростков пшеницы. Электрофорез 7, 52–54. DOI: 10.1002 / elps.1150070108

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Девуж В., Роньо Х., Неси Н., Тессье, Д., Геген, Дж., И Ларре, К. (2007). Дифференциальный протеомный анализ четырех почти изогенных сортов Brassica napus , выведенных на предмет содержания в них эруковой кислоты и глюкозинолатов. J. Proteome Res. 6, 1342–1353. DOI: 10.1021 / pr060450b

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Херкман, У. Дж., И Танака К. К. (1986). Солюбилизация белков мембран растений для анализа методом двумерного гель-электрофореза. Plant Physiol. 81, 802–806. DOI: 10.1104 / стр.81.3.802

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Isaacson, T., Damasceno, C.M.B., Saravanan, R.S., He, Y., Catala., Saladie, M., et al. (2006). Методы экстракции образцов для расширенного протеомного анализа тканей растений. Протоколы природы 1, 769–774. DOI: 10.1038 / nprot.2006.102

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мальдонадо, А. М., Эчеваррия-Зомено, С., Жан-Батист, С., Эрнандес, М., и Хоррин-Ново, Дж. В. (2008). Оценка трех различных протоколов экстракции белка для анализа протеома листьев Arabidopsis thaliana с помощью двумерного электрофореза. J. Proteomics. 71, 461–472. DOI: 10.1016 / j.jprot.2008.06.012

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мишо Д. и Асселин А. (1995). Применение к растительным белкам гель-электрофоретических методов. J. Chromatogr. 698, 263–279. DOI: 10.1016 / 0021-9673 (94) 00880-I

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ньюсхолм, С. Дж., Малифт, Б. Ф., Штайнер, С., Андерсон, Н. Л., и Шварц, Л. В. (2000). Двумерный электрофорез белков печени: характеристика лекарственной гепатомегалии у крыс. Электрофорез 21, 2122–2128. DOI: 10.1002 / 1522-2683 (20000601)

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Редди, Р. П., Рао, К. В., и Рао, Н.Г. П. (1979). Гетерозис и комбинационная способность голубиного гороха. Индиан Дж. Ген. Порода растений . 39, 240–246.

    Google Scholar

    Сантони В., Деларю М., Кабош М. и Беллини К. (1997). Сравнение данных двумерного электрофореза с фенотипическими признаками у Arabidopsis приводит к идентификации мутанта (cri1), который накапливает цитокинины. Planta 202, 62–69. DOI: 10.1007 / s004250050103

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сараванан, Р.С., Роуз, Дж. К. С. (2004). Критическая оценка методов экстракции образцов для расширенного протеомного анализа устойчивых тканей растений. Proteomics 4, 2522–2532. DOI: 10.1002 / pmic.200300789

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шарма, С., Агарвал, Н., Верма, П. (2011). Голубиный горох ( Cajanus cajan L.): скрытое сокровище режимного питания. J. Func. Environ. Бот. 1, 91–101. DOI: 10.5958 / j.2231-1742.1.2.010

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сингх Н. К., Гупта Д. К., Джаясвал П. К., Махато А. К., Датта С., Сингх С. и др. (2012). Первый набросок последовательности генома голубиного гороха. J. Plant Biochem. Biotechnol. 21, 98–112. DOI: 10.1007 / s13562-011-0088-8

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Varshney, R.K., Chen, W., Li, Y., Bharti, A.K., Saxena, R.K., Schlueter, J.A., et al. (2012). Проект последовательности генома голубиного гороха ( Cajanus cajan ), сиротской бобовой культуры бедных ресурсами фермеров. Nat. Biotechnol. 30, 83–89. DOI: 10.1038 / NBT.2022

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Варшней, Р. К., Пенметса, Р. В., Дутта, С., Кулвал, П. Л., Саксена, Р. К., Датта, С. и др. (2010). Инициатива по геномике голубиного гороха (PGI): международные усилия по повышению урожайности голубиного гороха ( Cajanus cajan L.) Молекулярное разведение 26, 393–408. DOI: 10.1007 / s11032-009-9327-2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ван, В., Scali, M., Vignani, R., Spadafora, A., Sensi, E., Mazzuca, S., et al. (2003). Экстракция белка для двумерного электрофореза из листьев оливы, растительной ткани, содержащей высокие уровни мешающих соединений. Электрофорез 24, 2369–2375. DOI: 10.1002 / elps.200305500

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ву Ф. С. и Ван М. Ю. (1984). Экстракция белков для электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия из тканей растений, богатых протеазой. Анал. Biochem. 139, 100–103. DOI: 10.1016 / 0003-2697 (84)

  • -4

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ву X., Xiong, E., Wang, W., Scali, M., and Cresti, M. (2014). Универсальный метод подготовки проб, объединяющий осаждение трихлоруксусной кислотой / ацетоном с экстракцией фенолом для протеомного анализа сельскохозяйственных культур. Протоколы природы 9, 362–374. DOI: 10.1038 / nprot.2014.022

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Заргар, С.М., Назир, М., Рай, В., Хайдуч, М., Агравал, Г. К., и Раквал, Р. (2015). К общему атласу протеома бобов: взгляд на текущее состояние исследований и потребность в комплексном протеоме. Фронт. Plant Sci. 27: 201. DOI: 10.3389 / fpls.2015.00201

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Руководство по очистке белков

    | Введение в методы очистки белков

    Белки — это биологические макромолекулы, которые поддерживают структурную и функциональную целостность клетки, и многие заболевания связаны с нарушением функции белков.Очистка белков — это фундаментальный шаг для анализа отдельных белков и белковых комплексов и выявления взаимодействий с другими белками, ДНК или РНК. Существуют различные стратегии очистки белка для решения задач желаемого масштаба, производительности и последующей обработки. Оптимальный подход часто необходимо определять эмпирически.

    Очистка белка

    Наилучший протокол очистки белка зависит не только от очищаемого белка, но и от многих других факторов, таких как клетка, используемая для экспрессии рекомбинантного белка (например,g., прокариотические по сравнению с эукариотическими клетками). Escherichia coli остается первым выбором многих исследователей для получения рекомбинантных белков из-за простоты использования, быстрого роста клеток и низкой стоимости культивирования. Белки, экспрессируемые в E.coli , могут быть очищены в относительно высоких количествах, но эти белки, особенно эукариотические белки, могут не проявлять должной активности белка или сворачивания. Культивируемые клетки млекопитающих могут предложить лучший вариант для получения правильно уложенных и функциональных белков млекопитающих с соответствующими посттрансляционными модификациями (Geisse et al .1996). Однако низкие уровни экспрессии рекомбинантных белков в культивируемых клетках млекопитающих затрудняют их очистку. В результате достижение удовлетворительного выхода и чистоты зависит от высокоселективного и эффективного захвата этих белков из сырых клеточных лизатов.

    Для упрощения очистки метки аффинной очистки могут быть слиты с интересующим рекомбинантным белком (Nilsson et al . 1997). Обычные теги слияния представляют собой полипептиды, небольшие белки или ферменты, добавленные к N- или C-концу рекомбинантного белка.Биохимические особенности различных меток влияют на стабильность, растворимость и экспрессию белков, к которым они присоединены (Stevens et al. 2001). Использование векторов экспрессии, которые включают тег слияния, облегчает очистку рекомбинантного белка.

    Выделение белковых комплексов

    Основная цель протеомики — выяснение функции белков и организации сложных сетей, ответственных за ключевые клеточные процессы. Анализ взаимодействий белок: белок может дать ценную информацию о каскадах клеточных сигналов, участвующих в этих процессах, а анализ взаимодействий белок: нуклеиновая кислота часто раскрывает важную информацию о биологических процессах, таких как регуляция мРНК, ремоделирование хромосом и транскрипция.Например, факторы транскрипции играют важную роль в регуляции транскрипции, связываясь со специфическими сайтами узнавания на хромосоме, часто на промоторе гена, и взаимодействуя с другими белками в ядре. Эта регуляция необходима для жизнеспособности, дифференцировки и роста клеток (Mankan и др. . 2009; Gosh и др. . 1998).

    Анализ белков: взаимодействия белков часто требуют простых методов иммобилизации белков на твердых поверхностях в правильной ориентации без нарушения структуры или функции белка.Эта иммобилизация не должна нарушать связывающую способность и может быть достигнута за счет использования аффинных меток. Иммобилизация белков на чипах — популярный подход к анализу взаимодействий белок: ДНК и белок: белок и идентификации компонентов белковых комплексов (Hall и др. , 2004; Hall и др. 2007; Hudson and Snyder, 2006). Функциональные белковые микрочипы обычно содержат полноразмерные функциональные белки или белковые домены, связанные с твердой поверхностью. Флуоресцентно меченая ДНК используется для зондирования массива и идентификации белков, которые связываются с конкретным зондом.Белковые микрочипы обеспечивают метод высокопроизводительной идентификации взаимодействий белок: ДНК. Иммобилизованные белки также можно использовать в анализах белков с понижением уровня для выделения партнеров по связыванию белков in vivo (клетки млекопитающих) или in vitro. Другие последующие приложения, такие как масс-спектрометрия, не требуют иммобилизации белков для идентификации белковых партнеров и отдельных компонентов белковых комплексов.

    Методы оценки белка

    Определение концентрации белка необходимо и широко используется в биологии белков, молекулярной биологии и других исследовательских приложениях.Перед тем, как приступить к выделению, очистке и анализу, необходимо оценить концентрацию образцов белка. К настоящему времени разработаны различные методы оценки белка. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки перед другими. Большинство этих методов зависят от уровней триптофана, тирозина и других ароматических аминокислот.

    Перед выбором метода следует учитывать три основных фактора.

    1. Чувствительность — Известно, что метод чувствителен, если он может обнаруживать белок в очень низких концентрациях.
    2. Специфичность — Конкретность метода определяется его эффективностью по обнаружению белка, в частности, от всех других мешающих веществ.
    3. Время — Продолжительность времени для завершения анализа и интерпретации результатов.
    Ниже перечислены различные методы оценки концентрации белка:
    • Биуретовый метод: Чувствительность этого метода очень низкая. Требуется высокий уровень протеина из 1-20 мг протеина.Реагентами, используемыми в этом методе, являются сульфат меди, гидроксид натрия и тартрат калия-натрия. Белок вступает в реакцию с этим щелочным комплексом меди и меняет цвет на фиолетовый. Затем белок можно оценить, считывая абсорбцию при 540 нм. Этот метод занимает 20–30 минут. Этот метод не зависит от аминокислотного состава и, следовательно, позволяет точно измерить все образцы белка. Основным недостатком этого метода является то, что буферы с трис-аммиаком мешают реакции.
    • Поглощение УФ: Чувствительность метода умеренная. Он может обнаруживать белки в диапазоне 50-100 мкг. В этом методе реагенты не требуются, жидкий образец белка контролируется по УФ-поглощению при OD 280 нм. В последнее время используются простые устройства, такие как Nanodrop и pico drop, где даже 1 мкл образца белка достаточно для определения концентрации белка. Этот метод занимает меньше времени, в пределах 10 минут.
    • BCA assay: Этот высокочувствительный метод обнаруживает белки при низкой концентрации 1 мкг.В этом методе ионы меди связываются с нитрогенами в белке, а затем комплекс связывается с бицинхониновой кислотой, что приводит к изменению цвета на пурпурный в зависимости от концентрации белка. Этот метод чувствителен к некоторым химическим веществам. Этот метод занимает больше всего времени, чтобы получить конечный результат примерно за час. Обычными мешающими веществами являются липиды, углеводы, железо, примеси из глицерина и т. Д.
    • Анализ Лоури: Анализ Лоури — один из старых методов, используемых для оценки белка, разработанный Оливером Лоури (1951).Это очень чувствительный метод, который дает точные результаты. Он обнаруживает белки в низких концентрациях 2-5 мкг. В этом методе, во-первых, ионы меди восстанавливаются в щелочных условиях и образуют комплекс с пептидными связями белка. Этот комплекс затем восстанавливает реагент Фолин-Чокалто, что приводит к изменению цвета на темно-синий, а поглощение может быть измерено при 650-750 нм. Для завершения анализа требуется около 45-60 минут. Доступны совместимый анализ Лоури для образцов с восстановителями и другими мешающими агентами и модифицированный анализ Лоури для образцов в детергентах.
    • Анализ Брэдфорда: Этот метод был разработан Мэрион М. Брэдфорд (1976) и широко используется. Это очень чувствительный метод и простой анализ связывания красителя. В этом методе используется краситель Кумасси бриллиантовый синий-250, который связывается с отрицательно заряженными молекулами белка. Цвет красителя изменяется в зависимости от концентрации белка, а поглощение измеряется при 595 нм.

Ответить

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *