Термогенетики: Инновационное спортивное питание термогенетики без побочных эффектов.

Содержание

Инновационное спортивное питание термогенетики без побочных эффектов.

Среди атлетов, желающих добиться идеальной фигуры и серьезно занимающихся бодибилдингом, очень распространены пищевые добавки, способствующие сжиганию жира. Благодаря содержанию кофеина, сжигатели жира не только помогают спортсмену быстрее достичь желаемого объема мускулатуры, но и обеспечивают восстановлению энергетического баланса. Чем больше энергии на тренировке затрачивает спортсмен, тем выше его производительность и тем ближе атлет к своей заветной цели – построению красивого тела.

Всем хорошо известно, а особенно спортсменам, которые постоянно употребляют разнообразное спортивное питание, Москва слезам не верит. И это значит, что не стоит полагаться только на слепую удачу, а верить в себя, упорно тренироваться и верить в волшебную силу сжигателей жира. Самыми эффективными жиросжигателями на сегодняшний день являются термогенетики, действие которых основано на принципе ускорения метаболизма, способствующего быстрому сжиганию лишнего жира в организме.

Характеристики и свойства термогенетиков

В этом ряду особо стоят термогенные сыворотки – уникальное спортивное питание, инновационная разработка нового продукта, сжигателя жира, который выпускают известные компании, мировые лидеры в области спортивного питания и пищевых добавок.

Обладая мгновенным эффектом, сыворотка максимально ускоряет процесс обмена веществ в организме, сжигает лишнее количество подкожного жира, повышает энергетический уровень. Термогенетики, обладающие уникальной формулой сжигания жира, а также качественное спортивное питание Multipower, позволяют достичь максимального результата, не вызывая неприятных побочных эффектов.

Существуют такие термогенные сыворотки, в которых не содержится алкалоидов, в том числе кофеина и эфедрина. Употребление подобных термогенетиков не вызывает бессонницу, нервозность, судороги. Сжигая лишний жир в вашем организме, такой препарат никоим образом не уменьшает объем вашей мышечной массы. Попав в кровеносную систему, термогенетик полностью усваивается и растворяется в организме, максимально ускоряя процессы бионакопления.

Благодаря инновационным термогенным сывороткам, которые предлагает спортивное питание Optimum Nutrition, вы легко достигнете идеального веса и увеличите энергетический баланс всего организма, сохранив при этом безупречные пропорции и объем мускулатуры. Специалисты ведущих компаний по производству спортивного питания тщательно отбирают компоненты, оставляя только самые эффективные и безопасные натуральные ингредиенты. Благодаря долгой и кропотливой работе над жиросжигателями нового поколения, удается добиться превосходной сочетаемости всех компонентов друг с другом, чтобы получить желаемый результат – идеальный сжигатель жира.

Поступая в организм с помощью пипетки под язык, термогенетики практически мгновенно всасываются в слизистую оболочку ротовой полости, минуя желудок и пищеварительную систему. Термогенетическая сыворотка быстро и полностью усваивается в организме, ускоряя процесс обмена веществ. Как результат – вы лишаетесь лишнего подкожного жира и обретаете желаемые пропорции идеального мускулистого тела.

 

питание для эффиктивного сжигания жира, советы спортсменов, список продуктов

Сжигатели жира или жиросжигатели – специальные препараты, созданные для редукции лишних жировых отложений. Основное действие заключается в снижении общей массы тела и подчеркивания рельефности мышц. Прием спортивного питания облегчает тренировочный процесс и позволяет спортсменам полностью концентрироваться на тренировках. Можно выделить ключевые механизмы действия препаратов:

  • Подавление аппетита;
  • Блокировка жирового синтеза и выведение лишней жидкости из организма;
  • Стимуляция процесса обмена веществ;
  • Снижение степени всасывания углеводов и жиров из пищеварительного тракта.

Жиросжигатели отвечают за ускорение расщепления жировых молекул. Жиры, с их помощью, превращаются в свободную энергию, что значительно увеличивает ее расход. Продукция необходима каждому профессиональному атлету для снижения содержания жира в организме. Основное действие происходит в ходе физических тренировок, если спортсмен соблюдает правильную диету.

Эффективная потеря возможна только при сочетании 3 составляющих: правильное питание, постоянные тренировки и прием специальных препаратов. Если человек ведет малоподвижный образ и не следит за своим рационом, добавки не дадут желаемого результата. Общая польза, при таких условиях, будет сведена к минимуму. Для достижения максимальных результатов необходимо соблюдать все указанные правила. Существует 2 типа жиросжигателей: липотропики и термогенетики. Поговорим о них подробнее.

Жиросжигатели: липотропики и термогенетики

Основное действие липотропиков – усиление липолиза жиров. Речь идет о расщеплении жировых молекул на кислоты, а затем и до глюкозы, которая используется в качестве источника энергии. Поэтому лучше совмещать прием препаратов с аэробными нагрузками. Жиросжигатели сделают молекулы доступными для расщепления, они будут “сожжены” в ходе соответствующих тренировок. Весь ассортимент липотропиков представлен в нашем каталоге.

Схема действия термогенетиков немного отличается от липотропиков. Они отвечают за ускорение обмена веществ и “разгон” метаболических процессов в организме. Это приводит к ускорению большинства реакций с последующим повышением их эффективности. Еще одно важное свойство термогенетиков – самостоятельное разрушение жировых молекул. Этим обусловлена их эффективность в период отдыха спортсмена от физических тренировок.

Термогенетики оказывают заметный эффект даже при отдельном употреблении. И все же, эффективность добавок значительно увеличивается при совмещении их приема с постоянными нагрузками. Ознакомьтесь с имеющимися термогенетиками в каталоге нашего магазина.

Жиросжигатели: правила приема

Основные правила приема указаны в инструкциях к препаратам, мы остановимся на других моментах. Если вы хотите, чтобы сжигатели жира показывали максимальную эффективность, занимаетесь аэробными нагрузками не менее чем по 40 минут 3 раза в неделю. Оптимальным вариантом являются ежедневные занятия на беговой дорожке, пробежки, езда на велотренажере и многие другие упражнения.

 


Термогенетика помогла покрутить мышей ультразвуком

Иммунофлюоресцентный анализ экспрессии TRPV1 в мозге мышей

Yaoheng Yang et al / Brain Stimulation, 2021

Американские ученые разработали метод стимуляции глубоких нейронов с помощью фокусированного ультразвука. Мышам в нейроны полосатого тела доставили ионный канал, который способен открываться и закрываться под воздействием тепла. После ультразвуковой стимуляции этой области мозга мыши крутились на месте. Исследование опубликовано в 

Brain Stimulation.

Недавно мы рассказывали о новых успехах оптогенетики: слепому пациенту частично восстановили зрение. Для этого в сетчатку доставили светочувствительные ионные каналы, которые затем активировали. Таким методом можно управлять не только клетками сетчатки, но и нейронами головного мозга. С помощью оптогенетики ученые пробовали лечить ранние признаки болезни Альцгеймера, пока только у мышей. Животные не могли актуализировать недавний опыт (как и люди с болезнью Альцгеймера). После воздействия лазера на нейроны мыши снова могли вспоминать недавно пережитое.

Близкая к оптогенетике область — термогенетика — использует для воздействия термочувствительный канал из семейства TRP. При определенной температуре эти каналы начинают пропускать ионы, активируя нейрон, в котором они расположены. Несколько лет назад мы писали об успехах российских ученых. Они разработали технологию, позволяющую эффективно возбуждать единичные нейроны при помощи лазера, излучающего в инфракрасном диапазоне. В экспериментах ученые использовали белок TRPA1 змей, который обладает повышенной чувствительностью к нагреванию и проводимостью. Появление нового метода вызвало большой интерес, так как он может помочь лечить неврологические заболевания неинвазивно. Перед исследователями стояла задача воздействовать на глубокие нейроны в мозге. Этого позволяет добиться фокусированный ультразвук: он не только глубоко проникает в нижележащие ткани, но и позволяет активировать нейроны локально.

Хун Чэнь (Hong Chen) с коллегами из Университета Вашингтона в Сент-Луисе решил разработать метод стимуляции нейронов, залегающих глубоко в мозге, используя ультразвук. Для этого ученые доставили в нейроны термочувствительный канал TRPV1. Температура его активации — 42 градуса Цельсия. Она ненамного отличается от температуры тела, поэтому позволила бы активировать канал, не причиняя вреда организму. Чтобы посмотреть, можно ли стимуляцией канала добиться активации нейронов, ученые ввели аденовирусный вектор для доставки ионного канала в полосатое тело одной половины мозга. Таким образом они хотели активировать базальные ганглии и заставить мышей двигаться.

Воздействие на полосатое тело фокусированного ультразвука побудило мышей крутиться на одном месте, при этом стимуляция другой половины мозга, где термочувствительных каналов не было, не вызвала двигательной активности (p < 0,001). Ученые проанализировали морфологию нейронов и убедились, что ни они, ни окружающие ткани мозга не пострадали во время стимуляции.

Сравнение воздействия ультразвука на интактные нейроны и нейроны, содержащие TRPV1

Yaoheng Yang et al / Brain Stimulation, 2021

Метод стимуляции нейронов, разработанный исследователями, показал свою эффективность и безопасность, поэтому ученые возлагают на него большие надежды. Он может помочь не только в изучении работы головного мозга, но и в неинвазивном лечении неврологических заболеваний.

Исследователи уже давно применяют ультразвук для стимуляции нейронов, но без доставки в них термочувствительных каналов. Американские ученые воздействовали ультразвуком на фронтальное глазодвигательное поле обезьян и обнаружили, что животные выбирали зрительные объекты, которые появлялись в контралатеральной половине поля зрения, тогда как без стимуляции выбор обуславливал порядок появления стимулов.

Анастасия Кузнецова

Физики МГУ предложили новый метод стимуляции нейронов с клеточным пространственным разрешением методами термогенетики

Ученые кафедры общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ продемонстрировали комплексную технику термогенетических исследований индивидуальных нейронов в культурах клеток и животных с использованием инфракрасного лазерного излучения. О своем исследовании сотрудники факультета рассказали в статье, которая была опубликована в журнале Nature.

(A) Схема поведенческого эксперимента с рыбкой Danio rerio, включающего локальный нагрев трансфецированных Rohon-Beard нейронов инфракрасным лазерным излучением и запись реакции рыбки быстрой камерой. (B) Термометрическое устройство на основе гибридного оптического/СВЧ зонда с квантовым сенсором — микрочастица алмаза с дефектами азот-вакансия. «Результат наших исследований предоставляет необходимый набор методик и инструментов, позволяющий проводить исследования в области нейронаук с помощью термогенетических методов. Именно термогенетика представляет альтернативу широко распространенным в настоящее время оптогенетическим исследованиям. Идеологически термогенетика и оптогенетика сходны — оба метода требуют встраивание мембранных каналов в исследуемую клетку, активация которых приводит к стимулировании физиологического отклика клетки, например, генерации потенциала действия нейроном. Используемые каналы в оптогенетике (например, канал-родопсин ChR) обладают хромофором, поглощение фотона видимого излучения которым приводит к активации канала. Термоканалы же чувствительны к локальной температуре, а не к энергии кванта света. Поэтому преимущество термогенетики над оптогенетикой состоит в возможности использовать излучение инфракрасного спектрального диапазона. Свет в инфракрасной области спектра рассеивается и поглощается биотканями в значительно меньше степени, чем в видимой, что потенциально позволит неинвазивно стимулировать клетки, расположенные в глубоких слоях. Также инфракрасное излучение обладает меньшей фототоксичностью, чем используемый в оптогенетике свет видимого диапазона», — рассказал соавтор статьи, кандидат физико-математических наук, младший научный сотрудник кафедры общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ Александр Ланин.

В работе демонстрируется методика быстрой, надежной и воспроизводимой адресной активации одиночных клеток в культуре и живом организме (in vitro и in vivo), экспрессирующих генетически встроенные термочувствительные каналы семейства TRPA1 с помощью перестраиваемого по длине волны инфракрасного лазерного излучения. В ходе работы были использованы чувствительные к теплу мембранные каналы caTRPA1 техасской гремучей змеи Crotalus atrox, активирующиеся при превышении пороговой температуры 28°С. Исследования показали, что такие термочувствительные каналы могут быть успешно экспрессированы нейронами рыбы и теплокровных животных.

Покадровая развертка реакции Danio rerio на лазерный импульс длительностью 250 мс. (A) Локальный нагрев нейрона (лазерный пучок показан красной окружностью), (B) ответная реакция в виде удара хвостом. «Управление и мониторинг локальной температурой в экспериментах с адресной активацией термочувствительных клеток являются основной задачей и особенностью наших исследований. Локальный нагрев клеток был реализован при помощи инфракрасного лазерного излучение. Правильный подбор параметров излучения (длина волны и энергия) позволяет активировать термочувствительные клетки в культуре и в живой рыбке Danio rerio. Эксперименты по термогенетической активации проводились с живыми трансфецироваными клетками Human Embryonic Kidney (HEK-293), HeLa, нейронами и эмбрионами рыбок Danio rerio. Клеточные культуры подвергались генной модификации с помощью векторов, которые встраиваясь в ДНК позволяют экспрессировать кальциевый индикатор GCaMP6s и термочувствительные каналы caTRPA1. Отклик биологической системы на лазерный нагрев полностью контролировался за счет оптической визуализации кальциевых токов и электрофизиологии. Одной из основных особенностей работы является создание и использование квантового термометрического зонда на основе волоконно-оптического/СВЧ волновода с квантовым сенсором (микрочастицей алмаза с дефектами азот-вакансия (NV-центрами), закрепленной на торце волнвода) для адресного измерения температуры с высоким (клеточным) пространственным разрешением. Уникальные свойства реализованного зонда имеют большой потенциал для задач термогенетики, поскольку позволяет не только измерять температуру биологических объектов с высокой точностью и микронным (вплоть до субклеточного) пространственным разрешением, но и локально изменять температуру, тем самым реализуя возможность управления функциональной активностью термочувствительных клеток», — пояснил ученый.

В работе была реализована серия поведенческих экспериментов на рыбке Danio rerio, в нейронах которой была осуществлена экспрессия термочувствительных каналов caTRPA1. Активация одного из группы этих нейронов (Rohon-Beard), расположенных на спинке рыбы, приводит к реакции убегания, проявляющаяся в резком ударе хвоста. Проведение флуоресцентной микроскопии позволило находить успешно трансфецированные нейроны, локальный нагрев которых осуществлялся импульсом инфракрасного излучения на длине волны 1342 нм длительностью 250 мс. Импульсный нагрев Rohon-Beard нейронов сопровождался ударом хвоста у трансфецированной рыбы, тогда как контрольная рыба (не обладающая каналами caTRPA1) не реагировала на лазерный нагрев.

Работа представляет результаты комплексного совместного исследования российских ученых из МГУ имени М.В.Ломоносова, Института биоорганической химии им (ИБХ РАН), Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (ИВНД и НФ РАН).

Справочно:
Термогенетика — новая перспективная междисциплинарная область науки, суть которой заключается в принудительной и целенаправленной температурной активации физиологической деятельности клеток, в частности нейронов, за счет использования термочувствительных катионных каналов (TRP), генетически встроенных в мембраны этих клеток. До недавнего времени широкое применение этой техники было ограничено невысокой чувствительности известных термоканалов, а также низкого пространственно-временного разрешения методики их активации при стандартном нагреве среды или использовании химических агентов. Термогенетика обладает большими перспективами в области управления физиологической активностью клеток. Методы термогенетики не привязаны к спектрам поглощения хромофоров, лежащих в видимой области спектра, как это реализовано в оптогенетике. В связи с этим возникает возможность выбирать центральную длину волны лазерного излучения в окне прозрачности биологической ткани для осуществления стимуляции глубоких слоев. Используемые нами термочувствительные каналы caTRPA1 змеи не являются селективными по ионам, поэтому обладают проводимостью на несколько порядков превышающую проводимость популярных каналов семейства канал-родопсин ChR оптогенетики. Каналы caTRPA1 осуществляют в основном ток катионов кальция через мембрану, что позволяет управлять распространенной в живых организмах системой сигналинга, основанной на концентрации катионов кальция. На сегодняшний момент с этой задачей методы оптогенетики справляются плохо. На практике это может быть реализовано как малоинвазивная стимуляция тканей (нейронов, клеток сердца, клеток надпочечников и т.д.) для активации или ингибирования физиологического ответа клеток.

Термогенетики — что это? | Woman’s Time

Термогеники — это диетические добавки, которые помогают сжигать жир. Не удивительно, что именно они обладают наибольшей силой привлекать … зрение к полке магазина. Их можно найти под несколькими другими названиями, одно из которых — «сжигатель жира». Ярким примером среди них является термогенный жиросжигатель T6 Thermo Blitz от Nuke Nutrition.

Жиросжигатели можно разделить на синтетические и натуральные. Далее речь пойдёт о естественной термогенике.

Термогеники в первую очередь ответственны за усиление термогенеза, который отвечает за скорость метаболизма.

Термогеники способствуют увеличению этого показателя.

Некоторые жиросжигатели работают по другому механизму — механизму потери воды. За счёт повышенного диуреза или повышенного потоотделения удастся похудеть именно за счёт потери воды.

Ещё один способ похудеть с помощью пищевых добавок — это стимуляция. В свою очередь, они позитивно влияют на более эффективные тренировки — будет больше сил, энергии и мотивации после приёма пищевой добавки.

Натуральные жиросжигатели — это в основном экстракты различных растений, а также продукты, в которых естественным образом присутствует кофеин.

Природные термогеники растений включают экстракты:

— крапива;

— перец зелёный;

— чай зелёный;

— кофе;

— горький апельсин;

— корень одуванчика;

— цикорий.

Природным термогенным средством также является мате, экстракт виноградных косточек или гуарана.

Трудно сказать, какой из природных термогеников является лучшим или самым сильным сжигателем жира, потому что они работают по схожим принципам. Каждый из этих жиросжигателей предназначен для увеличения потребления энергии или уменьшения количества воды в организме.

Кофеин — это встречающийся в природе алкалоид, содержащийся в кофе и чае. Его задача — стимулировать тело к физическим и умственным упражнениям. Стимулирует нервную систему, преодолевая усталость и пониженную готовность к упражнениям. Кофеин может также увеличить метаболизм жиров или усилить термогенез тела.

Экстракт крапивы обыкновенной избавляет организм от лишней воды, то есть обладает мочегонными свойствами.

И чёрный перец, и кайенский перец (кайенский) влияют на термогенез и ускоряют сжигание жира.

Chili Fat Burner работает аналогичным образом. Это связано с наличием капсаицина, в кайенском перцею и пиперина, в чёрном перце. Экстракты этих двух растений также обладают противовоспалительным и иммуностимулирующим действием.

Экстракт чёрного апельсина, также может ускорять метаболизм, вызывая потерю жира. Он также отвечает за снижение аппетита и повышение энергии.

Сжигателем жира также является экстракт зелёного чая, который выполняет эту роль в первую очередь благодаря присутствию кофеина и катехина EGCG (галлат эпигаллокатехина).

Термогенетика вместо оптогенетики — vechnayamolodost.ru

Управлять нейронной сетью можно с помощью инфракрасного излучения

Полит.ру

Сотрудники Института биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН совместно с коллегами из Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН и Московского государственного университета разработали метод стимуляции нервных клеток инфракрасным излучением.

Для этого они встроили в нейроны мышей (в культуре клеток) и живых мальков данио рерио змеиные белки, реагирующих на температуру – терморецепторы. Опубликованные в журнале Nature Communications результаты (Ermakova et al., Thermogenetic neurostimulation with single-cell resolution) помогут без вживления в организм стимулировать нейронные сети в глубоких слоях тканей, а также управлять активностью других типов клеток в живых системах. В будущем это может помочь в терапии различных заболеваний нервной системы. Кратко о результатах работы сообщается в пресс-релизе ИБХ РАН.

«Ученых давно интересовал вопрос о том, как можно «точечно» управлять нейронами, – рассказывает Юлия Ермакова, сотрудница Лаборатории молекулярных технологий ИБХ РАН, первый автор статьи. – В 1979 году Френсис Крик, один из первооткрывателей структуры ДНК, высказал предположение, что главным вызовом в нейробиологии является создание методов, которые позволяли бы стимулировать определенный тип нервных клеток, в то время как другие клетки оставались бы нечувствительными к стимулу. Электроды и лекарства с этим не справлялись – слишком грубые и неточные инструменты. Крик считал, что для этих целей подойдет свет. Осуществить идею ученого удалось лишь в 2005 году, когда группа исследователей из Стэнфордского университета под руководством Карла Диссерота смогла изменить нейроны генно-инженерными способами и возбудить нервные клетки, облучив их светом. Этот метод назвали оптогенетикой – сочетание оптики и генетики».

Нейроны приобретают чувствительность к свету благодаря искусственно помещенным в них белкам-рецепторам, в природе они помогают живым организмам ориентироваться в окружающей среде. В зависимости от видов физического воздействия рецепторы делятся на различные классы. Так, световые сигналы воспринимаются родопсинами и фототропинами, а температурные колебания – терморецепторами семейства TRP (Transient receptor potential). Именно с их помощью мы чувствуем горячие или холодные объекты, а также вкус острой пищи или ментоловый «холодок». Терморецепторы легли в основу метода термогенетики, также позволяющего «точечно» воздействовать на нейроны длинноволновым инфракрасным излучением, гораздо глубже, по сравнению с видимым светом, проникающим в ткани.

Авторы нынешнего исследования использовали в качестве белков-рецепторов терморецепторы змей TRPA1, которые отвечают за термозрение – способность некоторых змей «видеть» теплые объекты на расстоянии. Это  помогает животным ориентироваться в пространстве и охотиться в темноте.

Первая часть экспериментов проводилась на культуре клеток-нейронов мышей. Из оптоволоконной лазерной установки на нейроны подавали инфракрасный свет. Регистрировали их активацию, измеряя поток проходящих через оболочку клетки ионов – главных участников передачи сигналов в клетке.


«Так мы установили, что активация термочувствительных каналов TRPA1 происходит в течение первых миллисекунд после подачи лазерного импульса, – объясняет Юлия. – Это позволяет применять термогенетику для быстрой стимуляции нейронов и воспроизводить сложные комбинации различных импульсов со скоростью до 50 импульсов в секунду».

Чтобы подтвердить, что термогенетика может применяться для стимуляции поведенческих реакций в живом организме (in vivo), исследователи провели эксперимент на рыбках данио (Danio rerio), которых разделили на две группы. Рыбки из экспериментальной группы имели в определенных нейронах встроенные в оболочку клетки змеиные терморецепторы TRPA1, а из контрольной – только флуоресцентную («светящуюся») метку. После этого исследователи повышали температуру тела рыбы в определенной точке с помощью пучка инфракрасного света (диаметром 60 микрометров, что чуть больше размера крупного нейрона). В ответ на это экспериментальные рыбки испытывали ложное чувство прикосновения и пытались уплыть, делая рефлекторный мах хвостом, в то время как вторая группа рыбок была совершенно не чувствительна к воздействию лазера.

Исследование включало не только биологическую, но и физическую составляющую. Для проведения термогенетической стимуляции исключительно важно нагревать живую ткань на заданную температуру, не превышающую 1-2 градуса. Недостаточный нагрев не способен активировать нейроны. Избыточный приведет к перегреву и гибели нейронов. Поэтому коллектив из МГУ под руководством Алексея Желтикова разработал метод локальной детекции температуры с помощью квантовых эффектов в микрочастицах алмазов, у которых были специальные дефекты кристаллической решетки. Такой алмаз, помещенный на кончик оптоволокна, способен измерять температуру нагреваемого образца с высокой точностью.

«Метод термогенетики открывает широкие перспективы для его использования в науке и для дальнейших разработок, – говорит Всеволод Белоусов, руководитель исследования, заведующий Лабораторией молекулярных технологий ИБХ РАН. – Во-первых, ИК-излучение глубже проникает в ткань, а значит, появится возможность стимулировать более глубокие слои мозга. Более того, для нагрева можно использовать не только инфракрасное излучение, но и фокусированные СВЧ-волны или магниты высокой мощности. Во-вторых, термогенетика имеет огромное преимущество в работе с маленькими модельными животными, такими, как мальки рыб или плодовые мушки. В классических оптогенетических экспериментах они видят синий свет, используемый для активации нейронов, и пугаются его. ИК-излучение для них невидимо, поэтому можно не опасаться побочных реакций животного на яркий свет. В-третьих, полученный молекулярный и технический инструментарий можно использовать для активации не только нейронов, но и других клеток. Все вместе это приведет к появлению новых подходов к терапевтической стимуляции или, наоборот, подавлению функций различных клеток в организме».

Оптогенетика делает первые шаги в этой области, теперь к ней присоединится и термогенетика, выведенная этой работой на новый уровень.

Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
 23.05.2017


Российские ученые создали новое направление науки — Российская газета

В российской науке произошла сенсация. Наши ученые застолбили новое направление в науке — термогенетику. А если конкретно, то ими впервые в мире создан принципиально новый инструмент для управления мозгом. Он позволит проводить уникальные эксперименты по изучению мозга, понять, по каким законам он работает, лечить многие патологии. Статья об этой работе группы ученых из Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова опубликована в одном из самых престижных научных журналов Nature Communications.

Знаменитый Фрэнсис Крик, который вместе с Джеймсом Уотсоном удостоен Нобелевской премии за открытие двойной спирали ДНК, почти 40 лет назад говорил, что главное в науке о мозге — это создание методов для управления его работой. Иными словами, надо уметь активизировать или тормозить работу нейронов. И только в 2005 году эта идея была воплощена американскими учеными из Стэнфордского университета. Они управляли нейронами с помощью света. Чтобы сделать их чувствительными к свету, в геном нейрона встроили специальные белки, которые в природе помогают живым организмам ориентироваться в окружающей среде. Так родилась наука оптогенетика, которая сейчас бурно развивается. Нашими учеными сделан следующий, не менее революционный шаг.

— Для управления нейронами мы используем не свет, а температуру, — сказал корреспонденту «РГ» директор Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, член-корреспондент РАН Павел Балабан. — Для этого в нейроны мышей генетически встроили белки змей, которые отвечают за так называемое «термозрение» — способность рептилий «видеть» теплые объекты на расстоянии. Что, кстати, им помогает хорошо ориентироваться и охотиться в темноте. Эксперименты показали, что изменяя температуру, можно избирательно управлять активностью нейронов животных.

По словам Павла Балабана, термогенетика уже сегодня открывает принципиально новые возможности в медицине, например, в лечении эпилепсии. Ведь в момент припадка температура в очаге повышается, но если в нейроны человека встроить «систему торможения», то припадок можно купировать. Вполне возможно, что термогенетика поможет помочь прояснить суть феномена сознания. Дело в том, что во время медленного сна температура мозга падает на целых два градуса, а главное, отключается сознание. Наблюдая за ночным поведением нейронов, ученые надеются понять, что же происходит в этот момент в мозге. А может, даже разобраться с сознанием.

Вполне возможно, что термогенетика поможет прояснить суть феномена сознания

Чтобы опередить конкурентов и стать безоговорочными лидерами в термогенетике, российским ученым удалось решить две принципиальные задачи. Во-первых, создать особую генетическую конструкцию, которая встраивается в нейрон. «Мы собираем ее в определенной последовательности из тысяч нуклеиновых кислот, причем если хотя бы одна занимает не то положение, то ничего работать не будет, — объясняет Балабан. — Конструкция должна проникнуть через мембраны клетки нейрона, встроиться в его геном, дать старт для наработки белка змеи. Только тогда нейрон начинает реагировать на изменение температуры. Чтобы найти оптимальный вариант конструкции, пришлось перебрать несколько десятков версий».

Вторую задачу решили физики МГУ. Дело в том, что управлять температурой нейрона надо очень осторожно. Если его недогреть, то он может неактивизироваться, а перегрев приведет к его гибели. Коллектив физиков под руководством Алексея Желтикова разработал высокоточный метод измерения температуры с помощью квантовых эффектов в микрочастицах алмазов.

Но это не только прорывное исследование российских ученых, но и парадоксальное. По словам Павла Балабана, оно выполнено, по сути, в инициативном порядке, с мизерным финансированием. «Фонды, которые выдают крупные гранты, требуют, чтобы мы нашли инвесторов для софинансирования, — сетует Балабан. — Но кто же согласится вкладываться в сугубо фундаментальные исследования? Желающих не видно. Не сомневаюсь, что совсем скоро по дороге, которую мы нашли, ринутся ведущие лаборатории мира, и мы из лидеров превратимся в аутсайдеров. Как это уже нередко бывало в нашей науке».

технологий для контроля активности клеток-мишеней в интактных нейронных цепях

Abstract

В последние годы возрос интерес к способности манипулировать с точностью во времени электрической активностью определенных нейронов, встроенных в плотно подключенные мозговые цепи. чтобы выявить, как определенные нейроны подчиняются поведению и нейронным вычислениям, и открыть новые горизонты в клиническом лечении заболеваний головного мозга. Технологии, которые позволяют точно контролировать электрическую активность определенных нейронов, а не соседей этих нейронов, чьи клеточные тела или процессы могут находиться на расстоянии от десятков до сотен нанометров, должны включать два компонента.Во-первых, они требуют в качестве триггера переходного импульса энергии, который поддерживает точность управления во времени. Во-вторых, они требуют молекулярного сенсибилизатора, который может быть экспрессирован в определенных нейронах и который делает эти нейроны специфически чувствительными к доставляемой запускающей энергии. Оптогенетические инструменты, такие как микробные опсины, можно использовать для активации или подавления нейронной активности с помощью коротких световых импульсов. Термогенетические инструменты, такие как термочувствительные каналы TRP, могут использоваться для управления нейронной активностью после повышения или понижения температуры.Здесь мы обсуждаем принципы, лежащие в основе работы этих двух недавно разработанных, но широко используемых наборов инструментов, а также направления, предпринимаемые при использовании и улучшении этих наборов инструментов.

Введение

На протяжении всей истории нейробиологии технологии управления или подавления электрической активности нейронов в определенной области мозга доказали свою важность для выявления причинной роли, которую нейроны, расположенные внутри или посылающие проекции, играют в этой области мозга. восприятие, познание и поведение.Такие стратегии также выявили много новых мишеней для лечения нервных расстройств и даже поддержали новые терапевтические методы для прямого медицинского использования. Методологии, способные к такой модуляции региональной нервной активности, включают электрическую нервную стимуляцию [1-4], магнитную стимуляцию [5], фармакологическую модуляцию [6], стимуляцию инфракрасным светом [7] и ультразвуковую стимуляцию [8,9], среди многих других. . В последние годы возрос интерес к способности точно во времени управлять электрической активностью определенных нейронов, встроенных в область мозга с плотными связями.Даже небольшой объем нервной ткани может содержать сотни различных типов нейронов (и многие виды не нейрональных клеток), которые обладают различным молекулярным составом, морфологией и связями. Возможность контролировать электрическую активность определенного подмножества нейронов, встроенных в сеть, позволит причинно оценить роль, которую это подмножество играет в работе сети. Кроме того, различные неврологические и психические расстройства связаны с изменениями в разных типах клеток, что позволяет предположить, что поиск новых нейронных мишеней для лечения расстройств и разработка новых терапевтических методов могут выиграть от понимания того, как изменить электрическую активность конкретных клетки, встроенные в плотную нейронную сеть.

Технологии, которые позволяют точно во времени контролировать электрическую активность конкретных нейронов, а не соседей этих нейронов (чьи клеточные тела или процессы могут находиться на расстоянии от десятков до сотен нанометров), должны обладать определенными свойствами. Во-первых, они должны включать запускающий сигнал — форму энергии, доставляемую в мозг, возможно, целенаправленно, — которая поддерживает временную точность управления. Во-вторых, важно доставить молекулярный сенсибилизатор, способный реагировать на инициирующую энергию и приводить к точному изменению нервного напряжения, к конкретному типу исследуемого нейрона.Энергия запуска, в таком случае, не должна существенно взаимодействовать с соседними нейронами — важный критерий, который, как мы увидим ниже, может потребовать обширной проверки для подтверждения. Наконец, молекулярный сенсибилизатор наиболее легко нацелен на данный тип нейрона и устойчиво экспрессируется в нем, если он генетически закодирован, так что нацеливание и экспрессия могут использовать преимущества разнообразия вирусных, трансгенных животных и других технологий доставки генов, которые обычно используются для доставки генов к конкретным типам клеток.Здесь мы описываем, как эти принципы привели к появлению двух широко используемых наборов инструментов, которые позволяют целенаправленно управлять нейронами, встроенными в неповрежденные нейронные сети — инструменты оптического нейронного управления и инструменты теплового нейронного управления. Мы также обсуждаем направления развития этих месторождений в будущем.

Оптогенетические инструменты

Один набор полностью генетически закодированных молекулярных сенсибилизаторов, которые делают нейроны-мишени чувствительными к активации или заглушению светом, представляет собой набор микробных опсинов ( ), известный как «оптогенетический» набор инструментов.Эти молекулы представляют собой семимембранные белки, обнаруженные в организмах от архей до растений, которые реагируют на свет, перемещая определенные ионы с одной стороны мембраны на другую, что приводит к возникновению световых ощущений или выработке энергии; по этой причине и из-за их удивительных биофизических свойств они изучаются более 40 лет [10]. Используются три основных класса этих молекул. Управляемые светом внутрь хлоридные насосы, известные как галородопсины ( ), когда экспрессируются в нейронах, поддерживают управляемую светом гиперполяризацию нейронов.Первый из них, который будет использоваться в нейронах, галородопсин N. pharaonis [11-15], может поддерживать успокоение нейронной активности в ответ на желтый свет (, ) [16,17], хотя токи низкие. отчасти из-за плохой экспрессии и транспортировки белков, которые могут быть улучшены путем добавления последовательностей транспортировки и экспорта из калиевых каналов [18,19]. Управляемые светом внутренние неспецифические катионные каналы, известные как каналродопсины ( ) [20], при экспрессии в нейронах поддерживают управляемую светом деполяризацию нейронов; первый из них, который будет использоваться в нейронах, C.reinhardtii opsin channelrhodopsin-2, может поддерживать возбуждение потенциалов действия с использованием коротких импульсов синего света с миллисекундной шкалой времени ( ) [21]. Наконец, управляемые светом протонные насосы [22,23], такие как H. sodomense ospin archaerhodopsin-3 ( ), когда экспрессируются в нейронах, поддерживают мощную управляемую светом гиперполяризацию нейронов, достаточную для полного отключения нейроны бодрствующей мыши в ответ на желтый или зеленый свет ( ) [24].

Молекулярные сенсибилизаторы и устройства доставки энергии для оптического контроля нейронов. A , Диаграммы, изображающие ответы на свет (i) галлородопсинов (управляемые светом внутренние хлоридные насосы, которые гиперполяризуют нейроны, в которых они экспрессируются при освещении), (ii) канальных родопсинов (светоотражающий внутрь неспецифический катион каналы, которые деполяризуют нейроны, в которых они экспрессируются при освещении), и (iii) архаэродопсинов (управляемые светом протонные насосы, которые гиперполяризуют нейроны, в которых они экспрессируются при освещении). B , Электрофизиологические данные, демонстрирующие использование (i) , галлородопсина N. pharaonis, (адаптировано из [17]), (ii) , C. reinhardtii channelrhodopsin ChR2 (адаптировано из [21]) и (iii) H. sodomense archaerhodopsin Arch (адаптировано из [24]), чтобы обеспечивать контроль нервного напряжения в ответ на свет. C , Способы доставки света в мозг. (i) Хронически имплантированное оптическое волокно для вставки в мозг с соединителем наконечника, выходящим из головного мозга для легкого подключения к соответствующему наконечнику на оптическом волокне, соединенном с лазером. (ii) Массив небольших светодиодов с необработанными кристаллами ( вверху слева, , показаны два светодиода от Cree), которые могут получать беспроводное питание и управляться через небольшой (~ 1-2 грамма) радиоприемник ( внизу слева ). Волокна также могут быть соединены непосредственно со светодиодами для передачи глубокого света; Энергия излучения на концах волокна может легко превышать 200 мВт / мм. 2 ( вверху справа, внизу справа , показывая матрицу из четырнадцати светодиодов, предназначенную для нацеливания на двусторонний гиппокамп). По материалам [64]. (iii) Микро-изготовленные решетки волноводов для доставки света в несколько точек вдоль оси одного миниатюрного вставленного зонда (адаптировано из [65]).

Световые потоки или освещенность, необходимые для активации большинства этих молекул, когда они выражены на типичных уровнях, обычно попадают в диапазон 0,1-10 мВт / мм 2 , диапазон, который безопасен для использования в научных экспериментах , но достаточно высокой, чтобы фоновый свет обычно не влиял на молекулы. В настоящее время ведется множество работ по молекулярной инженерии, включая анализ генома и мутагенез, в результате чего опсины более светочувствительны (например, архаэродопсин ArchT [25], канал родопсин CatCh [26]), с большей амплитудой или медленнее истощаются (например.грамм. несколько мутантов и химер канального родопсина, включая h234R, T159C, ChRGR и ChIEF [27-31]), которые быстрее или медленнее отключаются после освещения (например, несколько мутантов канального родопсина, включая ChETA, SFO и мутант D156A [32-34]), со сдвигом цвета (например, Mac, VChR1 и MChR1 [24,35,36]) или с повышенной проницаемостью для кальция (снова CatCh [26]), с быстрыми темпами появления новых вариантов. Эти молекулярные сенсибилизаторы широко используются в организмах от C. elegans до нечеловеческих приматов [27,45,46].Хотя многие группы используют их для возмущения нейронов, они могут использоваться в глиальных клетках [47,48], а также в других тканях, таких как сердце [49,50]. Хотя этим молекулам для своей работы требуется хромофор all- trans -retinal, эта молекула, по-видимому, естественным образом существует в достаточно высоких количествах у млекопитающих, чтобы не требовать добавок; для C. elegans, Drosophila и других организмов легко получить диетические добавки, содержащие all- trans -retinal.

Другие связанные с опсином каскады свето-активируемых белков, такие как каскад фототрансдукции дрозофилы (первый полностью генетически закодированный набор инструментов, продемонстрировавший способность к оптическому нервному контролю) [37], крысиный опсин RO4 [38] и светотрансдукционный каскад. gated опсин меланопсина млекопитающих, также применялись для оптического манипулирования нервной активностью [39], хотя эти инструменты имеют более медленную кинетику, чем микробные опсины, описанные в предыдущем абзаце.В других подходах используются белки, не являющиеся опсинами, которые требуют введения химических кофакторов; это усложняет использование, но может позволить биологически определенным молекулярным событиям управлять светом. Например, оптическое химическое освобождение лигандов, которые связываются с определенными рецепторами, которые, в свою очередь, экспрессируются в определенных типах нейронов, может позволить активировать рецептор-экспрессирующие нейроны, когда импульсы УФ-света освобождают лиганды от клетки [40,41]. Также можно использовать искусственные хромофоры, которые меняют конфигурацию под воздействием света; например, привязка лиганда к рецептору или каналу через изомеризуемый светом азобензольный линкер, который ковалентно присоединен к рецептору или каналу, может позволить этому рецептору или каналу активироваться или блокироваться при освещении азобензола [41-44].Поскольку такие методологии позволяют задействовать или блокировать практически произвольные рецепторы или каналы, они могут приводить к большим и / или хорошо охарактеризованным фотомодулирующим воздействиям, но потребность в химических веществах требует метода доставки химических веществ к нервным структурам. представляет интерес.

Гены достаточно малы, чтобы соответствовать наиболее часто используемым вирусным векторам, таким как лентивирусные векторы, векторы AAV, векторы HSV и другие, используемые в нейробиологии [21,51]; кроме того, можно создать трансгенных мышей, экспрессирующих эти молекулы под определенным промотором [52]; в результате большинство обычно используемых методов доставки генов было применено для доставки этих опсинов к конкретным типам клеток.Одним из популярных методов, который использует преимущества растущего числа мышей, экспрессирующих Cre-рекомбиназу в определенных типах клеток нервной системы, является использование вируса, который кодирует последовательность опсина, фланкированную Cre-зависимыми сайтами рекомбинации (lox-сайтами), такими как что только специфические клетки, несущие рекомбиназу Cre, будут обеспечивать экспрессию опсина [53]. В последнее время начали появляться трансгенные мыши, несущие опсины, которым предшествуют транскрипционные стоп-последовательности, фланкированные сайтами lox [54], так что скрещивание такой мыши с мышью, экспрессирующей Cre в клетках желаемого типа, приведет к потомству, экспрессирующему опсин. только в ячейке желаемого типа.Методы маркировки развивающихся нейронных цепей посредством электропорации [55] и ретроградной маркировки синаптических входов в регион также были продемонстрированы [19,56].

Метод доставки энергии для оптогенетики заключается в доставке света — стратегия, которая опирается на тенденции развития технологий в оптике, в основе которых лежат самые разные области — от телекоммуникаций до дисплеев и медицинской визуализации. In vitro, то есть в нейронных культурах и срезах мозга, а также в прозрачных организмах, таких как C.elegans и рыбок данио, оптической стимуляции и подавления звука легко добиться с помощью обычной микроскопической оптики (например, флуоресцентных ламп, светодиодов и лазеров) [21]; устройства с микрозеркалами, конфокальные микроскопы и двухфотонные микроскопы также использовались для получения узорчатой ​​световой стимуляции [55,57]. Разработка основанных на сканировании и свободных от сканирования методов доставки света к периферии клеток для концентрации световой энергии на клеточной мембране, где расположены эти опсины, также делает возможной эффективную двухфотонную фотостимуляцию клеток [58-60].Кроме того, способность нацеливать опсины на определенные субклеточные компартменты будет увеличивать фокусность стимуляции как для изучения того, как части нейронов вносят вклад в общую клеточную функцию, так и для повышения способности управлять элементами цепи биофизически определенными способами [61,62] .

Для использования у млекопитающих in vivo были разработаны различные методы доставки света. Оптические волокна могут вставляться в мозг хронически, с коннектором на конце, выходящим из мозга ( ), или могут быть вставлены во время эксперимента через ранее имплантированную направляющую канюлю [63].Массивы недорогих небольших светодиодов с необработанными кристаллами могут быть изготовлены с использованием технологии изготовления печатных плат и использоваться для управления наборами поверхностных структур мозга, даже с помощью компактных, легких, беспроводных устройств питания и управления, важных для долгосрочных или сложных задач. эксперименты ( , слева) [64]. Массивы оптических волокон, напрямую соединенные с массивами светодиодов с помощью оптического клея, могут обеспечить мозаичное покрытие глубоких структур, таких как гиппокамп, светом ( , справа). Яркость светодиодов быстро улучшается, чему способствуют освещение и другие отрасли; волокна, соединенные со светодиодами с необработанными кристаллами, уже могут достигать интенсивности излучения 200 мВт / мм 2 на конце волокна для синего света.Микрофонные зонды в форме оптического волокна, состоящие из массивов параллельных волноводов, обеспечивают доставку света во многие точки вдоль оси зонда, обеспечивая более универсальное трехмерное управление цепями мозга при минимальном повреждении [65] ( ).

Хотя излучения 100-200 мВт / мм 2 обычно используются для волокон 100-200 микрон, что позволяет нацеливать ~ 1-3 мм 3 ткани в зависимости от типа опсина (требуется тщательная калибровка источников света. важно), всегда важно проводить контрольные эксперименты, чтобы гарантировать, что нагрев или другие эффекты освещения (например,g., поведенческое оповещение через сетчатку) не влияет на эксперимент. Для устройств с несколькими источниками света важна характеристика рассеяния света от набора источников. Другой важный контрольный эксперимент — убедиться, что эндогенная светочувствительность нейронов не влияет на эксперименты; недавно у C. elegans и Drosophila было обнаружено несколько наборов нейронов, обладающих внутренней светочувствительностью [66-68], что подчеркивает важность контрольных экспериментов, чтобы убедиться, что освещение не играет непосредственной роли в изменении нейронов, имеющих отношение к экспериментальный сценарий.

В первые несколько лет после выхода первой статьи об использовании микробных опсинов в нейронах эти инструменты применялись для активации определенных нейронов в нейронных цепях, чтобы увидеть, как они влияют или опосредуют пробуждение [69], обучение [70], зрение [ 71,72], соматосенсорное восприятие [73-75], движение [63,76,77] и дыхание [78]. Использование этих инструментов с годами увеличилось. Примерно за последний год оптогенетические инструменты использовались для исследования роли многих различных типов нейронов в физиологии и поведении — например, демонстрируя, что специфические пути, соединяющие две области мозга, базолатеральное ядро ​​миндалины и прилежащее ядро, при фотостимуляции может служить подкрепляющим или вознаграждающим стимулом [79], или что активация определенных нейронов в грушевидной коре, которая диффузно получает информацию от обонятельной луковицы, может быть преобразована в поведенчески значимые события посредством ассоциативного обучения [80].Хотя почти все эти статьи сосредоточены на активации или заглушении популяций от сотен до тысяч нейронов, методы фотостимуляции с более высоким разрешением и методы локализации белков, описанные выше, несомненно, увеличат количество вопросов нейронного кодирования, на которые можно ответить с помощью оптогенетических методов. инструменты в ближайшие годы.

Thermogenetics

Альтернативный класс генетически закодированных молекулярных сенсибилизаторов позволяет модулировать активность нейронов в ответ на изменения температуры [81-83], обеспечивая «термогенетический» набор инструментов.Поскольку температура влияет на все физиологические процессы, ее использование в качестве стимула для активации нейронов представляет особые проблемы. Во-первых, изменения температуры должны быть небольшими, чтобы избежать общего воздействия на возбуждение и поведение нейронов. Таким образом, термогенетические инструменты должны точно реагировать на температуру. Во-вторых, температура должна быть совместима с физиологией манипулируемого организма. Поскольку такие организмы, как мухи и мыши, действуют при разных температурах, им требуются разные термогенетические инструменты.До сих пор проблемы, присущие термогенетике, были успешно решены в Drosophila , но все еще остаются для других организмов.

Современные термогенетические подходы используют два типа молекулярных инструментов: один для ингибирования, а другой для активации. Первым широко используемым термогенетическим инструментом был ингибитор нейрональной активности на основе термочувствительной версии белка Shibire Drosophila , Dynamin GTPase, участвующего в эндоцитозе [81]. Одна аминокислотная замена в Shibire (G273D) создает доминирующий белок, Shibire ts1 , который ингибирует эндоцитоз при температурах выше ~ 29 ° C [81,84].В синапсе это влияет на рециклинг синаптических пузырьков и быстро подавляет химическую передачу [84,85]. Тормозящие эффекты Shibire ts1 наблюдаются в широком спектре клеток и сохраняются в течение всего периода повышения температуры. Кроме того, начало ингибирования и выход из него происходит относительно быстро, в течение нескольких минут после изменения температуры. Эти благоприятные свойства привели к широко распространенному и очень успешному применению специфической для клеточного типа экспрессии Shibire ts1 в качестве метода рассечения нервных цепей у Drosophila [86].Однако Dynamin влияет на многие жизненно важные процессы, помимо высвобождения нейромедиаторов, включая поглощение питательных веществ и рецептор-опосредованный эндоцитоз, критический элемент Notch, Wnt, эпидермального фактора роста и других межклеточных сигнальных путей [87]. Кроме того, связь, опосредованная щелевыми соединениями, должна оставаться работоспособной во время возмущений, опосредованных Shibire ts1 . Таким образом, хотя Shibire ts1 обеспечивает мощный инструмент для нарушения клеточной функции, желательны термогенетические инструменты, которые более конкретно нацелены на нейронную активность и которые модулируют электрическую, а также химическую коммуникацию.

Недавно такой набор термогенетических инструментов для модуляции возбудимости нейронов был разработан с использованием исключительной тепловой чувствительности thermoTRPs (). ThermoTRP — это катионные каналы семейства Transient Receptor Potential (TRP), проводимость которых резко меняется с температурой [88,89]. Их тепловая чувствительность такова, что нейрон, экспрессирующий thermoTRP, может переключаться с молчания на устойчиво активный в ответ на температурные сдвиги от 1 до 2 ° C [82,90].Это позволяет конкретную активацию выбранных нейронов, сводя к минимуму другие потенциальные тепловые эффекты на свойства цепи. Две дополнительные функции делают thermoTRP особенно полезными в качестве инструментов для активации нейронов. Во-первых, проводимость одного канала thermoTRP примерно на три порядка больше, чем проводимость канала родопсина (50-100 пСм для TRP против 40-60 фс для ChR2 [91,92]). Эта ~ 1000-кратная большая активность означает, что термоTRPs вызывают устойчивую деполяризацию при более низких уровнях экспрессии.Способность thermoTRPs управлять устойчивой активацией при умеренных уровнях экспрессии означает, что даже относительно слабые промоторы могут быть использованы в термогенетике. Кроме того, низкий уровень экспрессии сводит к минимуму потенциальную токсичность, связанную с экспрессией экзогенных белков. Во-вторых, хотя проникновение света в мозг небольшого непрозрачного животного, такого как плодовая муха, является сложной задачей, тепловые стимулы могут быть доставлены путем нагрева окружающей среды, который прост в доставке и неинвазивен. К сожалению, селективность по ионам thermoTRP ограничила их роль активацией нейронов.Необходима разработка подобного набора термогенетических заглушающих агентов.

Молекулярные сенсибилизаторы и устройства доставки энергии для теплового контроля нейронов. A , Диаграммы, изображающие реакции на изменения температуры (i) активируемого теплом канала dTRPA1 и (ii) активируемого холодом канала rTRPM8. И dTRPA1, и rTRPM8 представляют собой неселективные катионные каналы с высокой проводимостью, которые деполяризуют клетки при соответствующей термической стимуляции. B , Электрофизиологические данные, демонстрирующие использование dTRPA1 для управления мотонейроном мух (адаптировано из [83]).EJP: потенциал возбуждающего соединения постсинаптической мышцы-мишени. C , Методы тепловой стимуляции головного мозга. (i) Изменения температуры окружающей среды обычно используются для управления термогенетическими инструментами в Drosophila . (ii) Опосредованное магнитным полем нагревание наночастиц MnFe 2 O 4 было предложено в качестве возможной стратегии доставки локальной тепловой стимуляции в мозг млекопитающих [106]. (iii) Сфокусированный ультразвук — это мощная стратегия локального разогрева тканей в глубине мозга млекопитающих, и его потенциально можно адаптировать для управления термогенетическими инструментами.

К настоящему времени разработаны два инструмента на основе thermoTRP для использования в Drosophila : крысиный TRPM8 (rTRPM8) [83] и Drosophila melanogaster TRPA1 (dTRPA1) [82] (). rTRPM8 — это канал, чувствительный к холоду, активируемый ниже ~ 25 ° C в гетерологичных клетках [93,94], в то время как dTRPA1 является чувствительным к теплу каналом, активным при температуре выше ~ 25 ° C [95]. На практике для надежной активации нейронов мух с помощью rTRPM8 требуется охлаждение животного до ≤18 ° ​​C [83], температуры, совместимой со многими типами поведения, но обычно это мухи вызывают отвращение [96].dTRPA1 может активировать нейроны мух при более умеренных температурах [82], облегчая его применение в поведенческих исследованиях (). В мотонейронах мух, например, dTRPA1 запускает активацию, начиная с ~ 25 ° C [82,90] (), в предпочтительном для мух диапазоне температур ~ 24-27 ° C [82,96]. На практике температура, используемая для выявления поведения с dTRPA1, может варьироваться от 25 ° C до 31 ° C или выше [97-101]. Это изменение может отражать различия в уровнях dTRPA1, возникающие в результате использования разных промоторов для управления экспрессией, или вариации в интенсивности, с которой данный нейрон должен стимулироваться для получения наблюдаемого поведения.Кроме того, эти различия могут также отражать зависимые от контекста вариации в пороге dTRPA1, поскольку порог thermoTRP может модулироваться напряжением, передачей сигналов G-белков и фосфолипидов и посттрансляционной модификацией [89]. Важно отметить, что активация, опосредованная dTRPA1, является устойчивой и устойчивой. Физиологические измерения выявляют небольшую десенсибилизацию опосредованной dTRPA1 активации двигательных нейронов даже через 20 минут при 27 ° C [90], а поведенческие данные свидетельствуют о том, что dTRPA1 может активировать нейроны в мозге мух в течение как минимум трех дней [97].Взятые вместе, способность dTRPA1 активировать различные нейроны под контролем широкого спектра промоторов, его устойчивость к инактивации, его чувствительность к умеренным температурам и простота доставки тепловых стимулов в совокупности сделали dTRPA1 наиболее широко используемым инструментом для управления нейронами. активация в Drosophila .

Хотя термогенетика является мощной стратегией активации, ограничением является то, что ей не хватает миллисекундного временного разрешения оптогенетических инструментов [102].На сегодняшний день в приложениях thermoTRPs активируют нейроны в течение секунд [82,90] (), вероятно, отражая кинетику нагрева и охлаждения тканей. Однако thermoTRP способны реагировать гораздо быстрее; например, у млекопитающих thermoTRP TRPV1 отвечает с постоянной времени ~ 5 мсек на скачок температуры, запускаемый инфракрасным лазером [103]. Это открывает интересную возможность использования термогенетики для достижения парной стимуляции, впервые продемонстрированной Claridge-Chang et al., [104]. Эти исследователи использовали систему P2X 2 , в которой канал активируется с помощью лазерной стимуляции извлечения клеточного АТФ, введенного в муху, для парной активации определенного набора нейронов с воздействием второго стимула, в их случае запаха. [Кларидж-Чанг, 2009 № 9}. Можно представить себе достижение аналогичных эффектов с помощью термогенетики, используя лазеры или другие подходы к быстрому нагреву для достижения активации thermoTRP.

В то время как термогенетика, по крайней мере, применительно к настоящему моменту, не привела к формированию моделей активности с точной временной структурой, контроль с высоким разрешением модели всплесков не требуется для многих приложений, включая изучение влияния активности на развитие [99] или связывание активации специфические нейроны к поведенческим выходам [97,98,100,101].Последний в настоящее время является основным применением термогенетики у Drosophila . Его надежность и простота изменили не только функциональный анализ ранее идентифицированных нейронов, но и позволили разработать новые подходы к картированию цепей [100,101]. Эти подходы используют мощную систему Gal4 / UAS для управления экспрессией, специфичной для определенного типа клеток, для экспрессии dTRPA1 в различных подмножествах клеток, делая их активируемыми температурой. Затем исследователь проверяет функцию этих клеток, согревая мух и исследуя их поведение.Два недавних исследования использовали эту стратегию для анализа схемы, контролирующей ухаживание [100,101]. Эти исследования первоначально подтвердили предыдущие работы, в которых дистанционное управление активацией бесплодно экспрессирующих нейронов с использованием системы P2X 2 вызывало ухаживания [105]. Затем в этих исследованиях использовалась термогенетическая стимуляция на основе TRPA1 для сортировки ~ 800 различных штаммов Gal4 и ~ 475 различных генетически мозаичных индивидуумов для выявления конкретных подмножеств нейронов, управляющих определенными аспектами ухаживания [100,101].Мало того, что надежность и техническая простота TRPA1-опосредованной активации нейронов значительно облегчают такое крупномасштабное термогенетическое картирование цепей, относительно ограниченные вложения в оборудование, обучение и материалы, необходимые для выполнения таких манипуляций, делают его легко доступным для широкого круга студентов и исследователи. Ожидается, что этот метод термогенетического картирования будет расширен для изучения многих аспектов поведения мух, что приведет к значительному прогрессу в нашем понимании того, как цепи управляют поведением.

Распространение термогенетики на теплокровных животных, таких как млекопитающие, сталкивается с двумя основными проблемами. Во-первых, хотя разогреть мозг мухи легко, нагревание мозга неповрежденного млекопитающего требует более сложных подходов. Одно из возможных решений для локального временного нагрева мозга млекопитающих было недавно описано с использованием индуцированного радиочастотным магнитным полем нагрева конъюгированных со стрептавидином наночастиц MnFe 2 O 4 [106]. Вторая потенциальная альтернатива — сфокусированный ультразвук.Хотя обычно используется для удаления опухолей путем нагревания небольших участков внутри мозга человека (от 3 до 5 мм в диаметре), обработка ультразвуком также может использоваться для достижения умеренного нагревания [107]. Хотя оба подхода еще только зарождаются, оба подхода потенциально могут позволить целенаправленное нагревание определенных регионов нервной системы млекопитающих минимально инвазивным способом ().

Вторая проблема термогенетики млекопитающих — отсутствие соответствующих термогенетических инструментов. Критерии для термогенетических инструментов млекопитающих особенно строги: нервная система млекопитающих обычно не только работает в более узких температурных диапазонах, чем мухи, разница между нормальной температурой тела (~ 37-38 ° C) и вредными температурами, повреждающими ткани (~ 43 ° C). C) уже.Ни rTRPM8, ни dTRPA1 не совместимы с использованием у млекопитающих, поскольку их пороги активации намного ниже нормальной температуры тела ядра млекопитающих. На сегодняшний день активируемый нагреванием канал TRPV1 крысы (rTRPV1) используется для термогенетической активации культивируемых клеток млекопитающих [106]. Однако rTRPV1 обычно активируется при опасно высоких температурах,> 42 ° C [108]; такие температуры создают неоптимальную ситуацию для изучения функций и поведения схем. TRPV1 млекопитающих также имеют множество эндогенных химических агонистов, включая анандимид, протоны и продукты липоксигеназы [89], что еще больше усложняет их использование в качестве термогенетических инструментов.Чтобы разрешить широкое применение термогенетики у млекопитающих, требуются термоТРП с более подходящими свойствами. Можно ожидать, что в этом отношении будет полезен как анализ генома для новых thermoTRP, так и мутагенез существующих thermoTRP.

Стоит ли развивать термогенетику млекопитающих, учитывая высокий уровень оптогенетики млекопитающих? На практическом уровне высокая проводимость thermoTRPs по сравнению с канальными родопсинами должна позволить thermoTRPs активировать широкий спектр клеток при умеренных уровнях экспрессии.Кроме того, возможность активации термогенетических инструментов без необходимости имплантации источника света делает их потенциально хорошо подходящими для приложений, требующих глубокой стимуляции мозга. Наконец, возможность действительно неинвазивной активации также повышает вероятность того, что термогенетическая стимуляция может использоваться во многих различных областях мозга одного животного одновременно или последовательно. Вместе эти подходы могут ускорить и потенциально преобразовать характеристику и манипулирование свойствами и функцией цепей млекопитающих, обеспечивая полезное дополнение к оптогенетическим подходам.

Сноски

Заявление издателя: Это PDF-файл неотредактированной рукописи, принятой к публикации. В качестве услуги для наших клиентов мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергнута копированию, верстке и рассмотрению полученного доказательства, прежде чем она будет опубликована в окончательной форме для цитирования. Обратите внимание, что во время производственного процесса могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержание, и все юридические оговорки, относящиеся к журналу, имеют отношение.

ДОКУМЕНТЫ, ОТМЕЧЕННЫЕ КАК СПЕЦИАЛЬНЫЕ (**, очень; *, несколько)

** Градинару В. и др., Молекулярные и клеточные подходы для диверсификации и расширения оптогенетики. Cell, 2010. 141 (1): с. 154-65.

— В этой статье продемонстрирован ряд методов улучшения оборота галородопсинов, иллюстрирующих стратегии улучшения экспрессии опсина по сравнению с диким типом.

** Чоу, Б.Я. и др., Высокоэффективное генетически нацеленное оптическое нейронное молчание с помощью световых протонных насосов.Nature, 2010. 463 (7277): с. 98-102.

— Эта статья продемонстрировала, что световые протонные насосы могут использоваться для подавления нейронов.

* Kleinlogel, S., et al., Ультра светочувствительная и быстрая активация нейронов с помощью Ca (2 +) — проницаемого канала родопсина CatCh. Nat Neurosci, 2011. 14 (4): с. 513-8.

— В этой статье обнаружен канальный родопсин с повышенной проницаемостью для кальция.

* Lin, J.Y., et al., Характеристика сконструированных вариантов канального родопсина с улучшенными свойствами и кинетикой.Biophys J, 2009. 96 (5): с. 1803-14.

— В этой статье показано, что химеры канальных родопсинов могут иметь значительно улучшенную кинетику по сравнению с химерами дикого типа.

* Хан, X. и др., Оптический контроль нейронной динамики в мозгу нечеловеческих приматов в миллисекундном масштабе времени. Нейрон, 2009. 62 (2): с. 191-8.

— Эта статья продемонстрировала, что оптогенетические инструменты могут быть использованы на нечеловеческих приматах, что важно для доклинических испытаний этих технологий в качестве потенциальных методов лечения.

* Атасой, Д., et al., переключатель FLEX нацелен на Channelrhodopsin-2 на несколько типов клеток для визуализации и картирования цепей на больших расстояниях. J. Neurosci, 2008. 28 (28): с. 7025-30.

— В этой статье представлена ​​универсальная и популярная вирусная система для нацеливания опсинов на нейроны трансгенных мышей, которые экспрессируют рекомбиназу Cre в определенных типах клеток.

* Андрасфальви Б.К., Земельман Б.В., Тан Дж., Вазири А: Двухфотонный одноклеточный оптогенетический контроль нейрональной активности с помощью скульптурного света. Proc Natl Acad Sci U S. A 2010, 107: 11981-11986.

— В этой статье описан метод нацеливания на определенные нейроны для активации с помощью двухфотонной микроскопии.

* Гринберг К.П., Фам А., Верблин Ф.С.: Дифференциальное нацеливание оптических нейромодуляторов на сомы и дендриты ганглиозных клеток позволяет динамически контролировать антагонизм между центром и окружающим пространством. Нейрон 2011, 69: 713-720.

— Эта статья продемонстрировала способ нацеливания опсинов на различные части клетки, чтобы позволить дендритам или аксонам дифференцированно стимулироваться или ингибироваться.

** Хамада, Ф.Н. и др., Внутренний термодатчик, контролирующий предпочтение температуры у дрозофилы. Природа, 2008. 454 (7201): с. 217-20.

** Peabody, N.C., et al., Характеристика сети принятия решений для расширения крыла у Drosophila с использованием целевой экспрессии канала TRPM8. J. Neurosci, 2009. 29 (11): стр. 3343-53.

— Эти две статьи представили термогенетику, продемонстрировав полезность терморегулируемых каналов TRP в качестве инструментов для контроля нейрональной активности у интактных животных.Hamada et al. представили Drosophila melanogaster TRPA1 в качестве инструмента, позволяющего активацию нейронов теплом, в то время как Peabody et al. представила крысу TRPM8 в качестве инструмента, позволяющего активировать холодную активацию.

** Pulver, S.R., et al., Временная динамика нейрональной активации каналомродопсином-2 и TRPA1 определяет поведенческий выход у личинок дрозофилы. J Neurophysiol, 2009. 101 (6): с. 3075-88.

— В этой статье представлен подробный электрофизиологический анализ того, как термогенетические манипуляции на основе dTRPA1 модулируют активность нейронов.Он также обеспечивает параллельное сравнение термогенетических и оптогенетических подходов к активации как на электрофизиологическом, так и на поведенческом уровнях.

* Carrillo, R.A., et al., Пресинаптическая активность и CaMKII модулируют ретроградную передачу сигналов семафорина и синаптическую очистку. Нейрон, 2010. 68 (1): с. 32-44.

— В этой статье dTRPA1 используется для изучения эффектов структурированной низкочастотной активации нейронов на развитие нейронных связей. Авт. Ловко достигают долгосрочной паттернированной активации, повышая экспрессию dTRPA1 животных в термоциклере.

** von Philipsborn, A.C., et al., Нейронный контроль ухаживающей песни дрозофилы . Нейрон, 2011. 69 (3): с. 509-22.

** Кохацу, С., М. Коганезава и Д. Ямамото, Женский контакт активирует мужские интернейроны, которые запускают стереотипное ухаживание у дрозофилы. Нейрон, 2011. 69 (3): с. 498-508.

— Эти две статьи демонстрируют, как термогенетика на основе dTRPA1 может быть использована для крупномасштабных усилий по обнаружению и анализу нейронных цепей, управляющих определенным поведением.Базовый подход состоит в том, чтобы экспрессировать dTRPA1 во многих различных типах клеток, а затем определить, какие паттерны приводят к желаемому поведению в зависимости от потепления. В этих двух исследованиях экспрессия dTRPA1 используется для изучения поведенческих последствий активации различных подмножеств нейронов, экспрессирующих Fruitless, фактор транскрипции, регулирующий ухаживание. фон Филипсборн и др. также создают много полезных новых штаммов мух, которые позволяют дальнейшее уточнение паттернов экспрессии dTRPA1 с использованием основанных на FLP пересекающихся подходов.

технологий для управления активностью клеток-мишеней в интактных нейронных цепях

Аннотация

В последние годы возрос интерес к способности точно во времени управлять электрической активностью определенных нейронов, встроенных в плотно подключенные мозговые цепи. , чтобы выявить, как определенные нейроны подчиняются поведению и нейронным вычислениям, и открыть новые горизонты в клиническом лечении заболеваний головного мозга. Технологии, которые позволяют точно контролировать электрическую активность определенных нейронов, а не соседей этих нейронов, чьи клеточные тела или процессы могут находиться на расстоянии от десятков до сотен нанометров, должны включать два компонента.Во-первых, они требуют в качестве триггера переходного импульса энергии, который поддерживает точность управления во времени. Во-вторых, они требуют молекулярного сенсибилизатора, который может быть экспрессирован в определенных нейронах и который делает эти нейроны специфически чувствительными к доставляемой запускающей энергии. Оптогенетические инструменты, такие как микробные опсины, можно использовать для активации или подавления нейронной активности с помощью коротких световых импульсов. Термогенетические инструменты, такие как термочувствительные каналы TRP, могут использоваться для управления нейронной активностью после повышения или понижения температуры.Здесь мы обсуждаем принципы, лежащие в основе работы этих двух недавно разработанных, но широко используемых наборов инструментов, а также направления, предпринимаемые при использовании и улучшении этих наборов инструментов.

Введение

На протяжении всей истории нейробиологии технологии управления или подавления электрической активности нейронов в определенной области мозга доказали свою важность для выявления причинной роли, которую нейроны, расположенные внутри или посылающие проекции, играют в этой области мозга. восприятие, познание и поведение.Такие стратегии также выявили много новых мишеней для лечения нервных расстройств и даже поддержали новые терапевтические методы для прямого медицинского использования. Методологии, способные к такой модуляции региональной нервной активности, включают электрическую нервную стимуляцию [1-4], магнитную стимуляцию [5], фармакологическую модуляцию [6], стимуляцию инфракрасным светом [7] и ультразвуковую стимуляцию [8,9], среди многих других. . В последние годы возрос интерес к способности точно во времени управлять электрической активностью определенных нейронов, встроенных в область мозга с плотными связями.Даже небольшой объем нервной ткани может содержать сотни различных типов нейронов (и многие виды не нейрональных клеток), которые обладают различным молекулярным составом, морфологией и связями. Возможность контролировать электрическую активность определенного подмножества нейронов, встроенных в сеть, позволит причинно оценить роль, которую это подмножество играет в работе сети. Кроме того, различные неврологические и психические расстройства связаны с изменениями в разных типах клеток, что позволяет предположить, что поиск новых нейронных мишеней для лечения расстройств и разработка новых терапевтических методов могут выиграть от понимания того, как изменить электрическую активность конкретных клетки, встроенные в плотную нейронную сеть.

Технологии, которые позволяют точно во времени контролировать электрическую активность конкретных нейронов, а не соседей этих нейронов (чьи клеточные тела или процессы могут находиться на расстоянии от десятков до сотен нанометров), должны обладать определенными свойствами. Во-первых, они должны включать запускающий сигнал — форму энергии, доставляемую в мозг, возможно, целенаправленно, — которая поддерживает временную точность управления. Во-вторых, важно доставить молекулярный сенсибилизатор, способный реагировать на инициирующую энергию и приводить к точному изменению нервного напряжения, к конкретному типу исследуемого нейрона.Энергия запуска, в таком случае, не должна существенно взаимодействовать с соседними нейронами — важный критерий, который, как мы увидим ниже, может потребовать обширной проверки для подтверждения. Наконец, молекулярный сенсибилизатор наиболее легко нацелен на данный тип нейрона и устойчиво экспрессируется в нем, если он генетически закодирован, так что нацеливание и экспрессия могут использовать преимущества разнообразия вирусных, трансгенных животных и других технологий доставки генов, которые обычно используются для доставки генов к конкретным типам клеток.Здесь мы описываем, как эти принципы привели к появлению двух широко используемых наборов инструментов, которые позволяют целенаправленно управлять нейронами, встроенными в неповрежденные нейронные сети — инструменты оптического нейронного управления и инструменты теплового нейронного управления. Мы также обсуждаем направления развития этих месторождений в будущем.

Оптогенетические инструменты

Один набор полностью генетически закодированных молекулярных сенсибилизаторов, которые делают нейроны-мишени чувствительными к активации или заглушению светом, представляет собой набор микробных опсинов ( ), известный как «оптогенетический» набор инструментов.Эти молекулы представляют собой семимембранные белки, обнаруженные в организмах от архей до растений, которые реагируют на свет, перемещая определенные ионы с одной стороны мембраны на другую, что приводит к возникновению световых ощущений или выработке энергии; по этой причине и из-за их удивительных биофизических свойств они изучаются более 40 лет [10]. Используются три основных класса этих молекул. Управляемые светом внутрь хлоридные насосы, известные как галородопсины ( ), когда экспрессируются в нейронах, поддерживают управляемую светом гиперполяризацию нейронов.Первый из них, который будет использоваться в нейронах, галородопсин N. pharaonis [11-15], может поддерживать успокоение нейронной активности в ответ на желтый свет (, ) [16,17], хотя токи низкие. отчасти из-за плохой экспрессии и транспортировки белков, которые могут быть улучшены путем добавления последовательностей транспортировки и экспорта из калиевых каналов [18,19]. Управляемые светом внутренние неспецифические катионные каналы, известные как каналродопсины ( ) [20], при экспрессии в нейронах поддерживают управляемую светом деполяризацию нейронов; первый из них, который будет использоваться в нейронах, C.reinhardtii opsin channelrhodopsin-2, может поддерживать возбуждение потенциалов действия с использованием коротких импульсов синего света с миллисекундной шкалой времени ( ) [21]. Наконец, управляемые светом протонные насосы [22,23], такие как H. sodomense ospin archaerhodopsin-3 ( ), когда экспрессируются в нейронах, поддерживают мощную управляемую светом гиперполяризацию нейронов, достаточную для полного отключения нейроны бодрствующей мыши в ответ на желтый или зеленый свет ( ) [24].

Молекулярные сенсибилизаторы и устройства доставки энергии для оптического контроля нейронов. A , Диаграммы, изображающие ответы на свет (i) галлородопсинов (управляемые светом внутренние хлоридные насосы, которые гиперполяризуют нейроны, в которых они экспрессируются при освещении), (ii) канальных родопсинов (светоотражающий внутрь неспецифический катион каналы, которые деполяризуют нейроны, в которых они экспрессируются при освещении), и (iii) архаэродопсинов (управляемые светом протонные насосы, которые гиперполяризуют нейроны, в которых они экспрессируются при освещении). B , Электрофизиологические данные, демонстрирующие использование (i) , галлородопсина N. pharaonis, (адаптировано из [17]), (ii) , C. reinhardtii channelrhodopsin ChR2 (адаптировано из [21]) и (iii) H. sodomense archaerhodopsin Arch (адаптировано из [24]), чтобы обеспечивать контроль нервного напряжения в ответ на свет. C , Способы доставки света в мозг. (i) Хронически имплантированное оптическое волокно для вставки в мозг с соединителем наконечника, выходящим из головного мозга для легкого подключения к соответствующему наконечнику на оптическом волокне, соединенном с лазером. (ii) Массив небольших светодиодов с необработанными кристаллами ( вверху слева, , показаны два светодиода от Cree), которые могут получать беспроводное питание и управляться через небольшой (~ 1-2 грамма) радиоприемник ( внизу слева ). Волокна также могут быть соединены непосредственно со светодиодами для передачи глубокого света; Энергия излучения на концах волокна может легко превышать 200 мВт / мм. 2 ( вверху справа, внизу справа , показывая матрицу из четырнадцати светодиодов, предназначенную для нацеливания на двусторонний гиппокамп). По материалам [64]. (iii) Микро-изготовленные решетки волноводов для доставки света в несколько точек вдоль оси одного миниатюрного вставленного зонда (адаптировано из [65]).

Световые потоки или освещенность, необходимые для активации большинства этих молекул, когда они выражены на типичных уровнях, обычно попадают в диапазон 0,1-10 мВт / мм 2 , диапазон, который безопасен для использования в научных экспериментах , но достаточно высокой, чтобы фоновый свет обычно не влиял на молекулы. В настоящее время ведется множество работ по молекулярной инженерии, включая анализ генома и мутагенез, в результате чего опсины более светочувствительны (например, архаэродопсин ArchT [25], канал родопсин CatCh [26]), с большей амплитудой или медленнее истощаются (например.грамм. несколько мутантов и химер канального родопсина, включая h234R, T159C, ChRGR и ChIEF [27-31]), которые быстрее или медленнее отключаются после освещения (например, несколько мутантов канального родопсина, включая ChETA, SFO и мутант D156A [32-34]), со сдвигом цвета (например, Mac, VChR1 и MChR1 [24,35,36]) или с повышенной проницаемостью для кальция (снова CatCh [26]), с быстрыми темпами появления новых вариантов. Эти молекулярные сенсибилизаторы широко используются в организмах от C. elegans до нечеловеческих приматов [27,45,46].Хотя многие группы используют их для возмущения нейронов, они могут использоваться в глиальных клетках [47,48], а также в других тканях, таких как сердце [49,50]. Хотя этим молекулам для своей работы требуется хромофор all- trans -retinal, эта молекула, по-видимому, естественным образом существует в достаточно высоких количествах у млекопитающих, чтобы не требовать добавок; для C. elegans, Drosophila и других организмов легко получить диетические добавки, содержащие all- trans -retinal.

Другие связанные с опсином каскады свето-активируемых белков, такие как каскад фототрансдукции дрозофилы (первый полностью генетически закодированный набор инструментов, продемонстрировавший способность к оптическому нервному контролю) [37], крысиный опсин RO4 [38] и светотрансдукционный каскад. gated опсин меланопсина млекопитающих, также применялись для оптического манипулирования нервной активностью [39], хотя эти инструменты имеют более медленную кинетику, чем микробные опсины, описанные в предыдущем абзаце.В других подходах используются белки, не являющиеся опсинами, которые требуют введения химических кофакторов; это усложняет использование, но может позволить биологически определенным молекулярным событиям управлять светом. Например, оптическое химическое освобождение лигандов, которые связываются с определенными рецепторами, которые, в свою очередь, экспрессируются в определенных типах нейронов, может позволить активировать рецептор-экспрессирующие нейроны, когда импульсы УФ-света освобождают лиганды от клетки [40,41]. Также можно использовать искусственные хромофоры, которые меняют конфигурацию под воздействием света; например, привязка лиганда к рецептору или каналу через изомеризуемый светом азобензольный линкер, который ковалентно присоединен к рецептору или каналу, может позволить этому рецептору или каналу активироваться или блокироваться при освещении азобензола [41-44].Поскольку такие методологии позволяют задействовать или блокировать практически произвольные рецепторы или каналы, они могут приводить к большим и / или хорошо охарактеризованным фотомодулирующим воздействиям, но потребность в химических веществах требует метода доставки химических веществ к нервным структурам. представляет интерес.

Гены достаточно малы, чтобы соответствовать наиболее часто используемым вирусным векторам, таким как лентивирусные векторы, векторы AAV, векторы HSV и другие, используемые в нейробиологии [21,51]; кроме того, можно создать трансгенных мышей, экспрессирующих эти молекулы под определенным промотором [52]; в результате большинство обычно используемых методов доставки генов было применено для доставки этих опсинов к конкретным типам клеток.Одним из популярных методов, который использует преимущества растущего числа мышей, экспрессирующих Cre-рекомбиназу в определенных типах клеток нервной системы, является использование вируса, который кодирует последовательность опсина, фланкированную Cre-зависимыми сайтами рекомбинации (lox-сайтами), такими как что только специфические клетки, несущие рекомбиназу Cre, будут обеспечивать экспрессию опсина [53]. В последнее время начали появляться трансгенные мыши, несущие опсины, которым предшествуют транскрипционные стоп-последовательности, фланкированные сайтами lox [54], так что скрещивание такой мыши с мышью, экспрессирующей Cre в клетках желаемого типа, приведет к потомству, экспрессирующему опсин. только в ячейке желаемого типа.Методы маркировки развивающихся нейронных цепей посредством электропорации [55] и ретроградной маркировки синаптических входов в регион также были продемонстрированы [19,56].

Метод доставки энергии для оптогенетики заключается в доставке света — стратегия, которая опирается на тенденции развития технологий в оптике, в основе которых лежат самые разные области — от телекоммуникаций до дисплеев и медицинской визуализации. In vitro, то есть в нейронных культурах и срезах мозга, а также в прозрачных организмах, таких как C.elegans и рыбок данио, оптической стимуляции и подавления звука легко добиться с помощью обычной микроскопической оптики (например, флуоресцентных ламп, светодиодов и лазеров) [21]; устройства с микрозеркалами, конфокальные микроскопы и двухфотонные микроскопы также использовались для получения узорчатой ​​световой стимуляции [55,57]. Разработка основанных на сканировании и свободных от сканирования методов доставки света к периферии клеток для концентрации световой энергии на клеточной мембране, где расположены эти опсины, также делает возможной эффективную двухфотонную фотостимуляцию клеток [58-60].Кроме того, способность нацеливать опсины на определенные субклеточные компартменты будет увеличивать фокусность стимуляции как для изучения того, как части нейронов вносят вклад в общую клеточную функцию, так и для повышения способности управлять элементами цепи биофизически определенными способами [61,62] .

Для использования у млекопитающих in vivo были разработаны различные методы доставки света. Оптические волокна могут вставляться в мозг хронически, с коннектором на конце, выходящим из мозга ( ), или могут быть вставлены во время эксперимента через ранее имплантированную направляющую канюлю [63].Массивы недорогих небольших светодиодов с необработанными кристаллами могут быть изготовлены с использованием технологии изготовления печатных плат и использоваться для управления наборами поверхностных структур мозга, даже с помощью компактных, легких, беспроводных устройств питания и управления, важных для долгосрочных или сложных задач. эксперименты ( , слева) [64]. Массивы оптических волокон, напрямую соединенные с массивами светодиодов с помощью оптического клея, могут обеспечить мозаичное покрытие глубоких структур, таких как гиппокамп, светом ( , справа). Яркость светодиодов быстро улучшается, чему способствуют освещение и другие отрасли; волокна, соединенные со светодиодами с необработанными кристаллами, уже могут достигать интенсивности излучения 200 мВт / мм 2 на конце волокна для синего света.Микрофонные зонды в форме оптического волокна, состоящие из массивов параллельных волноводов, обеспечивают доставку света во многие точки вдоль оси зонда, обеспечивая более универсальное трехмерное управление цепями мозга при минимальном повреждении [65] ( ).

Хотя излучения 100-200 мВт / мм 2 обычно используются для волокон 100-200 микрон, что позволяет нацеливать ~ 1-3 мм 3 ткани в зависимости от типа опсина (требуется тщательная калибровка источников света. важно), всегда важно проводить контрольные эксперименты, чтобы гарантировать, что нагрев или другие эффекты освещения (например,g., поведенческое оповещение через сетчатку) не влияет на эксперимент. Для устройств с несколькими источниками света важна характеристика рассеяния света от набора источников. Другой важный контрольный эксперимент — убедиться, что эндогенная светочувствительность нейронов не влияет на эксперименты; недавно у C. elegans и Drosophila было обнаружено несколько наборов нейронов, обладающих внутренней светочувствительностью [66-68], что подчеркивает важность контрольных экспериментов, чтобы убедиться, что освещение не играет непосредственной роли в изменении нейронов, имеющих отношение к экспериментальный сценарий.

В первые несколько лет после выхода первой статьи об использовании микробных опсинов в нейронах эти инструменты применялись для активации определенных нейронов в нейронных цепях, чтобы увидеть, как они влияют или опосредуют пробуждение [69], обучение [70], зрение [ 71,72], соматосенсорное восприятие [73-75], движение [63,76,77] и дыхание [78]. Использование этих инструментов с годами увеличилось. Примерно за последний год оптогенетические инструменты использовались для исследования роли многих различных типов нейронов в физиологии и поведении — например, демонстрируя, что специфические пути, соединяющие две области мозга, базолатеральное ядро ​​миндалины и прилежащее ядро, при фотостимуляции может служить подкрепляющим или вознаграждающим стимулом [79], или что активация определенных нейронов в грушевидной коре, которая диффузно получает информацию от обонятельной луковицы, может быть преобразована в поведенчески значимые события посредством ассоциативного обучения [80].Хотя почти все эти статьи сосредоточены на активации или заглушении популяций от сотен до тысяч нейронов, методы фотостимуляции с более высоким разрешением и методы локализации белков, описанные выше, несомненно, увеличат количество вопросов нейронного кодирования, на которые можно ответить с помощью оптогенетических методов. инструменты в ближайшие годы.

Thermogenetics

Альтернативный класс генетически закодированных молекулярных сенсибилизаторов позволяет модулировать активность нейронов в ответ на изменения температуры [81-83], обеспечивая «термогенетический» набор инструментов.Поскольку температура влияет на все физиологические процессы, ее использование в качестве стимула для активации нейронов представляет особые проблемы. Во-первых, изменения температуры должны быть небольшими, чтобы избежать общего воздействия на возбуждение и поведение нейронов. Таким образом, термогенетические инструменты должны точно реагировать на температуру. Во-вторых, температура должна быть совместима с физиологией манипулируемого организма. Поскольку такие организмы, как мухи и мыши, действуют при разных температурах, им требуются разные термогенетические инструменты.До сих пор проблемы, присущие термогенетике, были успешно решены в Drosophila , но все еще остаются для других организмов.

Современные термогенетические подходы используют два типа молекулярных инструментов: один для ингибирования, а другой для активации. Первым широко используемым термогенетическим инструментом был ингибитор нейрональной активности на основе термочувствительной версии белка Shibire Drosophila , Dynamin GTPase, участвующего в эндоцитозе [81]. Одна аминокислотная замена в Shibire (G273D) создает доминирующий белок, Shibire ts1 , который ингибирует эндоцитоз при температурах выше ~ 29 ° C [81,84].В синапсе это влияет на рециклинг синаптических пузырьков и быстро подавляет химическую передачу [84,85]. Тормозящие эффекты Shibire ts1 наблюдаются в широком спектре клеток и сохраняются в течение всего периода повышения температуры. Кроме того, начало ингибирования и выход из него происходит относительно быстро, в течение нескольких минут после изменения температуры. Эти благоприятные свойства привели к широко распространенному и очень успешному применению специфической для клеточного типа экспрессии Shibire ts1 в качестве метода рассечения нервных цепей у Drosophila [86].Однако Dynamin влияет на многие жизненно важные процессы, помимо высвобождения нейромедиаторов, включая поглощение питательных веществ и рецептор-опосредованный эндоцитоз, критический элемент Notch, Wnt, эпидермального фактора роста и других межклеточных сигнальных путей [87]. Кроме того, связь, опосредованная щелевыми соединениями, должна оставаться работоспособной во время возмущений, опосредованных Shibire ts1 . Таким образом, хотя Shibire ts1 обеспечивает мощный инструмент для нарушения клеточной функции, желательны термогенетические инструменты, которые более конкретно нацелены на нейронную активность и которые модулируют электрическую, а также химическую коммуникацию.

Недавно такой набор термогенетических инструментов для модуляции возбудимости нейронов был разработан с использованием исключительной тепловой чувствительности thermoTRPs (). ThermoTRP — это катионные каналы семейства Transient Receptor Potential (TRP), проводимость которых резко меняется с температурой [88,89]. Их тепловая чувствительность такова, что нейрон, экспрессирующий thermoTRP, может переключаться с молчания на устойчиво активный в ответ на температурные сдвиги от 1 до 2 ° C [82,90].Это позволяет конкретную активацию выбранных нейронов, сводя к минимуму другие потенциальные тепловые эффекты на свойства цепи. Две дополнительные функции делают thermoTRP особенно полезными в качестве инструментов для активации нейронов. Во-первых, проводимость одного канала thermoTRP примерно на три порядка больше, чем проводимость канала родопсина (50-100 пСм для TRP против 40-60 фс для ChR2 [91,92]). Эта ~ 1000-кратная большая активность означает, что термоTRPs вызывают устойчивую деполяризацию при более низких уровнях экспрессии.Способность thermoTRPs управлять устойчивой активацией при умеренных уровнях экспрессии означает, что даже относительно слабые промоторы могут быть использованы в термогенетике. Кроме того, низкий уровень экспрессии сводит к минимуму потенциальную токсичность, связанную с экспрессией экзогенных белков. Во-вторых, хотя проникновение света в мозг небольшого непрозрачного животного, такого как плодовая муха, является сложной задачей, тепловые стимулы могут быть доставлены путем нагрева окружающей среды, который прост в доставке и неинвазивен. К сожалению, селективность по ионам thermoTRP ограничила их роль активацией нейронов.Необходима разработка подобного набора термогенетических заглушающих агентов.

Молекулярные сенсибилизаторы и устройства доставки энергии для теплового контроля нейронов. A , Диаграммы, изображающие реакции на изменения температуры (i) активируемого теплом канала dTRPA1 и (ii) активируемого холодом канала rTRPM8. И dTRPA1, и rTRPM8 представляют собой неселективные катионные каналы с высокой проводимостью, которые деполяризуют клетки при соответствующей термической стимуляции. B , Электрофизиологические данные, демонстрирующие использование dTRPA1 для управления мотонейроном мух (адаптировано из [83]).EJP: потенциал возбуждающего соединения постсинаптической мышцы-мишени. C , Методы тепловой стимуляции головного мозга. (i) Изменения температуры окружающей среды обычно используются для управления термогенетическими инструментами в Drosophila . (ii) Опосредованное магнитным полем нагревание наночастиц MnFe 2 O 4 было предложено в качестве возможной стратегии доставки локальной тепловой стимуляции в мозг млекопитающих [106]. (iii) Сфокусированный ультразвук — это мощная стратегия локального разогрева тканей в глубине мозга млекопитающих, и его потенциально можно адаптировать для управления термогенетическими инструментами.

К настоящему времени разработаны два инструмента на основе thermoTRP для использования в Drosophila : крысиный TRPM8 (rTRPM8) [83] и Drosophila melanogaster TRPA1 (dTRPA1) [82] (). rTRPM8 — это канал, чувствительный к холоду, активируемый ниже ~ 25 ° C в гетерологичных клетках [93,94], в то время как dTRPA1 является чувствительным к теплу каналом, активным при температуре выше ~ 25 ° C [95]. На практике для надежной активации нейронов мух с помощью rTRPM8 требуется охлаждение животного до ≤18 ° ​​C [83], температуры, совместимой со многими типами поведения, но обычно это мухи вызывают отвращение [96].dTRPA1 может активировать нейроны мух при более умеренных температурах [82], облегчая его применение в поведенческих исследованиях (). В мотонейронах мух, например, dTRPA1 запускает активацию, начиная с ~ 25 ° C [82,90] (), в предпочтительном для мух диапазоне температур ~ 24-27 ° C [82,96]. На практике температура, используемая для выявления поведения с dTRPA1, может варьироваться от 25 ° C до 31 ° C или выше [97-101]. Это изменение может отражать различия в уровнях dTRPA1, возникающие в результате использования разных промоторов для управления экспрессией, или вариации в интенсивности, с которой данный нейрон должен стимулироваться для получения наблюдаемого поведения.Кроме того, эти различия могут также отражать зависимые от контекста вариации в пороге dTRPA1, поскольку порог thermoTRP может модулироваться напряжением, передачей сигналов G-белков и фосфолипидов и посттрансляционной модификацией [89]. Важно отметить, что активация, опосредованная dTRPA1, является устойчивой и устойчивой. Физиологические измерения выявляют небольшую десенсибилизацию опосредованной dTRPA1 активации двигательных нейронов даже через 20 минут при 27 ° C [90], а поведенческие данные свидетельствуют о том, что dTRPA1 может активировать нейроны в мозге мух в течение как минимум трех дней [97].Взятые вместе, способность dTRPA1 активировать различные нейроны под контролем широкого спектра промоторов, его устойчивость к инактивации, его чувствительность к умеренным температурам и простота доставки тепловых стимулов в совокупности сделали dTRPA1 наиболее широко используемым инструментом для управления нейронами. активация в Drosophila .

Хотя термогенетика является мощной стратегией активации, ограничением является то, что ей не хватает миллисекундного временного разрешения оптогенетических инструментов [102].На сегодняшний день в приложениях thermoTRPs активируют нейроны в течение секунд [82,90] (), вероятно, отражая кинетику нагрева и охлаждения тканей. Однако thermoTRP способны реагировать гораздо быстрее; например, у млекопитающих thermoTRP TRPV1 отвечает с постоянной времени ~ 5 мсек на скачок температуры, запускаемый инфракрасным лазером [103]. Это открывает интересную возможность использования термогенетики для достижения парной стимуляции, впервые продемонстрированной Claridge-Chang et al., [104]. Эти исследователи использовали систему P2X 2 , в которой канал активируется с помощью лазерной стимуляции извлечения клеточного АТФ, введенного в муху, для парной активации определенного набора нейронов с воздействием второго стимула, в их случае запаха. [Кларидж-Чанг, 2009 № 9}. Можно представить себе достижение аналогичных эффектов с помощью термогенетики, используя лазеры или другие подходы к быстрому нагреву для достижения активации thermoTRP.

В то время как термогенетика, по крайней мере, применительно к настоящему моменту, не привела к формированию моделей активности с точной временной структурой, контроль с высоким разрешением модели всплесков не требуется для многих приложений, включая изучение влияния активности на развитие [99] или связывание активации специфические нейроны к поведенческим выходам [97,98,100,101].Последний в настоящее время является основным применением термогенетики у Drosophila . Его надежность и простота изменили не только функциональный анализ ранее идентифицированных нейронов, но и позволили разработать новые подходы к картированию цепей [100,101]. Эти подходы используют мощную систему Gal4 / UAS для управления экспрессией, специфичной для определенного типа клеток, для экспрессии dTRPA1 в различных подмножествах клеток, делая их активируемыми температурой. Затем исследователь проверяет функцию этих клеток, согревая мух и исследуя их поведение.Два недавних исследования использовали эту стратегию для анализа схемы, контролирующей ухаживание [100,101]. Эти исследования первоначально подтвердили предыдущие работы, в которых дистанционное управление активацией бесплодно экспрессирующих нейронов с использованием системы P2X 2 вызывало ухаживания [105]. Затем в этих исследованиях использовалась термогенетическая стимуляция на основе TRPA1 для сортировки ~ 800 различных штаммов Gal4 и ~ 475 различных генетически мозаичных индивидуумов для выявления конкретных подмножеств нейронов, управляющих определенными аспектами ухаживания [100,101].Мало того, что надежность и техническая простота TRPA1-опосредованной активации нейронов значительно облегчают такое крупномасштабное термогенетическое картирование цепей, относительно ограниченные вложения в оборудование, обучение и материалы, необходимые для выполнения таких манипуляций, делают его легко доступным для широкого круга студентов и исследователи. Ожидается, что этот метод термогенетического картирования будет расширен для изучения многих аспектов поведения мух, что приведет к значительному прогрессу в нашем понимании того, как цепи управляют поведением.

Распространение термогенетики на теплокровных животных, таких как млекопитающие, сталкивается с двумя основными проблемами. Во-первых, хотя разогреть мозг мухи легко, нагревание мозга неповрежденного млекопитающего требует более сложных подходов. Одно из возможных решений для локального временного нагрева мозга млекопитающих было недавно описано с использованием индуцированного радиочастотным магнитным полем нагрева конъюгированных со стрептавидином наночастиц MnFe 2 O 4 [106]. Вторая потенциальная альтернатива — сфокусированный ультразвук.Хотя обычно используется для удаления опухолей путем нагревания небольших участков внутри мозга человека (от 3 до 5 мм в диаметре), обработка ультразвуком также может использоваться для достижения умеренного нагревания [107]. Хотя оба подхода еще только зарождаются, оба подхода потенциально могут позволить целенаправленное нагревание определенных регионов нервной системы млекопитающих минимально инвазивным способом ().

Вторая проблема термогенетики млекопитающих — отсутствие соответствующих термогенетических инструментов. Критерии для термогенетических инструментов млекопитающих особенно строги: нервная система млекопитающих обычно не только работает в более узких температурных диапазонах, чем мухи, разница между нормальной температурой тела (~ 37-38 ° C) и вредными температурами, повреждающими ткани (~ 43 ° C). C) уже.Ни rTRPM8, ни dTRPA1 не совместимы с использованием у млекопитающих, поскольку их пороги активации намного ниже нормальной температуры тела ядра млекопитающих. На сегодняшний день активируемый нагреванием канал TRPV1 крысы (rTRPV1) используется для термогенетической активации культивируемых клеток млекопитающих [106]. Однако rTRPV1 обычно активируется при опасно высоких температурах,> 42 ° C [108]; такие температуры создают неоптимальную ситуацию для изучения функций и поведения схем. TRPV1 млекопитающих также имеют множество эндогенных химических агонистов, включая анандимид, протоны и продукты липоксигеназы [89], что еще больше усложняет их использование в качестве термогенетических инструментов.Чтобы разрешить широкое применение термогенетики у млекопитающих, требуются термоТРП с более подходящими свойствами. Можно ожидать, что в этом отношении будет полезен как анализ генома для новых thermoTRP, так и мутагенез существующих thermoTRP.

Стоит ли развивать термогенетику млекопитающих, учитывая высокий уровень оптогенетики млекопитающих? На практическом уровне высокая проводимость thermoTRPs по сравнению с канальными родопсинами должна позволить thermoTRPs активировать широкий спектр клеток при умеренных уровнях экспрессии.Кроме того, возможность активации термогенетических инструментов без необходимости имплантации источника света делает их потенциально хорошо подходящими для приложений, требующих глубокой стимуляции мозга. Наконец, возможность действительно неинвазивной активации также повышает вероятность того, что термогенетическая стимуляция может использоваться во многих различных областях мозга одного животного одновременно или последовательно. Вместе эти подходы могут ускорить и потенциально преобразовать характеристику и манипулирование свойствами и функцией цепей млекопитающих, обеспечивая полезное дополнение к оптогенетическим подходам.

Сноски

Заявление издателя: Это PDF-файл неотредактированной рукописи, принятой к публикации. В качестве услуги для наших клиентов мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергнута копированию, верстке и рассмотрению полученного доказательства, прежде чем она будет опубликована в окончательной форме для цитирования. Обратите внимание, что во время производственного процесса могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержание, и все юридические оговорки, относящиеся к журналу, имеют отношение.

ДОКУМЕНТЫ, ОТМЕЧЕННЫЕ КАК СПЕЦИАЛЬНЫЕ (**, очень; *, несколько)

** Градинару В. и др., Молекулярные и клеточные подходы для диверсификации и расширения оптогенетики. Cell, 2010. 141 (1): с. 154-65.

— В этой статье продемонстрирован ряд методов улучшения оборота галородопсинов, иллюстрирующих стратегии улучшения экспрессии опсина по сравнению с диким типом.

** Чоу, Б.Я. и др., Высокоэффективное генетически нацеленное оптическое нейронное молчание с помощью световых протонных насосов.Nature, 2010. 463 (7277): с. 98-102.

— Эта статья продемонстрировала, что световые протонные насосы могут использоваться для подавления нейронов.

* Kleinlogel, S., et al., Ультра светочувствительная и быстрая активация нейронов с помощью Ca (2 +) — проницаемого канала родопсина CatCh. Nat Neurosci, 2011. 14 (4): с. 513-8.

— В этой статье обнаружен канальный родопсин с повышенной проницаемостью для кальция.

* Lin, J.Y., et al., Характеристика сконструированных вариантов канального родопсина с улучшенными свойствами и кинетикой.Biophys J, 2009. 96 (5): с. 1803-14.

— В этой статье показано, что химеры канальных родопсинов могут иметь значительно улучшенную кинетику по сравнению с химерами дикого типа.

* Хан, X. и др., Оптический контроль нейронной динамики в мозгу нечеловеческих приматов в миллисекундном масштабе времени. Нейрон, 2009. 62 (2): с. 191-8.

— Эта статья продемонстрировала, что оптогенетические инструменты могут быть использованы на нечеловеческих приматах, что важно для доклинических испытаний этих технологий в качестве потенциальных методов лечения.

* Атасой, Д., et al., переключатель FLEX нацелен на Channelrhodopsin-2 на несколько типов клеток для визуализации и картирования цепей на больших расстояниях. J. Neurosci, 2008. 28 (28): с. 7025-30.

— В этой статье представлена ​​универсальная и популярная вирусная система для нацеливания опсинов на нейроны трансгенных мышей, которые экспрессируют рекомбиназу Cre в определенных типах клеток.

* Андрасфальви Б.К., Земельман Б.В., Тан Дж., Вазири А: Двухфотонный одноклеточный оптогенетический контроль нейрональной активности с помощью скульптурного света. Proc Natl Acad Sci U S. A 2010, 107: 11981-11986.

— В этой статье описан метод нацеливания на определенные нейроны для активации с помощью двухфотонной микроскопии.

* Гринберг К.П., Фам А., Верблин Ф.С.: Дифференциальное нацеливание оптических нейромодуляторов на сомы и дендриты ганглиозных клеток позволяет динамически контролировать антагонизм между центром и окружающим пространством. Нейрон 2011, 69: 713-720.

— Эта статья продемонстрировала способ нацеливания опсинов на различные части клетки, чтобы позволить дендритам или аксонам дифференцированно стимулироваться или ингибироваться.

** Хамада, Ф.Н. и др., Внутренний термодатчик, контролирующий предпочтение температуры у дрозофилы. Природа, 2008. 454 (7201): с. 217-20.

** Peabody, N.C., et al., Характеристика сети принятия решений для расширения крыла у Drosophila с использованием целевой экспрессии канала TRPM8. J. Neurosci, 2009. 29 (11): стр. 3343-53.

— Эти две статьи представили термогенетику, продемонстрировав полезность терморегулируемых каналов TRP в качестве инструментов для контроля нейрональной активности у интактных животных.Hamada et al. представили Drosophila melanogaster TRPA1 в качестве инструмента, позволяющего активацию нейронов теплом, в то время как Peabody et al. представила крысу TRPM8 в качестве инструмента, позволяющего активировать холодную активацию.

** Pulver, S.R., et al., Временная динамика нейрональной активации каналомродопсином-2 и TRPA1 определяет поведенческий выход у личинок дрозофилы. J Neurophysiol, 2009. 101 (6): с. 3075-88.

— В этой статье представлен подробный электрофизиологический анализ того, как термогенетические манипуляции на основе dTRPA1 модулируют активность нейронов.Он также обеспечивает параллельное сравнение термогенетических и оптогенетических подходов к активации как на электрофизиологическом, так и на поведенческом уровнях.

* Carrillo, R.A., et al., Пресинаптическая активность и CaMKII модулируют ретроградную передачу сигналов семафорина и синаптическую очистку. Нейрон, 2010. 68 (1): с. 32-44.

— В этой статье dTRPA1 используется для изучения эффектов структурированной низкочастотной активации нейронов на развитие нейронных связей. Авт. Ловко достигают долгосрочной паттернированной активации, повышая экспрессию dTRPA1 животных в термоциклере.

** von Philipsborn, A.C., et al., Нейронный контроль ухаживающей песни дрозофилы . Нейрон, 2011. 69 (3): с. 509-22.

** Кохацу, С., М. Коганезава и Д. Ямамото, Женский контакт активирует мужские интернейроны, которые запускают стереотипное ухаживание у дрозофилы. Нейрон, 2011. 69 (3): с. 498-508.

— Эти две статьи демонстрируют, как термогенетика на основе dTRPA1 может быть использована для крупномасштабных усилий по обнаружению и анализу нейронных цепей, управляющих определенным поведением.Базовый подход состоит в том, чтобы экспрессировать dTRPA1 во многих различных типах клеток, а затем определить, какие паттерны приводят к желаемому поведению в зависимости от потепления. В этих двух исследованиях экспрессия dTRPA1 используется для изучения поведенческих последствий активации различных подмножеств нейронов, экспрессирующих Fruitless, фактор транскрипции, регулирующий ухаживание. фон Филипсборн и др. также создают много полезных новых штаммов мух, которые позволяют дальнейшее уточнение паттернов экспрессии dTRPA1 с использованием основанных на FLP пересекающихся подходов.

технологий для управления активностью клеток-мишеней в интактных нейронных цепях

Аннотация

В последние годы возрос интерес к способности точно во времени управлять электрической активностью определенных нейронов, встроенных в плотно подключенные мозговые цепи. , чтобы выявить, как определенные нейроны подчиняются поведению и нейронным вычислениям, и открыть новые горизонты в клиническом лечении заболеваний головного мозга. Технологии, которые позволяют точно контролировать электрическую активность определенных нейронов, а не соседей этих нейронов, чьи клеточные тела или процессы могут находиться на расстоянии от десятков до сотен нанометров, должны включать два компонента.Во-первых, они требуют в качестве триггера переходного импульса энергии, который поддерживает точность управления во времени. Во-вторых, они требуют молекулярного сенсибилизатора, который может быть экспрессирован в определенных нейронах и который делает эти нейроны специфически чувствительными к доставляемой запускающей энергии. Оптогенетические инструменты, такие как микробные опсины, можно использовать для активации или подавления нейронной активности с помощью коротких световых импульсов. Термогенетические инструменты, такие как термочувствительные каналы TRP, могут использоваться для управления нейронной активностью после повышения или понижения температуры.Здесь мы обсуждаем принципы, лежащие в основе работы этих двух недавно разработанных, но широко используемых наборов инструментов, а также направления, предпринимаемые при использовании и улучшении этих наборов инструментов.

Введение

На протяжении всей истории нейробиологии технологии управления или подавления электрической активности нейронов в определенной области мозга доказали свою важность для выявления причинной роли, которую нейроны, расположенные внутри или посылающие проекции, играют в этой области мозга. восприятие, познание и поведение.Такие стратегии также выявили много новых мишеней для лечения нервных расстройств и даже поддержали новые терапевтические методы для прямого медицинского использования. Методологии, способные к такой модуляции региональной нервной активности, включают электрическую нервную стимуляцию [1-4], магнитную стимуляцию [5], фармакологическую модуляцию [6], стимуляцию инфракрасным светом [7] и ультразвуковую стимуляцию [8,9], среди многих других. . В последние годы возрос интерес к способности точно во времени управлять электрической активностью определенных нейронов, встроенных в область мозга с плотными связями.Даже небольшой объем нервной ткани может содержать сотни различных типов нейронов (и многие виды не нейрональных клеток), которые обладают различным молекулярным составом, морфологией и связями. Возможность контролировать электрическую активность определенного подмножества нейронов, встроенных в сеть, позволит причинно оценить роль, которую это подмножество играет в работе сети. Кроме того, различные неврологические и психические расстройства связаны с изменениями в разных типах клеток, что позволяет предположить, что поиск новых нейронных мишеней для лечения расстройств и разработка новых терапевтических методов могут выиграть от понимания того, как изменить электрическую активность конкретных клетки, встроенные в плотную нейронную сеть.

Технологии, которые позволяют точно во времени контролировать электрическую активность конкретных нейронов, а не соседей этих нейронов (чьи клеточные тела или процессы могут находиться на расстоянии от десятков до сотен нанометров), должны обладать определенными свойствами. Во-первых, они должны включать запускающий сигнал — форму энергии, доставляемую в мозг, возможно, целенаправленно, — которая поддерживает временную точность управления. Во-вторых, важно доставить молекулярный сенсибилизатор, способный реагировать на инициирующую энергию и приводить к точному изменению нервного напряжения, к конкретному типу исследуемого нейрона.Энергия запуска, в таком случае, не должна существенно взаимодействовать с соседними нейронами — важный критерий, который, как мы увидим ниже, может потребовать обширной проверки для подтверждения. Наконец, молекулярный сенсибилизатор наиболее легко нацелен на данный тип нейрона и устойчиво экспрессируется в нем, если он генетически закодирован, так что нацеливание и экспрессия могут использовать преимущества разнообразия вирусных, трансгенных животных и других технологий доставки генов, которые обычно используются для доставки генов к конкретным типам клеток.Здесь мы описываем, как эти принципы привели к появлению двух широко используемых наборов инструментов, которые позволяют целенаправленно управлять нейронами, встроенными в неповрежденные нейронные сети — инструменты оптического нейронного управления и инструменты теплового нейронного управления. Мы также обсуждаем направления развития этих месторождений в будущем.

Оптогенетические инструменты

Один набор полностью генетически закодированных молекулярных сенсибилизаторов, которые делают нейроны-мишени чувствительными к активации или заглушению светом, представляет собой набор микробных опсинов ( ), известный как «оптогенетический» набор инструментов.Эти молекулы представляют собой семимембранные белки, обнаруженные в организмах от архей до растений, которые реагируют на свет, перемещая определенные ионы с одной стороны мембраны на другую, что приводит к возникновению световых ощущений или выработке энергии; по этой причине и из-за их удивительных биофизических свойств они изучаются более 40 лет [10]. Используются три основных класса этих молекул. Управляемые светом внутрь хлоридные насосы, известные как галородопсины ( ), когда экспрессируются в нейронах, поддерживают управляемую светом гиперполяризацию нейронов.Первый из них, который будет использоваться в нейронах, галородопсин N. pharaonis [11-15], может поддерживать успокоение нейронной активности в ответ на желтый свет (, ) [16,17], хотя токи низкие. отчасти из-за плохой экспрессии и транспортировки белков, которые могут быть улучшены путем добавления последовательностей транспортировки и экспорта из калиевых каналов [18,19]. Управляемые светом внутренние неспецифические катионные каналы, известные как каналродопсины ( ) [20], при экспрессии в нейронах поддерживают управляемую светом деполяризацию нейронов; первый из них, который будет использоваться в нейронах, C.reinhardtii opsin channelrhodopsin-2, может поддерживать возбуждение потенциалов действия с использованием коротких импульсов синего света с миллисекундной шкалой времени ( ) [21]. Наконец, управляемые светом протонные насосы [22,23], такие как H. sodomense ospin archaerhodopsin-3 ( ), когда экспрессируются в нейронах, поддерживают мощную управляемую светом гиперполяризацию нейронов, достаточную для полного отключения нейроны бодрствующей мыши в ответ на желтый или зеленый свет ( ) [24].

Молекулярные сенсибилизаторы и устройства доставки энергии для оптического контроля нейронов. A , Диаграммы, изображающие ответы на свет (i) галлородопсинов (управляемые светом внутренние хлоридные насосы, которые гиперполяризуют нейроны, в которых они экспрессируются при освещении), (ii) канальных родопсинов (светоотражающий внутрь неспецифический катион каналы, которые деполяризуют нейроны, в которых они экспрессируются при освещении), и (iii) архаэродопсинов (управляемые светом протонные насосы, которые гиперполяризуют нейроны, в которых они экспрессируются при освещении). B , Электрофизиологические данные, демонстрирующие использование (i) , галлородопсина N. pharaonis, (адаптировано из [17]), (ii) , C. reinhardtii channelrhodopsin ChR2 (адаптировано из [21]) и (iii) H. sodomense archaerhodopsin Arch (адаптировано из [24]), чтобы обеспечивать контроль нервного напряжения в ответ на свет. C , Способы доставки света в мозг. (i) Хронически имплантированное оптическое волокно для вставки в мозг с соединителем наконечника, выходящим из головного мозга для легкого подключения к соответствующему наконечнику на оптическом волокне, соединенном с лазером. (ii) Массив небольших светодиодов с необработанными кристаллами ( вверху слева, , показаны два светодиода от Cree), которые могут получать беспроводное питание и управляться через небольшой (~ 1-2 грамма) радиоприемник ( внизу слева ). Волокна также могут быть соединены непосредственно со светодиодами для передачи глубокого света; Энергия излучения на концах волокна может легко превышать 200 мВт / мм. 2 ( вверху справа, внизу справа , показывая матрицу из четырнадцати светодиодов, предназначенную для нацеливания на двусторонний гиппокамп). По материалам [64]. (iii) Микро-изготовленные решетки волноводов для доставки света в несколько точек вдоль оси одного миниатюрного вставленного зонда (адаптировано из [65]).

Световые потоки или освещенность, необходимые для активации большинства этих молекул, когда они выражены на типичных уровнях, обычно попадают в диапазон 0,1-10 мВт / мм 2 , диапазон, который безопасен для использования в научных экспериментах , но достаточно высокой, чтобы фоновый свет обычно не влиял на молекулы. В настоящее время ведется множество работ по молекулярной инженерии, включая анализ генома и мутагенез, в результате чего опсины более светочувствительны (например, архаэродопсин ArchT [25], канал родопсин CatCh [26]), с большей амплитудой или медленнее истощаются (например.грамм. несколько мутантов и химер канального родопсина, включая h234R, T159C, ChRGR и ChIEF [27-31]), которые быстрее или медленнее отключаются после освещения (например, несколько мутантов канального родопсина, включая ChETA, SFO и мутант D156A [32-34]), со сдвигом цвета (например, Mac, VChR1 и MChR1 [24,35,36]) или с повышенной проницаемостью для кальция (снова CatCh [26]), с быстрыми темпами появления новых вариантов. Эти молекулярные сенсибилизаторы широко используются в организмах от C. elegans до нечеловеческих приматов [27,45,46].Хотя многие группы используют их для возмущения нейронов, они могут использоваться в глиальных клетках [47,48], а также в других тканях, таких как сердце [49,50]. Хотя этим молекулам для своей работы требуется хромофор all- trans -retinal, эта молекула, по-видимому, естественным образом существует в достаточно высоких количествах у млекопитающих, чтобы не требовать добавок; для C. elegans, Drosophila и других организмов легко получить диетические добавки, содержащие all- trans -retinal.

Другие связанные с опсином каскады свето-активируемых белков, такие как каскад фототрансдукции дрозофилы (первый полностью генетически закодированный набор инструментов, продемонстрировавший способность к оптическому нервному контролю) [37], крысиный опсин RO4 [38] и светотрансдукционный каскад. gated опсин меланопсина млекопитающих, также применялись для оптического манипулирования нервной активностью [39], хотя эти инструменты имеют более медленную кинетику, чем микробные опсины, описанные в предыдущем абзаце.В других подходах используются белки, не являющиеся опсинами, которые требуют введения химических кофакторов; это усложняет использование, но может позволить биологически определенным молекулярным событиям управлять светом. Например, оптическое химическое освобождение лигандов, которые связываются с определенными рецепторами, которые, в свою очередь, экспрессируются в определенных типах нейронов, может позволить активировать рецептор-экспрессирующие нейроны, когда импульсы УФ-света освобождают лиганды от клетки [40,41]. Также можно использовать искусственные хромофоры, которые меняют конфигурацию под воздействием света; например, привязка лиганда к рецептору или каналу через изомеризуемый светом азобензольный линкер, который ковалентно присоединен к рецептору или каналу, может позволить этому рецептору или каналу активироваться или блокироваться при освещении азобензола [41-44].Поскольку такие методологии позволяют задействовать или блокировать практически произвольные рецепторы или каналы, они могут приводить к большим и / или хорошо охарактеризованным фотомодулирующим воздействиям, но потребность в химических веществах требует метода доставки химических веществ к нервным структурам. представляет интерес.

Гены достаточно малы, чтобы соответствовать наиболее часто используемым вирусным векторам, таким как лентивирусные векторы, векторы AAV, векторы HSV и другие, используемые в нейробиологии [21,51]; кроме того, можно создать трансгенных мышей, экспрессирующих эти молекулы под определенным промотором [52]; в результате большинство обычно используемых методов доставки генов было применено для доставки этих опсинов к конкретным типам клеток.Одним из популярных методов, который использует преимущества растущего числа мышей, экспрессирующих Cre-рекомбиназу в определенных типах клеток нервной системы, является использование вируса, который кодирует последовательность опсина, фланкированную Cre-зависимыми сайтами рекомбинации (lox-сайтами), такими как что только специфические клетки, несущие рекомбиназу Cre, будут обеспечивать экспрессию опсина [53]. В последнее время начали появляться трансгенные мыши, несущие опсины, которым предшествуют транскрипционные стоп-последовательности, фланкированные сайтами lox [54], так что скрещивание такой мыши с мышью, экспрессирующей Cre в клетках желаемого типа, приведет к потомству, экспрессирующему опсин. только в ячейке желаемого типа.Методы маркировки развивающихся нейронных цепей посредством электропорации [55] и ретроградной маркировки синаптических входов в регион также были продемонстрированы [19,56].

Метод доставки энергии для оптогенетики заключается в доставке света — стратегия, которая опирается на тенденции развития технологий в оптике, в основе которых лежат самые разные области — от телекоммуникаций до дисплеев и медицинской визуализации. In vitro, то есть в нейронных культурах и срезах мозга, а также в прозрачных организмах, таких как C.elegans и рыбок данио, оптической стимуляции и подавления звука легко добиться с помощью обычной микроскопической оптики (например, флуоресцентных ламп, светодиодов и лазеров) [21]; устройства с микрозеркалами, конфокальные микроскопы и двухфотонные микроскопы также использовались для получения узорчатой ​​световой стимуляции [55,57]. Разработка основанных на сканировании и свободных от сканирования методов доставки света к периферии клеток для концентрации световой энергии на клеточной мембране, где расположены эти опсины, также делает возможной эффективную двухфотонную фотостимуляцию клеток [58-60].Кроме того, способность нацеливать опсины на определенные субклеточные компартменты будет увеличивать фокусность стимуляции как для изучения того, как части нейронов вносят вклад в общую клеточную функцию, так и для повышения способности управлять элементами цепи биофизически определенными способами [61,62] .

Для использования у млекопитающих in vivo были разработаны различные методы доставки света. Оптические волокна могут вставляться в мозг хронически, с коннектором на конце, выходящим из мозга ( ), или могут быть вставлены во время эксперимента через ранее имплантированную направляющую канюлю [63].Массивы недорогих небольших светодиодов с необработанными кристаллами могут быть изготовлены с использованием технологии изготовления печатных плат и использоваться для управления наборами поверхностных структур мозга, даже с помощью компактных, легких, беспроводных устройств питания и управления, важных для долгосрочных или сложных задач. эксперименты ( , слева) [64]. Массивы оптических волокон, напрямую соединенные с массивами светодиодов с помощью оптического клея, могут обеспечить мозаичное покрытие глубоких структур, таких как гиппокамп, светом ( , справа). Яркость светодиодов быстро улучшается, чему способствуют освещение и другие отрасли; волокна, соединенные со светодиодами с необработанными кристаллами, уже могут достигать интенсивности излучения 200 мВт / мм 2 на конце волокна для синего света.Микрофонные зонды в форме оптического волокна, состоящие из массивов параллельных волноводов, обеспечивают доставку света во многие точки вдоль оси зонда, обеспечивая более универсальное трехмерное управление цепями мозга при минимальном повреждении [65] ( ).

Хотя излучения 100-200 мВт / мм 2 обычно используются для волокон 100-200 микрон, что позволяет нацеливать ~ 1-3 мм 3 ткани в зависимости от типа опсина (требуется тщательная калибровка источников света. важно), всегда важно проводить контрольные эксперименты, чтобы гарантировать, что нагрев или другие эффекты освещения (например,g., поведенческое оповещение через сетчатку) не влияет на эксперимент. Для устройств с несколькими источниками света важна характеристика рассеяния света от набора источников. Другой важный контрольный эксперимент — убедиться, что эндогенная светочувствительность нейронов не влияет на эксперименты; недавно у C. elegans и Drosophila было обнаружено несколько наборов нейронов, обладающих внутренней светочувствительностью [66-68], что подчеркивает важность контрольных экспериментов, чтобы убедиться, что освещение не играет непосредственной роли в изменении нейронов, имеющих отношение к экспериментальный сценарий.

В первые несколько лет после выхода первой статьи об использовании микробных опсинов в нейронах эти инструменты применялись для активации определенных нейронов в нейронных цепях, чтобы увидеть, как они влияют или опосредуют пробуждение [69], обучение [70], зрение [ 71,72], соматосенсорное восприятие [73-75], движение [63,76,77] и дыхание [78]. Использование этих инструментов с годами увеличилось. Примерно за последний год оптогенетические инструменты использовались для исследования роли многих различных типов нейронов в физиологии и поведении — например, демонстрируя, что специфические пути, соединяющие две области мозга, базолатеральное ядро ​​миндалины и прилежащее ядро, при фотостимуляции может служить подкрепляющим или вознаграждающим стимулом [79], или что активация определенных нейронов в грушевидной коре, которая диффузно получает информацию от обонятельной луковицы, может быть преобразована в поведенчески значимые события посредством ассоциативного обучения [80].Хотя почти все эти статьи сосредоточены на активации или заглушении популяций от сотен до тысяч нейронов, методы фотостимуляции с более высоким разрешением и методы локализации белков, описанные выше, несомненно, увеличат количество вопросов нейронного кодирования, на которые можно ответить с помощью оптогенетических методов. инструменты в ближайшие годы.

Thermogenetics

Альтернативный класс генетически закодированных молекулярных сенсибилизаторов позволяет модулировать активность нейронов в ответ на изменения температуры [81-83], обеспечивая «термогенетический» набор инструментов.Поскольку температура влияет на все физиологические процессы, ее использование в качестве стимула для активации нейронов представляет особые проблемы. Во-первых, изменения температуры должны быть небольшими, чтобы избежать общего воздействия на возбуждение и поведение нейронов. Таким образом, термогенетические инструменты должны точно реагировать на температуру. Во-вторых, температура должна быть совместима с физиологией манипулируемого организма. Поскольку такие организмы, как мухи и мыши, действуют при разных температурах, им требуются разные термогенетические инструменты.До сих пор проблемы, присущие термогенетике, были успешно решены в Drosophila , но все еще остаются для других организмов.

Современные термогенетические подходы используют два типа молекулярных инструментов: один для ингибирования, а другой для активации. Первым широко используемым термогенетическим инструментом был ингибитор нейрональной активности на основе термочувствительной версии белка Shibire Drosophila , Dynamin GTPase, участвующего в эндоцитозе [81]. Одна аминокислотная замена в Shibire (G273D) создает доминирующий белок, Shibire ts1 , который ингибирует эндоцитоз при температурах выше ~ 29 ° C [81,84].В синапсе это влияет на рециклинг синаптических пузырьков и быстро подавляет химическую передачу [84,85]. Тормозящие эффекты Shibire ts1 наблюдаются в широком спектре клеток и сохраняются в течение всего периода повышения температуры. Кроме того, начало ингибирования и выход из него происходит относительно быстро, в течение нескольких минут после изменения температуры. Эти благоприятные свойства привели к широко распространенному и очень успешному применению специфической для клеточного типа экспрессии Shibire ts1 в качестве метода рассечения нервных цепей у Drosophila [86].Однако Dynamin влияет на многие жизненно важные процессы, помимо высвобождения нейромедиаторов, включая поглощение питательных веществ и рецептор-опосредованный эндоцитоз, критический элемент Notch, Wnt, эпидермального фактора роста и других межклеточных сигнальных путей [87]. Кроме того, связь, опосредованная щелевыми соединениями, должна оставаться работоспособной во время возмущений, опосредованных Shibire ts1 . Таким образом, хотя Shibire ts1 обеспечивает мощный инструмент для нарушения клеточной функции, желательны термогенетические инструменты, которые более конкретно нацелены на нейронную активность и которые модулируют электрическую, а также химическую коммуникацию.

Недавно такой набор термогенетических инструментов для модуляции возбудимости нейронов был разработан с использованием исключительной тепловой чувствительности thermoTRPs (). ThermoTRP — это катионные каналы семейства Transient Receptor Potential (TRP), проводимость которых резко меняется с температурой [88,89]. Их тепловая чувствительность такова, что нейрон, экспрессирующий thermoTRP, может переключаться с молчания на устойчиво активный в ответ на температурные сдвиги от 1 до 2 ° C [82,90].Это позволяет конкретную активацию выбранных нейронов, сводя к минимуму другие потенциальные тепловые эффекты на свойства цепи. Две дополнительные функции делают thermoTRP особенно полезными в качестве инструментов для активации нейронов. Во-первых, проводимость одного канала thermoTRP примерно на три порядка больше, чем проводимость канала родопсина (50-100 пСм для TRP против 40-60 фс для ChR2 [91,92]). Эта ~ 1000-кратная большая активность означает, что термоTRPs вызывают устойчивую деполяризацию при более низких уровнях экспрессии.Способность thermoTRPs управлять устойчивой активацией при умеренных уровнях экспрессии означает, что даже относительно слабые промоторы могут быть использованы в термогенетике. Кроме того, низкий уровень экспрессии сводит к минимуму потенциальную токсичность, связанную с экспрессией экзогенных белков. Во-вторых, хотя проникновение света в мозг небольшого непрозрачного животного, такого как плодовая муха, является сложной задачей, тепловые стимулы могут быть доставлены путем нагрева окружающей среды, который прост в доставке и неинвазивен. К сожалению, селективность по ионам thermoTRP ограничила их роль активацией нейронов.Необходима разработка подобного набора термогенетических заглушающих агентов.

Молекулярные сенсибилизаторы и устройства доставки энергии для теплового контроля нейронов. A , Диаграммы, изображающие реакции на изменения температуры (i) активируемого теплом канала dTRPA1 и (ii) активируемого холодом канала rTRPM8. И dTRPA1, и rTRPM8 представляют собой неселективные катионные каналы с высокой проводимостью, которые деполяризуют клетки при соответствующей термической стимуляции. B , Электрофизиологические данные, демонстрирующие использование dTRPA1 для управления мотонейроном мух (адаптировано из [83]).EJP: потенциал возбуждающего соединения постсинаптической мышцы-мишени. C , Методы тепловой стимуляции головного мозга. (i) Изменения температуры окружающей среды обычно используются для управления термогенетическими инструментами в Drosophila . (ii) Опосредованное магнитным полем нагревание наночастиц MnFe 2 O 4 было предложено в качестве возможной стратегии доставки локальной тепловой стимуляции в мозг млекопитающих [106]. (iii) Сфокусированный ультразвук — это мощная стратегия локального разогрева тканей в глубине мозга млекопитающих, и его потенциально можно адаптировать для управления термогенетическими инструментами.

К настоящему времени разработаны два инструмента на основе thermoTRP для использования в Drosophila : крысиный TRPM8 (rTRPM8) [83] и Drosophila melanogaster TRPA1 (dTRPA1) [82] (). rTRPM8 — это канал, чувствительный к холоду, активируемый ниже ~ 25 ° C в гетерологичных клетках [93,94], в то время как dTRPA1 является чувствительным к теплу каналом, активным при температуре выше ~ 25 ° C [95]. На практике для надежной активации нейронов мух с помощью rTRPM8 требуется охлаждение животного до ≤18 ° ​​C [83], температуры, совместимой со многими типами поведения, но обычно это мухи вызывают отвращение [96].dTRPA1 может активировать нейроны мух при более умеренных температурах [82], облегчая его применение в поведенческих исследованиях (). В мотонейронах мух, например, dTRPA1 запускает активацию, начиная с ~ 25 ° C [82,90] (), в предпочтительном для мух диапазоне температур ~ 24-27 ° C [82,96]. На практике температура, используемая для выявления поведения с dTRPA1, может варьироваться от 25 ° C до 31 ° C или выше [97-101]. Это изменение может отражать различия в уровнях dTRPA1, возникающие в результате использования разных промоторов для управления экспрессией, или вариации в интенсивности, с которой данный нейрон должен стимулироваться для получения наблюдаемого поведения.Кроме того, эти различия могут также отражать зависимые от контекста вариации в пороге dTRPA1, поскольку порог thermoTRP может модулироваться напряжением, передачей сигналов G-белков и фосфолипидов и посттрансляционной модификацией [89]. Важно отметить, что активация, опосредованная dTRPA1, является устойчивой и устойчивой. Физиологические измерения выявляют небольшую десенсибилизацию опосредованной dTRPA1 активации двигательных нейронов даже через 20 минут при 27 ° C [90], а поведенческие данные свидетельствуют о том, что dTRPA1 может активировать нейроны в мозге мух в течение как минимум трех дней [97].Взятые вместе, способность dTRPA1 активировать различные нейроны под контролем широкого спектра промоторов, его устойчивость к инактивации, его чувствительность к умеренным температурам и простота доставки тепловых стимулов в совокупности сделали dTRPA1 наиболее широко используемым инструментом для управления нейронами. активация в Drosophila .

Хотя термогенетика является мощной стратегией активации, ограничением является то, что ей не хватает миллисекундного временного разрешения оптогенетических инструментов [102].На сегодняшний день в приложениях thermoTRPs активируют нейроны в течение секунд [82,90] (), вероятно, отражая кинетику нагрева и охлаждения тканей. Однако thermoTRP способны реагировать гораздо быстрее; например, у млекопитающих thermoTRP TRPV1 отвечает с постоянной времени ~ 5 мсек на скачок температуры, запускаемый инфракрасным лазером [103]. Это открывает интересную возможность использования термогенетики для достижения парной стимуляции, впервые продемонстрированной Claridge-Chang et al., [104]. Эти исследователи использовали систему P2X 2 , в которой канал активируется с помощью лазерной стимуляции извлечения клеточного АТФ, введенного в муху, для парной активации определенного набора нейронов с воздействием второго стимула, в их случае запаха. [Кларидж-Чанг, 2009 № 9}. Можно представить себе достижение аналогичных эффектов с помощью термогенетики, используя лазеры или другие подходы к быстрому нагреву для достижения активации thermoTRP.

В то время как термогенетика, по крайней мере, применительно к настоящему моменту, не привела к формированию моделей активности с точной временной структурой, контроль с высоким разрешением модели всплесков не требуется для многих приложений, включая изучение влияния активности на развитие [99] или связывание активации специфические нейроны к поведенческим выходам [97,98,100,101].Последний в настоящее время является основным применением термогенетики у Drosophila . Его надежность и простота изменили не только функциональный анализ ранее идентифицированных нейронов, но и позволили разработать новые подходы к картированию цепей [100,101]. Эти подходы используют мощную систему Gal4 / UAS для управления экспрессией, специфичной для определенного типа клеток, для экспрессии dTRPA1 в различных подмножествах клеток, делая их активируемыми температурой. Затем исследователь проверяет функцию этих клеток, согревая мух и исследуя их поведение.Два недавних исследования использовали эту стратегию для анализа схемы, контролирующей ухаживание [100,101]. Эти исследования первоначально подтвердили предыдущие работы, в которых дистанционное управление активацией бесплодно экспрессирующих нейронов с использованием системы P2X 2 вызывало ухаживания [105]. Затем в этих исследованиях использовалась термогенетическая стимуляция на основе TRPA1 для сортировки ~ 800 различных штаммов Gal4 и ~ 475 различных генетически мозаичных индивидуумов для выявления конкретных подмножеств нейронов, управляющих определенными аспектами ухаживания [100,101].Мало того, что надежность и техническая простота TRPA1-опосредованной активации нейронов значительно облегчают такое крупномасштабное термогенетическое картирование цепей, относительно ограниченные вложения в оборудование, обучение и материалы, необходимые для выполнения таких манипуляций, делают его легко доступным для широкого круга студентов и исследователи. Ожидается, что этот метод термогенетического картирования будет расширен для изучения многих аспектов поведения мух, что приведет к значительному прогрессу в нашем понимании того, как цепи управляют поведением.

Распространение термогенетики на теплокровных животных, таких как млекопитающие, сталкивается с двумя основными проблемами. Во-первых, хотя разогреть мозг мухи легко, нагревание мозга неповрежденного млекопитающего требует более сложных подходов. Одно из возможных решений для локального временного нагрева мозга млекопитающих было недавно описано с использованием индуцированного радиочастотным магнитным полем нагрева конъюгированных со стрептавидином наночастиц MnFe 2 O 4 [106]. Вторая потенциальная альтернатива — сфокусированный ультразвук.Хотя обычно используется для удаления опухолей путем нагревания небольших участков внутри мозга человека (от 3 до 5 мм в диаметре), обработка ультразвуком также может использоваться для достижения умеренного нагревания [107]. Хотя оба подхода еще только зарождаются, оба подхода потенциально могут позволить целенаправленное нагревание определенных регионов нервной системы млекопитающих минимально инвазивным способом ().

Вторая проблема термогенетики млекопитающих — отсутствие соответствующих термогенетических инструментов. Критерии для термогенетических инструментов млекопитающих особенно строги: нервная система млекопитающих обычно не только работает в более узких температурных диапазонах, чем мухи, разница между нормальной температурой тела (~ 37-38 ° C) и вредными температурами, повреждающими ткани (~ 43 ° C). C) уже.Ни rTRPM8, ни dTRPA1 не совместимы с использованием у млекопитающих, поскольку их пороги активации намного ниже нормальной температуры тела ядра млекопитающих. На сегодняшний день активируемый нагреванием канал TRPV1 крысы (rTRPV1) используется для термогенетической активации культивируемых клеток млекопитающих [106]. Однако rTRPV1 обычно активируется при опасно высоких температурах,> 42 ° C [108]; такие температуры создают неоптимальную ситуацию для изучения функций и поведения схем. TRPV1 млекопитающих также имеют множество эндогенных химических агонистов, включая анандимид, протоны и продукты липоксигеназы [89], что еще больше усложняет их использование в качестве термогенетических инструментов.Чтобы разрешить широкое применение термогенетики у млекопитающих, требуются термоТРП с более подходящими свойствами. Можно ожидать, что в этом отношении будет полезен как анализ генома для новых thermoTRP, так и мутагенез существующих thermoTRP.

Стоит ли развивать термогенетику млекопитающих, учитывая высокий уровень оптогенетики млекопитающих? На практическом уровне высокая проводимость thermoTRPs по сравнению с канальными родопсинами должна позволить thermoTRPs активировать широкий спектр клеток при умеренных уровнях экспрессии.Кроме того, возможность активации термогенетических инструментов без необходимости имплантации источника света делает их потенциально хорошо подходящими для приложений, требующих глубокой стимуляции мозга. Наконец, возможность действительно неинвазивной активации также повышает вероятность того, что термогенетическая стимуляция может использоваться во многих различных областях мозга одного животного одновременно или последовательно. Вместе эти подходы могут ускорить и потенциально преобразовать характеристику и манипулирование свойствами и функцией цепей млекопитающих, обеспечивая полезное дополнение к оптогенетическим подходам.

Сноски

Заявление издателя: Это PDF-файл неотредактированной рукописи, принятой к публикации. В качестве услуги для наших клиентов мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергнута копированию, верстке и рассмотрению полученного доказательства, прежде чем она будет опубликована в окончательной форме для цитирования. Обратите внимание, что во время производственного процесса могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержание, и все юридические оговорки, относящиеся к журналу, имеют отношение.

ДОКУМЕНТЫ, ОТМЕЧЕННЫЕ КАК СПЕЦИАЛЬНЫЕ (**, очень; *, несколько)

** Градинару В. и др., Молекулярные и клеточные подходы для диверсификации и расширения оптогенетики. Cell, 2010. 141 (1): с. 154-65.

— В этой статье продемонстрирован ряд методов улучшения оборота галородопсинов, иллюстрирующих стратегии улучшения экспрессии опсина по сравнению с диким типом.

** Чоу, Б.Я. и др., Высокоэффективное генетически нацеленное оптическое нейронное молчание с помощью световых протонных насосов.Nature, 2010. 463 (7277): с. 98-102.

— Эта статья продемонстрировала, что световые протонные насосы могут использоваться для подавления нейронов.

* Kleinlogel, S., et al., Ультра светочувствительная и быстрая активация нейронов с помощью Ca (2 +) — проницаемого канала родопсина CatCh. Nat Neurosci, 2011. 14 (4): с. 513-8.

— В этой статье обнаружен канальный родопсин с повышенной проницаемостью для кальция.

* Lin, J.Y., et al., Характеристика сконструированных вариантов канального родопсина с улучшенными свойствами и кинетикой.Biophys J, 2009. 96 (5): с. 1803-14.

— В этой статье показано, что химеры канальных родопсинов могут иметь значительно улучшенную кинетику по сравнению с химерами дикого типа.

* Хан, X. и др., Оптический контроль нейронной динамики в мозгу нечеловеческих приматов в миллисекундном масштабе времени. Нейрон, 2009. 62 (2): с. 191-8.

— Эта статья продемонстрировала, что оптогенетические инструменты могут быть использованы на нечеловеческих приматах, что важно для доклинических испытаний этих технологий в качестве потенциальных методов лечения.

* Атасой, Д., et al., переключатель FLEX нацелен на Channelrhodopsin-2 на несколько типов клеток для визуализации и картирования цепей на больших расстояниях. J. Neurosci, 2008. 28 (28): с. 7025-30.

— В этой статье представлена ​​универсальная и популярная вирусная система для нацеливания опсинов на нейроны трансгенных мышей, которые экспрессируют рекомбиназу Cre в определенных типах клеток.

* Андрасфальви Б.К., Земельман Б.В., Тан Дж., Вазири А: Двухфотонный одноклеточный оптогенетический контроль нейрональной активности с помощью скульптурного света. Proc Natl Acad Sci U S. A 2010, 107: 11981-11986.

— В этой статье описан метод нацеливания на определенные нейроны для активации с помощью двухфотонной микроскопии.

* Гринберг К.П., Фам А., Верблин Ф.С.: Дифференциальное нацеливание оптических нейромодуляторов на сомы и дендриты ганглиозных клеток позволяет динамически контролировать антагонизм между центром и окружающим пространством. Нейрон 2011, 69: 713-720.

— Эта статья продемонстрировала способ нацеливания опсинов на различные части клетки, чтобы позволить дендритам или аксонам дифференцированно стимулироваться или ингибироваться.

** Хамада, Ф.Н. и др., Внутренний термодатчик, контролирующий предпочтение температуры у дрозофилы. Природа, 2008. 454 (7201): с. 217-20.

** Peabody, N.C., et al., Характеристика сети принятия решений для расширения крыла у Drosophila с использованием целевой экспрессии канала TRPM8. J. Neurosci, 2009. 29 (11): стр. 3343-53.

— Эти две статьи представили термогенетику, продемонстрировав полезность терморегулируемых каналов TRP в качестве инструментов для контроля нейрональной активности у интактных животных.Hamada et al. представили Drosophila melanogaster TRPA1 в качестве инструмента, позволяющего активацию нейронов теплом, в то время как Peabody et al. представила крысу TRPM8 в качестве инструмента, позволяющего активировать холодную активацию.

** Pulver, S.R., et al., Временная динамика нейрональной активации каналомродопсином-2 и TRPA1 определяет поведенческий выход у личинок дрозофилы. J Neurophysiol, 2009. 101 (6): с. 3075-88.

— В этой статье представлен подробный электрофизиологический анализ того, как термогенетические манипуляции на основе dTRPA1 модулируют активность нейронов.Он также обеспечивает параллельное сравнение термогенетических и оптогенетических подходов к активации как на электрофизиологическом, так и на поведенческом уровнях.

* Carrillo, R.A., et al., Пресинаптическая активность и CaMKII модулируют ретроградную передачу сигналов семафорина и синаптическую очистку. Нейрон, 2010. 68 (1): с. 32-44.

— В этой статье dTRPA1 используется для изучения эффектов структурированной низкочастотной активации нейронов на развитие нейронных связей. Авт. Ловко достигают долгосрочной паттернированной активации, повышая экспрессию dTRPA1 животных в термоциклере.

** von Philipsborn, A.C., et al., Нейронный контроль ухаживающей песни дрозофилы . Нейрон, 2011. 69 (3): с. 509-22.

** Кохацу, С., М. Коганезава и Д. Ямамото, Женский контакт активирует мужские интернейроны, которые запускают стереотипное ухаживание у дрозофилы. Нейрон, 2011. 69 (3): с. 498-508.

— Эти две статьи демонстрируют, как термогенетика на основе dTRPA1 может быть использована для крупномасштабных усилий по обнаружению и анализу нейронных цепей, управляющих определенным поведением.Базовый подход состоит в том, чтобы экспрессировать dTRPA1 во многих различных типах клеток, а затем определить, какие паттерны приводят к желаемому поведению в зависимости от потепления. В этих двух исследованиях экспрессия dTRPA1 используется для изучения поведенческих последствий активации различных подмножеств нейронов, экспрессирующих Fruitless, фактор транскрипции, регулирующий ухаживание. фон Филипсборн и др. также создают много полезных новых штаммов мух, которые позволяют дальнейшее уточнение паттернов экспрессии dTRPA1 с использованием основанных на FLP пересекающихся подходов.

Термогенетика как новое направление в управлении активностью нейронных сетей

  • Adamantidis, AR, Zhang, F., de Lecea, L., и Deisseroth, K., «Оптогенетика: опсины и оптические интерфейсы в нейробиологии», Харб Холодного источника. Protoc. , 2014, , 815–822 (2014).

  • Bath, D. E., Stowers, J. R., Hörmann, D., et al., «FlyMAD: быстрый термогенетический контроль нейронной активности при свободном ходьбе. Drosophila », Nat.Методы , 11 , № 7, 756–762 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • Катерина, М.Дж., Розен, Т.А., Томинага, М. и др., «Гомолог капсаицина рецептора с высоким порогом вредного тепла», Nature , 398 , № 6726, 436– 441 (1999).

    CAS Статья Google ученый

  • Чен Р., Ромеро Г., Кристиансен, М. Г. и др., «Беспроводная магнитотермическая стимуляция глубокого мозга», Science , 347 , № 6229, 1477–1480 (2015).

    CAS Статья Google ученый

  • Chen, S. et al., «TRP-канал, опосредованный активацией и удалением нейронов у свободно ведущих рыбок данио», Nat. Методы , 13 , № 2, 147–150 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Чугунов, А.О., Волынский, П. Е., Крылов, Н. А. и др., «Температурно-чувствительное стробирование канала TRPV1 по результатам атомистического моделирования его транс- и юкстамембранных доменов», Sci. Отчетность , 6 , 33112 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • Кордеро-Моралес, Дж. Ф., Грачева, Э. О. и Джулиус, Д., «Цитоплазматические анкириновые повторы переходного рецепторного потенциала A1 (TRPA1) определяют чувствительность к термическим и химическим стимулам», Proc.Natl. Акад. Sci. США , 108 , № 46, E1184 – E1191 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • ДеБоу, С. и Колборн, Ф., «Измерение и регулирование температуры мозга у бодрствующих и свободно передвигающихся грызунов», Методы , 30 , № 2003, 167–171.

    CAS Статья Google ученый

  • Ермакова Ю.Г., Ланин А.А., Федотов, И. В. и др., «Термогенетическая нейростимуляция с одноклеточным разрешением», Nat. Commun. , 8 , 15362 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • Федотов И.В., Сафронов Н.А., Ермакова Ю.Г. и др. Волоконно-оптический контроль и термометрия одноэлементной термочувствительной логики. Отчетность , 5 , 15737 (2015).

    CAS Статья Google ученый

  • Гау, П., Poon, J., Ufret-Vincenty, C., et al., «Ортолог TRPV1 у рыбок данио необходим для локомоции, индуцированной высокой температурой», J. Neurosci. , 33 , № 12, 5249–5260 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • Грачева, Э. О., Кордеро-Моралес, Дж. Ф., Гонсалес-Каркация, Дж. А. и др., «Ганглионарное сплайсинг TRPV1 лежит в основе инфракрасного ощущения у летучих мышей-вампиров», Nature , 476 7358. С. 88–91 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • Грачева Е. О., Инголия Н. Т., Келли Ю. М. и др. «Молекулярные основы обнаружения змей в инфракрасном диапазоне», Nature , 464 , № 7291, 1006–1011 (2010).

    CAS Статья Google ученый

  • Хамада Ф. Н., Розенцвейг М., Канг К. и др. «Внутренний термодатчик, контролирующий предпочтение температуры у дрозофилы», Nature , 454 , 217–220 (2008).

    CAS Статья Google ученый

  • Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., et al., «Sonogenetics — это неинвазивный подход к активации нейронов Caenorhabditis elegans », Nat. Commun. , 6 , 8264 (2015).

    CAS Статья Google ученый

  • Кохацу С., Коганезава М. и Ямамото Д., «Женский контакт активирует мужские интернейроны, которые запускают стереотипное ухаживающее поведение у Drosophila », Neuron , 69 , No.3. С. 498–508 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • Ланин А.А., Федотов И.В., Ермакова Ю.Г. и др. Волоконно-оптическая электронно-спиновая резонансная термометрия одиночных нейронов, активируемых лазером, Опт. Lett. , 41 , № 23, 5563–5566 (2016a).

    CAS Статья Google ученый

  • Ланин А.А., Степанов Е.А., Тихонов Р.А. и др., «Компактная лазерная платформа для нелинейной рамановской микроскопии: мультимодальность за счет широких возможностей настройки чирпа», J. Raman Spectrosc. , 47 , 1042–1048 (2016b).

    CAS Статья Google ученый

  • Ляо, М., Цао, Э., Джулиус, Д., и Ченг, Ю., «Структура ионного канала TRPV1, определенная с помощью электронной криомикроскопии», Nature , 504 , No. 7478, 107–112 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • Лю, X., Рамирес, С., Панг, П. Т. и др., «Оптогенетическая стимуляция инграммы гиппокампа активирует воспоминание о страхе», Nature , 484 , 381–385 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • Мишра А., Салари А., Бериган Б. Р. и др. «Продукт Drosophila Gr28bD представляет собой неспецифический катионный канал, который можно использовать в качестве нового термогенетического инструмента», Sci.Реп. , 8 , № 1, 901 (2018).

    Артикул Google ученый

  • Никитин Е.С., Рощин М.В., Иерусалимский В.Н. и др. Оптогенетическая стимуляция аксонов пирамидных нейронов в зрительной коре и гиппокампе в живых срезах мозга. Высш. Nerv. Деят. , 67 , № 5, 101–108 (2017).

    Google ученый

  • Ода, М., Куроги, М., Кубо, Ю. и Сайто, О., «Чувствительность двух паралогов TRPA1 рыбок данио к химическим и термическим стимулам, проанализированная в гетерологичных системах экспрессии», Chem. Senses , 41 , № 3, 261–272 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • Paulsen, C.E., Armache, J.P., Gao, Y., et al., «Структура ионного канала TRPA1 предполагает механизмы регуляции», Nature , 525 , No.7570, 552 (2015а).

    CAS Статья Google ученый

  • Paulsen, CE, Armache, JP, Gao, Y., et al., «Структура ионного канала TRPA1 предполагает механизмы регуляции», Nature , 520 , № 7548, 511–517 (2015b ).

    CAS Статья Google ученый

  • Prakash, R., Yizhar, O., Grewe, B., et al., «Двухфотонный оптогенетический набор инструментов для быстрого ингибирования, возбуждения и бистабильной модуляции», Nat.Методы , 9 , 1171–1179 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • Пулвер, С. Р., Пашковски, С. Л., Хорнштейн, Н. Дж. И др., «Временная динамика активации нейронов каналом родопсина-2 и TRPA1 определяет поведенческий выход у личинок Drosophila », J. Neurophysiol. , 101 , № 6, 3075–3788 (2009).

    Артикул Google ученый

  • Рихтер, К.П. и Тан, X., «Фотоны и нейроны», Hear. Res. , 311 , 72–88 (2014).

    Артикул Google ученый

  • Рощин М., Ермакова Ю. Г., Ланин А. А. и др. «Термогенетическая стимуляция одиночных пирамидных нейронов неокортекса, трансфицированных каналами TRPV1-L», Neurosci. Lett. , 687 , 153–157 (2018).

    CAS Статья Google ученый

  • Сафронов Н.А., Федотов И. В., Ермакова Ю. Г. и др. Термогенетическая активация одиночных клеток под действием микроволн // Прикл. Phys. Латыши. , 106 , №16, 163702 (2015).

    Артикул Google ученый

  • Стэнли, С.А., Гагнер, Дж. Э., Даманпур, С. и др., «Радиоволновое нагревание наночастиц оксида железа может регулировать уровень глюкозы в плазме у мышей», Science , 336 , № 6081, 604–608 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • Такахаши, Н.и Мори, Ю., «Каналы TRP как датчики и интеграторы сигналов изменения окислительно-восстановительного статуса», Front. Pharmacol. , 2 , 58 (2011).

  • Tseeb, V., Suzuki, M., Oyama, K., et al., «Высокотермочувствительная динамика Ca в клетке HeLa через рецепторы IP (3)», HFSP J , 3 , № 2009. 2. С. 117–123.

    CAS Статья Google ученый

  • Воронин А.А., Желтиков А.М., «Штраф за ионизацию в нелинейно-оптическом биоимиджинге», Phys. Rev. E Stat. Нелин. Мягкий. Иметь значение. Phys , 81 , № 5, Pt 1, 051918 (2010).

  • Ван Ю. Ю., Чанг Р. Б., Уотерс Х. Н. и др. «Ноцицепторный ионный канал TRPA1 потенцируется и инактивируется проникающими ионами кальция», J. Biol. Chem. , 283 , № 47, 32691–32703 (2008).

    CAS Статья Google ученый

  • Wetsel, W.C., «Определение горячего и холодного с помощью каналов TRP», Int. J. Hyperthermia , 27 , № 4, 388–398 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • Ян Ф. и Чжэн Дж. «Высокая температурная чувствительность присуща потенциалозависимым калиевым каналам», eLife , 3 , e03255 (2014).

    Артикул Google ученый

  • Яо, Дж., Лю, Б., и Цинь, Ф., «Быстрый скачок температуры при облучении инфракрасным диодным лазером для исследований патч-кламп», Biophys. J. , 96 , 3611–3619 (2009).

    CAS Статья Google ученый

  • Ярмоленко, П. С., Мун, Э. Дж., Лэндон, К. и др., «Пороги термического повреждения нормальных тканей: обновление», Int. J. Hyperthermia , 27 , 320–343 (2011).

    Артикул Google ученый

  • Ижар, О.и др., «Оптогенетика в нейронных системах», Neuron , 71 , № 1, 9–34 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • Использование термочувствительных каналов для изучения нейронных схем

    Инструменты, которые используют свет, лекарства или температуру, чтобы заставить нейроны срабатывать или отдыхать по команде, стали основой нейробиологии. Термогенетика, которая позволяет нейронам реагировать на температурные сдвиги, впервые появилась у плодовых мушек около десяти лет назад, но сейчас появляется как новый трюк, позволяющий манипулировать нейронными функциями других модельных организмов.Это связано с некоторыми преимуществами, которые он дает перед оптогенетикой — техникой, основанной на свете, с которой все началось.

    Генетические инструменты, такие как термогенетика и оптогенетика, следуют базовому рецепту: ученые выбирают рецептор, который реагирует на внешние сигналы, такие как температура или свет, выражают рецептор в определенных нейронах в качестве переключателя, который изменяет напряжение клетки — запускает или запрещает возбуждение — а затем используйте сигнал, чтобы включить или выключить нейронный переключатель.

    Оптогенетика произвела революцию в нашем понимании того, как проводка мозга влияет на поведение животных.Но у него есть недостатки. Во-первых, доставка света в самые глубокие области мозга непрозрачных животных является проблемой. У мышей для этого требуется хирургическое введение оптических волокон в мозг, которые привязывают животное к источнику света. Исследователи, работающие с взрослыми плодовыми мушками, могут прорезать в кутикуле головы окно для доступа к мозгу. В обоих случаях необходимые экспериментальные установки являются инвазивными и часто требуют много времени и усилий.

    Кроме того, необходимая для оптогенетики интенсивность света имеет тенденцию к повреждению тканей.«Вы пропускаете через оптическое волокно много света, чтобы активировать нейроны», — говорит Всеволод Белоусов, биохимик Российской академии наук в Москве, который разрабатывает термогенетические инструменты. «В общем, этого нельзя избежать».

    Термогенетика позволяет нейробиологам обойти эти проблемы, используя белки, которые реагируют на изменения температуры с более сильным уровнем активации, чем переключатели, активируемые светом, с менее инвазивной доставкой стимулов. Однако, в отличие от оптогенетических рецепторов света, большинство терморецепторов, используемых в настоящее время, позволяют исследователям только включать нейроны, но не выключать их; и их использование у грызунов все еще развивается.

    Здесь, Ученый излагает текущее состояние термогенетического набора инструментов для различных модельных организмов.

    Превращение тепла в плодовых мушек

    Термогенетика началась с исследований Drosophila и, безусловно, наиболее разработана для использования на плодовых мушках. В начале 2000-х годов Тошихиро Китамото впервые использовал мутированную форму белка под названием шибире, чтобы отключить синаптическую связь в определенных нейронах мух при температуре выше 29 ° C. Shibire — это фермент суперсемейства динаминов, который участвует в образовании пузырьков; его мутантная версия подавляет химическую передачу в широком диапазоне нейронов в течение нескольких минут после повышения температуры. Но поскольку динамины влияют на многие клеточные процессы, использование shibire может иметь далеко идущие неспецифические эффекты.

    Другой класс белков, называемых термо-TRP, больше подходит для термогенетики. ThermoTRP — это катионные каналы семейства транзиторных рецепторных потенциалов, которые обычно опосредуют температурные предпочтения как в головном мозге, так и в других частях тела.Эти каналы резко реагируют на температурные сдвиги всего на 1–2 ° C. Например, Drosophila TrpA1 включается при температуре чуть выше 25 ° C, а TRPM8 крысы — при температуре чуть ниже 25 ° C.

    Когда ученые впервые экспрессировали TrpA1 в мотонейронах дрозофилы, они обнаружили, что нагревание клеток парализовало животных. «Мы взяли теплую воду и начали макать их, и они просто потеряли сознание», — говорит Пол Гаррити, биолог из Университета Брандейса, который первым применил термоТРП.«Это было похоже на фокус».

    TRP-каналы также очень эффективно проводят ионы, говорит Белоусов — примерно в 1000 раз больший поток, чем ионные каналы, используемые в оптогенетике. Это означает, что thermoTRPs могут управлять устойчивой активацией при низких уровнях экспрессии, снижая токсические эффекты сверхэкспрессирующих белков.

    У исследователей плодовых мух есть еще один вариант: Gr28bD, вкусовый рецептор, который, как недавно было обнаружено, реагирует на тепло в нейронах плодовой мушки, хотя и при гораздо более высоких температурах от 32 ° C до 36 ° C.Исследователи из Университета Миссури в Колумбии разрабатывают белок как еще один термогенетический инструмент. Пока рецептор Gr28bD работает, когда экспрессируется в ооцитах Xenopus и в двигательных нейронах взрослых плодовых мух ( Sci Rep , 8: 901, 2018).

    Как и thermoTRPs, Gr28bD представляет собой катионный канал, который позволяет исследователям активировать только нейроны, говорит Мирела Милеску, биофизик из Университета Миссури, изучающая взаимосвязь между структурой и функцией этого белка. По ее словам, есть надежда сконструировать его так, чтобы он работал при более низкой температуре активации, и, возможно, даже превратить его в ингибирующий инструмент.

    Терморецепторные белки , shibire , thermoTRPs и Gr28bD могут быть активированы путем изменения температуры окружающей среды в так называемом горячем боксе, контейнере для мух с регулятором температуры. Процесс прост и неинвазивен. Но у комнатного отопления есть несколько недостатков. Во-первых, изменение температуры происходит медленнее, чем прямая подача тепла, говорит Белоусов, а пространственное разрешение отсутствует, потому что вы активируете все животное. Например, при использовании хотбокса все клетки с TrpA1 в Drosophila активируются и остаются активными в течение всего эксперимента.«Пока вы не остынете, эти каналы открыты, а нейроны остаются деполяризованными», — говорит он. «Это не то, как обычно ведут себя нейроны; они стреляют импульсами ».

    Чтобы устранить это ограничение, Барри Диксон, нейробиолог из исследовательского кампуса Janelia при Медицинском институте Говарда Хьюза в Эшберне, штат Вирджиния, создал более целенаправленную систему доставки тепла. Устройство, изменяющее сознание мухи, или FlyMAD, использует видеокамеру для отслеживания мухи, когда она перемещается в ящике. При обнаружении мухи устройство излучает несфокусированный инфракрасный луч, доставляя тепло непосредственно к ее голове, что позволяет исследователям нацеливаться на мозг и быстрее активировать термогенетические белки ( Nat Methods , 11: 756–62, 2014).

    В целом, thermoTRPs можно использовать только для активации нейронов, потому что они переносят катионы в клетку. Белоусов и другие, однако, проектируют эти каналы для переключения проводимости с ионов кальция на ионы хлора, что также позволит им подавлять нервную активность.

    Получение тепла с помощью рыбок данио

    Большинство нейробиологических исследований рыбок данио проводится с использованием эмбрионов и личинок, поскольку многие преимущества молодых рыбок данио — маленький размер, прозрачность и маленький и простой мозг — теряются у взрослых, говорит Дэвид Пробер. , нейрогенетик из Калифорнийского технологического института в Пасадене.

    Мы хотели альтернативный подход, при котором не использовались бы визуальные стимулы для активации нейронов.

    — Дэвид Пробер, Калифорнийский технологический институт

    Прозрачность личинок означает, что исследователи могут использовать окружающее освещение для неинвазивного доступа к любому нейрону в мозгу с помощью оптогенетики. Проблема, однако, в том, что включение света вызывает у животных поведенческую реакцию, говорит Пробер. «Поэтому мы хотели альтернативный подход, в котором не использовались бы визуальные стимулы для активации нейронов.

    Лаборатория Пробера проверила еще один канал TRP, называемый TRPV1, который активируется при температуре около 43 ° C, а также капсаицином, молекулой, которая делает перец чили острым. При низкой концентрации капсаицина активация TRPV1 вызывает возбуждение нейронов; при более высокой концентрации его чрезмерная активация приводит к гибели этих нейронов. Таким образом, TRPV1 может включать и выключать нейроны, хотя выключение является постоянным. Активность TRP-канала, индуцированная капсаицином, лишена миллисекундного контроля оптогенетики, но ее эффект в течение нескольких секунд работает для поведения, которое происходит в течение длительного времени, например, для сна ( Nat Methods , 13: 147–50, 2016).

    Еще один рецептор из семейства термо-TRP, который является многообещающим в исследованиях на рыбках данио, — это TRPA1 гремучей змеи, который включается около 28 ° C.Это хорошо в пределах физиологического диапазона рыбок данио, но достаточно высокий, чтобы личинки могли расти при температуре окружающей среды без активации. канал. Напротив, Drosophila TrpA1, который включается при температуре чуть выше 25 ° C, будет несовместим с использованием в исследованиях на рыбках данио, потому что 25 ° C — это самая низкая температура, при которой ученые выращивают животных, говорит Пробер.

    ЛИХОРАДКА РЫБ: Гипоталамус пятидневной личинки рыбок данио экспрессирует зеленый флуоресцентный белок и терморецептор TRPV1, слитый с красным флуоресцентным белком.

    Дэвид Пробер, Калифорнийский технологический институт

    Как и исследователи мух, рыбологи также используют нагрев окружающей среды для активации нейронов. Однако команда Белусова недавно разработала систему доставки тепла, которая может направлять сфокусированное инфракрасное излучение на отдельные клетки с помощью оптоволоконной установки.

    «Это даже можно назвать ветвью оптогенетики», — говорит Белоусов, потому что они все еще используют свет в качестве активирующего стимула, за исключением того, что он находится не в визуальном, а в невидимом инфракрасном диапазоне.Его команда проверила метод, направив инфракрасный луч на эмбрионы, погруженные в агарозу. В настоящее время они разрабатывают способы использования этой системы в активно ведущих личинках рыбок данио ( Nat Comms , 8: 15362, 2017).

    Разогрев для млекопитающих

    Оптогенетика широко используется у млекопитающих, но ее инвазивность и низкая проводимость канальных родопсинов — белков фоторецептивных каналов, которые модифицированы для использования в оптогенетических исследованиях, — побудили исследователей изучить термогенетику.

    В конечном счете, название игры для всех методов — получить действительно короткий всплеск, а затем немедленно отключить стимул.

    —Полина Аникеева, Массачусетский технологический институт

    ThermoTRP обладают гораздо более высокой проводимостью, включая нейроны при небольшой внешней стимуляции. Но найти термо-TRP, который работает при 37–38 ° C, физиологической температуре млекопитающих, до сих пор было непросто. Ни TRPM8 крысы, ни TRPA1 мух, ни TRPA1 гремучей змеи нельзя использовать у млекопитающих, потому что их пороги активации намного ниже температуры тела млекопитающих.

    TRPA1 крысиной змеи, однако, активен около 38,5 ° C, что довольно близко к температуре мозга млекопитающих, говорит Белоусов. Его лаборатория сообщила, что этот канал может активировать культивируемые нейроны грызунов ( Nat Comms , 8: 15362, 2017), но его эффективность в поведении мышей еще предстоит продемонстрировать.

    Ученые также использовали TRPV1 крысы для активации культивируемых клеток млекопитающих. Хотя считается, что температура, при которой активируется половина каналов TRPV1, составляет около 42 ° C, Арнд Пралле, биофизик из Университета в Буффало, Нью-Йорк, успешно использовал TRPV1 при 39 ° C для активации нейронов в моторной коре головного мозга. спинное полосатое тело и гребень между спинным и брюшным полосатым телом свободно перемещающихся мышей.При этой температуре открываются лишь от 15 до 20 процентов каналов TRPV1, но образовавшегося кальциевого тока достаточно для включения нейронов ( eLife , 6: e27069, 2017).

    «Вы не пытаетесь поддерживать температуру на уровне 43 ° C в течение нескольких минут», — говорит Полина Аникеева, нейронный нанотехнолог из Массачусетского технологического института. «В конечном счете, для всех методов название игры — получить действительно короткий всплеск, а затем немедленно отключить стимул».

    КРАСНОЕ ТЕПЛО: эти первичные эмбриональные нейроны мыши светятся красным, потому что они экспрессируют терморецептор TRPA1 крысиной змеи, помеченный красным флуоресцентным белком
    .

    Всеволод Белоусов, Российская академия наук

    В отличие от плодовых мух и данио, конечно, потепление окружающей среды не повышает температуру теплокровных животных. По словам Белоусов, области отчаянно нуждаются в новых способах беспроводной передачи энергии глубоко в ткани. Сфокусированный инфракрасный луч, который разработала его команда, работает как средство доставки тепла с разрешением одной клетки до примерно 2–3 мм вглубь мозга, регулируя длину волны и длительность импульса. Но для стимуляции более глубоких участков мозга по-прежнему требуется хирургическая имплантация волокон.

    Несмотря на ограниченность, инфракрасное излучение все же поглощается телом, уменьшая глубину проникновения, говорит Аникеева. «Единственное поле, с которым наше тело действительно не взаимодействует, — это магнитное».

    Pralle, Anikeeva и другие поэтому разрабатывают «магнитотермические» подходы, в которых магнитные наночастицы вводятся в мозг и активируются сильным магнитным полем. Затем нейро-локализованные магниты преобразуют эту локализованную магнитную энергию в тепло, которое, в свою очередь, активирует каналы TRPV1.Используя этот метод, команда Pralle смогла настроить области мозга, отвечающие за ходьбу, вращение и замирание у непривязанных мышей ( eLife , 6: e27069, 2017).

    Недавно команда Pralle продемонстрировала использование термочувствительного хлоридного канала, аноктамина 1 (TMEM16A), чтобы заставить замолчать нейроны в культурах гиппокампа крыс с помощью магнитных наночастиц. Большое преимущество канала заключается в том, что при активации при температуре около 38–39 ° C он подавляет нейроны ( Front Neurosci , 12: 560, 2018).

    «Конечная цель состоит в том, чтобы действительно использовать все эти методы для включения и выключения различных областей мозга и анализа цепей, которые взаимодействуют вместе», — говорит Палле.

    Термогенетика может помочь в исследованиях болезней Альцгеймера и Паркинсона — ScienceDaily

    Группа нейробиологов из Университета Миссури постепенно приближается к разработке инструментов, необходимых для расшифровки информации о мозге. В 2015 году команда получила грант Национального научного фонда на раннюю концепцию исследовательских исследований (EAGER) за исследование недавно открытого класса белков, которые активируются при нагревании.Теперь команда опубликовала новую статью, в которой демонстрируется, как эти белки могут использоваться в качестве инструментов для регулирования активности отдельных нейронов в головном мозге посредством изменения температуры. Эти инструменты продвинут фундаментальные исследования мозга и потенциально приведут к методам «глубокой стимуляции мозга», используемым для пациентов с болезнью Альцгеймера и Паркинсона.

    «Термогенетические инструменты, которые используют тепло в качестве« переключателя »для включения функций нейронов, расширяют горизонты исследований мозга, позволяя нам контролировать определенные нейроны в головном мозге и измерять изменения в поведении», — сказал Трой Зарс, профессор кафедры биологические науки в Колледже искусств и наук МУ.«Целью этого фундаментального исследования было выявить больше этих особых белков, заложив основу, чтобы в будущем ученые лучше понимали, как функционируют нейронные цепи».

    Исследовательскую группу возглавляли Зарс, а также Мирела Милеску и Лорин Милеску, которые являются доцентами биологических наук в MU. В команду входили четыре студента и четыре аспиранта. Вместе исследователи сосредоточились на семействе генов, которые кодируют вкусовые рецепторы, обнаруженные у плодовых мушек.Удивительно, но некоторые из этих вкусовых рецепторов также активируются под действием тепла и, таким образом, играют роль в определении температуры окружающей среды.

    Сначала студенты в лаборатории Мирелы Милеску исследовали термочувствительность этих белков и определили одного члена семейства, названного Gr28bD, как главного кандидата на термогенетику. Затем ученики Лорина Милеску использовали методы визуализации в реальном времени и программное обеспечение, разработанные в их лаборатории, чтобы продемонстрировать, что белок Gr28bD может посредством разницы температур модулировать мозговую активность плодовых мух.

    Наконец, мухи были протестированы в лаборатории доктора Троя Зарса на поведение в зависимости от температуры. Используя специально разработанную тепловую камеру, которая позволяет точно контролировать температуру окружающей среды, ученики Зарса смогли показать, что белок Gr28bD может контролировать поведение этих мух, используя температуру в качестве «переключателя мозга».

    «Gr28bD может стать мощным инструментом в управлении нейронной активностью и изучении функционирования нейронных цепей», — сказал Бентон Бериган, аспирант лаборатории Лорина Милеску.«Поскольку этот белок не обнаружен ни у одного млекопитающего, он является хорошим кандидатом для разработки новых термогенетических инструментов, которые будут использоваться для фундаментальных исследований и, возможно, однажды на людях».

    Дальнейшее изучение термогенетики может привести к разработке инструментов глубокой стимуляции мозга в рамках национального проекта «Исследования мозга через продвижение инновационных нейротехнологий», — сказал Зарс.

    Это исследование подчеркивает мощь прецизионной трансляционной медицины и перспективность предлагаемого комплекса трансляционной прецизионной медицины (TPMC) в Университете Миссури.TPMC объединит отраслевых партнеров, несколько школ и колледжей на территории кампуса, а также федеральное правительство и правительство штата, чтобы обеспечить точную и персонализированную медицину. Научные достижения MU будут эффективно воплощены в новых лекарствах, устройствах и методах лечения, которые обеспечивают индивидуальный уход за пациентами, основанный на генах, окружающей среде и образе жизни человека, в конечном итоге улучшая здоровье и благополучие людей.

    История Источник:

    Материалы предоставлены Университетом Миссури-Колумбия . Примечание. Содержимое можно редактировать по стилю и длине.

    границ | Индукция аверсивного обучения посредством термогенетической активации клеточных ансамблей Kenyon у Drosophila

    Введение

    Drosophila melanogaster представляет собой ключевой модельный организм для анализа того, как нейронные цепи опосредуют ассоциативное обучение и память (Heisenberg, 2003; Davis, 2005; Fiala, 2007). Плодовых мушек можно обучить избегать запаха, который появился во временном совпадении с карательным электрическим током (Quinn et al., 1974; Талли и Куинн, 1985). Плодовая мушка воспринимает запахи с помощью ~ 1200 обонятельных сенсорных нейронов в каждом полушарии, расположенных на третьих сегментах антенн и верхнечелюстных щупиках (Vosshall and Stocker, 2007). Их аксоны сходятся в клубочках антеннальных долей, и ~ 150 обонятельных проекционных нейронов на полушарие передают информацию об запахе от антеннальных долей к латеральному рогу и чашечкам грибовидных тел (Vosshall and Stocker, 2007). Здесь нейроны обонятельной проекции синапса с клетками Кеньона, внутренними нейронами грибовидного тела (рис. 1А), где запахи кодируются как редко активированные ансамбли клеток Кеньона (Perez-Orive et al., 2002; Мурти и др., 2008; Тернер и др., 2008; Луо и др., 2010; Honegger et al., 2011). Стимулы запаха активируют ансамбли примерно в 5% из ~ 2500 клеток Кеньона на полушарие, независимо от концентрации или химической сложности одоранта (Honegger et al., 2011), и эти ансамбли нестереотипны и изменчивы у разных людей (Murthy и др., 2008).

    Рисунок 1. Экспрессия mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Kenyon. (A) Иллюстрация обонятельного входа в грибовидные тела в мозге Drosophila .Обонятельные рецепторные нейроны (ORN) передают информацию об запахе от антенн (AN) к усиковым лепесткам (AL). Нейроны обонятельной проекции (OPN) соединяют AL с грибовидными телами (MB) в чашечке и боковом роге (LH). (B) Принцип экспрессии mCherry- d TRPA1: штамм мухи, несущий конструкцию ДНК mb247-Gal4, специфичную для грибовидных тел, и конструкцию ДНК флиппазы под контролем промотора Hsp70, скрещивается со штаммом мух, несущим ДНК-конструкция mCherry- d TRPA1, которой предшествует FRT-фланкированная кассета CD2 (стоп) под контролем UAS.Опосредованное флиппазой случайное вырезание FRT-кассеты вызывает транскрипцию конструкции mCherry- d TRPA1. (C – E) Экспрессия mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Кеньона. Вид спереди на верхней панели, вид сзади на нижней панели мозга мухи, подвергшейся 1-часовому тепловому шоку через 1 день после эклозии. Нейропилы визуализируются с использованием антитела против bruchpilot (C) , mCherry- d Экспрессия TRPA1 визуализируется с использованием антитела против RFP (D) , и их наложение показано в (E) .Масштабные линейки = 50 мкм. (F – H) Увеличенное изображение экспрессии mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Кеньона, визуализированных пурпурным цветом на уровне соматы (так). Большая часть клеток Kenyon экспрессирует G-CamP3.0 в качестве маркера флуоресценции (зеленый). (F) Аксоны клеток Кеньона, которые экспрессируют mCherry- d TRPA1 и которые выступают в пятку (h), α- и β-доли (G) и γ-доли (H) . Масштабные линейки = 50 мкм.

    Длинный ряд доказательств продемонстрировал, что клетки Кеньона грибовидного тела необходимы для ассоциативного обонятельного обучения и восстановления кратковременной памяти (Heisenberg et al., 1985; Де Белль и Гейзенберг, 1994; Коннолли и др., 1996; Зарс и др., 2000; Дубнау и др., 2001; Макгуайр и др., 2001; Гейзенберг, 2003; Гербер и др., 2004; Дэвис, 2005; Фиала, 2007; Крашес и др., 2007; Qin et al., 2012). Структурные мутации (Heisenberg et al., 1985) и абляции грибовидных телец (De Belle and Heisenberg, 1994) или нарушение передачи сигналов G-белка в клетках Kenyon (Connolly et al., 1996) нарушают обонятельное обучение и блокируют высвобождение синаптического медиатора. из клеток Кеньона ухудшает восстановление памяти (Dubnau et al., 2001; McGuire et al., 2001). Эти эксперименты демонстрируют необходимость функции неповрежденного грибовидного тела для ассоциативного обонятельного обучения, формирования кратковременной памяти, консолидации и восстановления памяти. Более того, генные мутации, которые влияют на обучение, например, мутация аденилатциклазы брюквы I типа (Zars et al., 2000) или D1-подобного рецептора допамина DopR (Qin et al., 2012), могут быть спасены генетически. экспрессией гена дикого типа в подмножествах клеток Кеньона. Следовательно, потребность в этих генных продуктах для обонятельного обучения может быть ограничена грибовидным телом.В целом эти данные привели к гипотезе о том, что нейронные изменения, которые опосредуют поведенческие изменения, вызванные обучением, т. Е. Энграмма памяти, могут быть связаны с грибовидным телом (Heisenberg, 2003; Gerber et al., 2004; Fiala, 2007). ). Все эти эксперименты основаны на деструктивных генетических, анатомических или физиологических изменениях функции грибовидного тела или на тканеспецифическом восстановлении этих изменений. Однако никогда не проверялось, является ли активность клеток Кеньона в совпадении с явным стимулом, который является причинным и достаточным для индукции ассоциативного обучения, важного критерия для локализации существенного следа памяти или инграммы (Thompson, 2005; Riemensperger and Фиала, 2013).С другой стороны, активность проекционных нейронов, нацеленных на грибовидное тело и боковой рог, может потребоваться для приобретения и восстановления ассоциативной памяти запахов, а клетки Кеньона могут просто модулировать врожденную поведенческую реакцию, вызываемую этими нейронами. В этом случае активность клеток Кеньона была бы необходима, но недостаточна для обонятельного обучения. Чтобы обеспечить это недостающее звено, мы разработали экспериментальную стратегию обхода любого обонятельного входа в грибовидное тело и искусственного индуцирования нейрональной активности в случайных ансамблях клеток Кеньона в отсутствие обонятельной стимуляции.

    Материалы и методы

    Drosophila Штаммы

    Мухи выращивали на стандартном корме из кукурузной муки и агара при 18 ° C, влажности 60% и 12-часовом цикле свет-темнота. Штамм дикого типа — это Canton-S. Штамм Hsp70-Flp (предоставленный G. Struhl), несущий вставку на X-хромосоме, описан Basler and Struhl (1994). Штамм mb247-Gal4 со вставкой на третьей хромосоме описан Zars et al. (2000), штамм R71D08-Gal4 (предоставлен H.Tanimoto) со вставкой на третьей хромосоме был описан Séjourné et al. (2011). G-Camp 3.0 (Tian et al., 2009) экспрессировался под контролем двух копий промотора mb247 (Zars et al., 2000) со вставкой на третьей хромосоме (Pech et al., 2013). Для создания d TRPA1 (любезно предоставленный P. Garrity), помеченного на С-конце, mCherry амплифицировали с использованием линкер-ПЦР и вставляли в вектор pUAST (Brand and Perrimon, 1993) с использованием рестрикционных ферментов NotI и XhoI.КДНК d TRPA1 из вектора pOX- d TRPA1 амплифицировали с использованием линкер-ПЦР и вставляли в вектор pUAST-mCherry с использованием рестрикционных ферментов BglII и MluI. Для создания d TRPA1, меченного на N-конце, mCherry амплифицировали с использованием линкер-ПЦР и вставляли в вектор pUAST с использованием рестрикционных ферментов BglII и NotI. КДНК d TRPA1 амплифицировали с использованием линкер-ПЦР и вставляли в вектор pUAS-mCherry с использованием рестрикционных ферментов SpeI и XhoI.Мух, несущих любую версию меченого канала d TRPA1, тестировали на обнаруживаемую флуоресценцию и температурную зависимость канала путем пересечения линий UAS с D42-Gal4 (Parkes et al., 1998), вызывая экспрессию канала в мотонейронах. (Рисунок 6A). Для экспрессии меченого d TRPA1 под контролем mb247-Gal4 была выбрана линия с mCherry на С-конце d TRPA1 и вставка в X-хромосому, поскольку она не показала утечки экспрессии, хотя высокая Gal4-зависимая флуоресценция. по сравнению с другими трансгенными линиями.Поскольку несколько мух-линий с N- и C-концевыми метками d TRPA1 оказались функциональными, флуоресцентными и температурно-зависимыми (хотя с разной эффективностью для линий с разными вставками P-элементов), только метка на N-конце d TRPA1 использовали для создания штамма мух UAS-FRT-CD2 (Stop) -FRT-mCherry- d TRPA1. Вектор pUAST, содержащий кассету FRT-CD2-y + -FRT (Schlake and Bode, 1994), был предоставлен Gary Struhl. Часть последовательности y + вырезали из вектора, и последовательность адаптера с сайтами рестрикции Acc65I, BsiWI, RSrII и SacII вставляли ниже кассеты FRT с использованием рестрикционных ферментов Acc65I и SacII.Последовательность ДНК mCherry- d TRPA1 амплифицировали с использованием линкер-ПЦР и вставляли в вектор UAS-FRT-CD2 (Stop) -FRT с использованием рестрикционных ферментов BsiWI и SacII. Трансформацию зародышевой линии проводили коммерчески (BestGene Inc.). Линия мух со вставкой на второй хромосоме была выбрана для дальнейших исследований из-за относительно высокого уровня флуоресценции. Вставка Hsp70-FLP на Х-хромосоме была объединена со вставкой mb247-Gal4 на третьей хромосоме для создания штамма Hsp70-FLP; +; mb247-Gal4, гомозиготного по обоим вставкам Р-элемента.Самцов этой линии мух скрестили с девственными самками мух UAS-FRT-CD2 (Stop) -FRT-mCherry- d TRPA1 со вставкой, уравновешенной над CyO. Потомство самок этого скрещивания моложе 2 дней подвергали анестезии с использованием CO 2 и переносили во флаконы со свежим кормом. Для индукции FLP-опосредованной экспрессии мух инкубировали при 30 ° C в течение 1 ч, если не указано иное.

    Иммуногистохимия

    Мозг и, в некоторых случаях, грудные ганглии препарировали в ледяном растворе Рингера и фиксировали в течение 2 часов на льду в 4% параформальдегиде, растворенном в фосфатно-солевом буфере (PBS), с последующими тремя стадиями промывки в PBS, содержащем 0.5% Triton X-100 (PBST) по 20 мин каждый. После 2 часов предварительной инкубации в PBST, содержащем 2% бычьего сывороточного альбумина (блокирующий раствор), мозг инкубировали в течение 24 часов при 4 ° C с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе. Были использованы следующие антитела: мышиные анти-nc82 против Bruchpilot (Wagh et al., 2006) (предоставлены Эрихом Бухнером) в разведении 1:10, крысиные анти-RFP (5F8, Chromotec) для окрашивания mCherry в разведении 1: 300 и кроличьи. анти-GFP (A6455, Invitrogen), разведенный 1: 200. Затем мозг трижды промывали PBST по 20 мин каждый и инкубировали в течение ночи со вторичными антителами при 4 ° C.Были использованы следующие вторичные антитела: козьи антимышиные, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (A1101, Invitrogen), козьи антикроличьи, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (A11034, Invitrogen), и козьи антитела против крыс, конъюгированные с Cy3 (A10522, Invitrogen), все разбавлено 1: 500. Мозг трижды промывали PBST по 20 мин каждый, промывали PBS в течение ночи при 4 ° C и заливали в Vectashield (Vector Laboratories). Изображения были получены с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Leica) и проанализированы с помощью ImageJ. Для 3D-реконструкций Amira 5.Программное обеспечение 3.3 (Visage Imaging). Сила экспрессии mCherry была количественно определена в области, определяемой фокальной плоскостью, которая покрывала часть стебля грибовидного тела, в которой были идентифицированы α / β- и γ-доли (Sinakevitch et al., 2010). Площади соответствующих областей определяли с использованием иммуноактивности против bruchpilot и количественно определяли относительную долю иммунной активности против RFP, указывающую на mCherry- d TRPA1. По возможности исследовали грибовидные тела обоих полушарий.Для количественного анализа изображений использовались программы Amira 5.3.3 (Visage Imaging) и ImageJ.

    Поведенческий анализ

    Для дрессировки восемь самок мух (возрастом 4–6 дней) были помещены в пробирки, покрытые внутри электризуемой медной сеткой. Пробирки предварительно нагревали до 30 ° C и тренировку проводили в освещенном инкубаторе при 30 ° C и влажности воздуха ~ 60%. Животных держали в этих пробирках в течение 2 минут, при этом применяли 24 электрошока с напряжением 90 В постоянного тока и продолжительностью 1,25 с с 3.75-секундные перерывы с интервалами 5 секунд. Для «непарной» парадигмы обучения мух лечили соответственно, но с 5-минутной задержкой между применением шока и искусственной активацией подмножеств клеток Кеньона (рис. 7A). При «прямом» обучении мух инкубировали при 30 ° C, а затем применяли электрошок, тогда как при «обратном» обучении мух сначала подвергали 2-минутному воздействию электрошока при 18 ° C, а затем переносили на 2 минуты в 30 ° C (Рисунки 7B, C). Контрольных животных либо лечили одинаково, но без электрического шока, либо тренировали при 18 ° C.Впоследствии мух перемещали в камеру градиента тепла, которая состояла из алюминиевого блока с 8 шагающими дорожками (длина 225 мм × ширина 5 мм × высота 4 мм), закрытого крышкой из оргстекла. Алюминиевый блок был соединен с обоих концов с элементами Пельтье с водяным охлаждением и электронным управлением. Весь аппарат содержался в инкубаторе при постоянном белом свете, температуре 16 ° C и влажности ~ 65%. Элементы Пельтье создавали линейный и стабильный температурный градиент по длине арен в диапазоне от 18 до 35 ° C.Отдельных мух осторожно переносили без анестезии на прогулочные дорожки через небольшие отверстия в крышке, и они могли свободно распространяться в течение 20 минут. Следы ходьбы контролировались сверху видеокамерой высокого разрешения (Panasonic HC-V500). Для анализа данных мух отслеживали с помощью программного обеспечения Noldus EthovisionXT 8.5 (Wageningen). Температурные предпочтения определялись как среднее положение каждой мухи в течение последних 5 минут периода наблюдения, и положение каждой мухи в камере приписывалось точному значению температуры.Сразу после поведенческих экспериментов случайные образцы мух анестезировали, мозг вскрывали и определяли экспрессию mCherry- d TRPA1 с помощью иммуногистохимии. Для проверки реактивности и предотвращения поражения электрическим током группы из 20–30 мух были испытаны в Т-образном лабиринте, состоящем из двух трубок, покрытых внутри электризуемой медной сеткой, одна из которых была электрифицирована в течение 1,25 с при 90 В с интервалами 5 с. на 2 мин. Животные могли свободно распределяться между двумя пробирками, и подсчитывали количество животных в наэлектризованной пробирке (N шок ) и неэлектрифицированной пробирке (N без шока ).Индекс избегания (AI) рассчитывался как AI = (N шок — N без шока ) / (N шок + N без шока ). Отрицательное значение AI указывает на избегание электрифицированной трубки.

    Результаты

    Экспрессия

    d TRPA1 с меткой Mcherry в случайных ансамблях клеток Кеньона грибовидного тела

    Термоиндуцибельный катионный канал d TRPA1 (Hamada et al., 2008) был слит с красным флуоресцентным белком mCherry (Shaner et al., 2005) и помещен ниже стоп-кассеты, фланкированной двумя последовательностями-мишенями распознавания флиппазы (FRT) (Schlake and Bode, 1994) (Рисунок 1B). Трансгенные мухи, несущие эту конструкцию вместе с флиппазой под контролем промотора теплового шока (Basler and Struhl, 1994), были созданы для экспрессии mCherry- d TRPA1 в случайных субпопуляциях нейронов (рис. 1B). Используя этот метод в сочетании с драйверной линией mb247-Gal4 (Zars et al., 2000), мы получили мозаичных мух, которые экспрессировали mCherry- d TRPA1 в случайных подмножествах α / β- и γ-долей клеток Kenyon (рисунки 1C– ЧАС).Те нейроны, которые экспрессируют d TRPA1, могут быть деполяризованы путем повышения температуры выше ~ 25 ° C у взрослых мух (Hamada et al., 2008; Tang et al., 2013). Поскольку как индукция экспрессии генов промотором теплового шока во время развития, так и искусственная термогенетическая активация клеток Kenyon во время поведенческого эксперимента являются процессами, зависящими от температуры, мы сначала проверили и подтвердили, что максимальная продолжительность поведенческих экспериментов (<30 мин. ) было недостаточно, чтобы вызвать какую-либо быструю дополнительную экспрессию гена во время поведенческих тестов (рис. 2).

    Рис. 2. Повышение температуры во время поведенческих экспериментов не влияет быстро на экспрессию mCherry- d TRPA1 в клетках Kenyon. Мух, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 в случайном подмножестве клеток Kenyon, либо выращивали и поддерживали при 18 ° C, либо выращивали при 18 ° C и временно инкубировали в течение 30 минут при 30 ° C в возрасте 4–6 дней. Продолжительность повышенной температуры соответствует максимальному времени, которое животные могут проводить при температуре выше 25 ° C во время всех поведенческих экспериментов.Затем мозг вскрывали и определяли количество клеток Kenyon, экспрессирующих mCherry- d TRPA1. Мухи, инкубированные при 18 ° C, показали экспрессию mCherry- d TRPA1 в 56,9 ± 8,1 (среднее ± стандартное отклонение) клетках Kenyon, тогда как мухи, подвергшиеся воздействию 30 мин при 30 ° C, показали экспрессию в 48,0 ± 16,8 (среднее ± стандартное отклонение) клетках Kenyon ( p > 0,2, критерий Манна-Уитни).

    Термогенетическая индукция ассоциативного обучения

    Мы разработали парадигму обучения, в которой искусственная термогенетическая активация ансамблей клеток Кеньона временно сочеталась с поражением электрическим током.Тренировали мух в трубках, покрытых внутри электрическими сетками, при 30 ° C, то есть при температуре, значительно превышающей температуру, необходимую для термогенетической активации нейронов, с использованием d TRPA1 (Hamada et al., 2008) в течение 2 мин. Одновременно с термогенетической активацией случайных ансамблей ячеек Кеньона применялись электрические разряды напряжением 90 В (длительность разряда 1,25 с с интервалами 3,75 с). Контрольные животные того же генотипа лечились одинаково, но не подвергались воздействию электрического тока (рис. 3А).В типичной аверсивной процедуре обонятельного кондиционирования животные учатся избегать запаха, временно связанного с наказанием (Tully and Quinn, 1985). Мы рассудили, что если активность клеток Кеньона может обеспечить нейрональное проявление инграммы памяти, животные должны избегать любой реактивации обученных ансамблей клеток Кеньона. Чтобы проверить эту гипотезу, сразу после процедуры обучения животных по отдельности перевели в испытательную камеру, в которой они могли свободно ходить при температурном градиенте от 18 до 35 ° C (рисунки 3B – D).За движением каждого животного наблюдали, и температурные предпочтения интерпретировали как считывание из памяти, приближались ли животные или избегали активации тех клеток Kenyon, экспрессирующих mCherry- d TRPA1, то есть температуры выше ~ 25 ° C. Чтобы исключить возможность того, что животные научатся связывать температурное ощущение как условный раздражитель с наказанием, мы сначала подвергали мух Canton-S дикого типа температуре 30 или 18 ° C и одновременно применяли электрошок.В тестовой ситуации не было обнаружено никаких значительных различий в температурных предпочтениях этих мух по сравнению с животными, которые не получали электрический ток (рисунки 3E, F). Это демонстрирует, что мухи не связывают повышенную температуру как таковую с наказанием электрическим током. Однако мухи, экспрессирующие mCherry- d TRPA1 в случайных подгруппах клеток Kenyon и получившие электрический ток одновременно с термогенетической индукцией нейронной активности, показали значительный сдвиг в сторону более низких температур в тестовой ситуации (медиана 23.6 ° C, межквартильный размах 3,5 ° C, IQR) по сравнению с генетическими контрольными мухами (медиана IQR 25,6 ° C, 2,3 ° C для Hsp70-FLP; +; mb247-Gal4 и 25,1 ° C, IQR 1,8 ° C для UAS -FRT-CD2 (Stop) -FRT-mCherry- d TRPA1) (Рисунки 4A, B), но без значительных изменений в избегании холода (Рисунок 4C). Далее мы сравнили мух одного и того же генотипа, которые либо получили электрический ток одновременно с воздействием температуры 30 ° C, либо подверглись воздействию только 30 ° C. Опять же, мухи, экспрессирующие mCherry- dTRPA1 в случайных подгруппах клеток Kenyon, показали значительный сдвиг в сторону более низких температур при одновременной обработке CS и US по сравнению с контрольными мухами (фиг. 5A).Гетерозиготные генетические контрольные мухи, однако, не показали разницы в их предпочтении температуры между обученными и контрольными мухами (Рисунки 5C, D). В качестве дополнительного контроля мух, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 в подмножествах клеток Kenyon, тренировали электрическим током при 18 ° C, т.е. без какой-либо искусственной активации ансамблей клеток Kenyon. Не наблюдалось значительных различий между мухами, обученными при 18 ° C, и контрольными мухами, которые не подвергались обработке электрическим током (рис. 5B).Канал d TRPA1 начинает открываться при температуре ~ 25 ° C (Hamada et al., 2008; Tang et al., 2013) (рис. 6A), то есть в диапазоне температур, предпочтительных для наивных плодовых мух (Sayeed and Benzer , 1996; Hamada et al., 2008) (Рисунки 3D, 6C). Таким образом, приобретенный сдвиг в предпочтении температуры отражает то, что обученные животные активно предотвращают реактивацию клеток Кеньона. Чтобы проверить, связано ли наблюдаемое изменение температурного предпочтения мух, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 в подмножествах клеток Kenyon с сенсибилизацией животных, мы термогенетически активировали ансамбли клеток Kenyon только в течение 2 минут и впоследствии протестировали их по сравнению с наивными животными.Никаких изменений в предпочтении температуры между двумя группами животных не было обнаружено (рис. 6B), что демонстрирует, что активация подмножеств клеток Kenyon не просто сенсибилизировала животных, чтобы избежать более высоких температур. Кроме того, нет значительных различий в температурных предпочтениях или реактивности электрическим током у наивных мух, экспрессирующих d TRPA1-mCherry в большей части грибовидных тел с использованием mb247-Gal4, или у мозаичных мух, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 в случайных подгруппах Клетки Kenyon наблюдали при сравнении с генетическими контрольными штаммами и с мухами дикого типа (Фигуры 6C, D).

    Рис. 3. Иллюстрация тренировочного теста и теста на предпочтение температуры. (A) Мух подвергают воздействию температуры 30 ° C для термогенетической активации клеток Кеньона в течение 2 минут одновременно с электрошоком («Обучение»). Со второй группой животных обращаются одинаково, но без поражения электрическим током. Затем мух по отдельности переводят на арену температурного градиента («Тест»). (B) Металлический блок с восемью дорожками для ходьбы, закрытый крышкой из оргстекла, снабжен на концах элементами Пельтье.Мухи могут свободно распространяться в течение 20 минут в пределах каждого следа при влажности воздуха 65% и условиях белого света, а их передвижение отслеживается с помощью видеокамеры. (C) Верхняя панель: элементы Пельтье создают линейный температурный градиент от 18 до 35 ° C. Красная линия указывает на линейное соответствие ( R 2 = 0,99). Нижняя панель: снимки арены считывания температуры с указанием положения и следов передвижения отдельных мух в течение первых 5 минут (верхняя часть) и в течение последних 5 минут (нижняя часть) из 20-минутного времени наблюдения. (D) Верхняя панель: скорость передвижения наивных мух дикого типа. Температурные предпочтения определяются в течение последних 5 минут периода наблюдения (серая полоса), когда исследовательское поведение минимально. Нижняя панель: столбцы в верхней части графика показывают количество наивных мух дикого типа с предпочтением диапазона температур в ячейках 1 ° C, указанных на оси абсцисс. Точки в нижней части указывают температурные предпочтения для каждой отдельной мухи. Наложенные линии указывают медианное значение и IQR.Усы обозначают минимальные и максимальные значения. (E) Температура не воспринимается как условный раздражитель. Температурное предпочтение мух Canton-S дикого типа, которые инкубировали в течение 2 минут при 30 ° C и одновременно подвергались ударам электрическим током («обученные»), существенно не отличается ( p > 0,1) от таковых у мух, инкубированных при 30 ° C, но без электрошока («контроль»). (F) Мухи Canton-S дикого типа, которые были обучены соответствующим образом, но были инкубированы в течение 2 минут при 18 ° C и одновременно подвергались ударам электрическим током («обучены») и мухам, которых лечили одинаково, но без поражения электрическим током (« контроль ») не показали каких-либо значимых различий ( p > 0.05) в своих температурных предпочтениях.

    Фигура 4. Сравнение между генотипами мух, экспрессирующих mCherry- d TRPA1, и генетических контрольных животных. (A) мух, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Kenyon, демонстрируют изменение температурного предпочтения при обучении при 30 ° C в течение 2 минут одновременно с электрошоком по сравнению с гетерозиготными контрольными мухами, несущими UAS-FRT-CD2 ( stop) -FRT-mCherry- d Конструкция TRPA1 и гетерозиготные контрольные мухи, несущие конструкции Hsp70-Flp и mb247-Gal4.Кривые показывают предпочтение средней температуры во времени в ячейках по 60 с в течение 20-минутной фазы тестирования. В нижней части графика показаны температурные предпочтения в 5-минутных ячейках во время 20-минутной фазы тестирования. Значительное изменение температурных предпочтений наблюдается через ~ 10 мин. На прямоугольных диаграммах показаны медианы и межквартильные диапазоны, минимальные и максимальные значения. (B) Температурное предпочтение каждого генотипа в течение последних 5 минут 20-минутной фазы тестирования. Столбцы указывают количество мух с предпочтением диапазона температур в ячейках 1 ° C, указанных на оси абсцисс.Точки указывают на температурные предпочтения каждой отдельной мухи. Наложенные линии указывают медианы и межквартильный размах. Усы обозначают минимальные и максимальные значения. (C) После обучения при 30 ° C мухи, экспрессирующие mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Kenyon, между генотипами не наблюдается значительной разницы в избегании низких температур. Статистический тест: критерий Краскела-Уоллиса с апостериорным , скорректированным по Бонферрони, U-критерием Манна-Уитни (** p <0.01; *** p <0,001).

    Рисунок 5. Термогенетическая индукция обучения. (A) Температурные предпочтения обученных и контрольных мух, которые экспрессируют mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Кеньона. Мухи, обученные при 30 ° C, демонстрируют значительный ( p <0,02) сдвиг в предпочтении температуры по сравнению с контрольными животными, то есть животными, которые не подвергались электрошоку. (B) Температурное предпочтение мух, которые экспрессируют mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Kenyon, обработанных электрическим током при 18 ° C или без него.Не обнаружено значимой ( p > 0,08, U-критерий Манна-Уитни) разницы в предпочтении температуры между дрессированными и контрольными мухами. (C) Температурное предпочтение мух, гетерозиготных по UAS-FRT-CD2 (стоп) -FRT mCherry- d TRPA1 ДНК-конструкция, обработанная электрическим током или без него при 30 ° C. Никаких существенных ( p > 0,2) различий в предпочтениях температуры между дрессированными и контрольными мухами не обнаружено. (D) Температурное предпочтение мух, гетерозиготных по конструкциям ДНК Hsp70-Flp и mb247-Gal4, обработанных электрическим током или без него при 30 ° C.Никаких существенных ( p > 0,05) различий в предпочтении температуры между дрессированными и контрольными мухами не обнаружено. На панелях (A – D) полоски указывают количество мух с предпочтением диапазона температур, указанного на оси абсцисс в ячейках 1 ° C. Точки указывают на температурные предпочтения каждой отдельной мухи. Наложенные линии указывают медианы и межквартильный размах. Усы обозначают минимальные и максимальные значения. Статистический тест: U-критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони.(* p <0,05).

    Рис. 6. Функциональная характеристика экспрессии mCherry-tagged d TRPA1. (A) d TRPA1, меченный mCherry на N- или C-конце, экспрессировался в мотонейронах с использованием D42-Gal4 (Parkes et al., 1998), и локомоция наблюдалась при различных температурах по сравнению с мухами, экспрессирующими немеченые d TRPA1 (Hamada et al., 2008). Мухи, экспрессирующие любую из форм d TRPA1 в моторных нейронах, демонстрировали сходные нарушения локомоции при температурах выше ~ 25 ° C, тогда как генетические контрольные штаммы этого не делали.Нижняя часть: снимки арены считывания температуры с указанием положения и следов передвижения отдельных мух в течение 5 мин при 23 ° C (слева) и 25 ° C (справа). (B) Термогенетическая активация случайных ансамблей клеток Kenyon у мух, подвергшихся воздействию 30 ° C в течение 2 минут, не влияла на последующие температурные предпочтения по сравнению с наивными животными, которые не подвергались воздействию 30 ° C ( p > 0,8, Mann -Уитни-U-тест). Столбцы указывают количество мух с предпочтениями для диапазона температур в ячейках 1 ° C, указанных на оси абсцисс.Точки указывают на температурные предпочтения каждой отдельной мухи. Наложенные линии указывают медианы и межквартильный размах. (C) Наивные температурные предпочтения не были затронуты у штаммов мух, экспрессирующих mCherry-tag d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Кеньона, в значительной части клеток Кеньона под контролем mb247-Gal4 (серые столбцы) или в подмножестве выходные нейроны грибовидного тела по сравнению с генетическими контрольными штаммами или мухами дикого типа (белые полосы). ( стр. > 0.06, односторонний дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони, N ≥ 24). (D) Не было существенной разницы между теми же штаммами мух в предотвращении поражения электрическим током при 30 ° C ( p > 0,07, однофакторный дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони, N ≥ 5). Полоски указывают средние значения ± среднеквадратичное отклонение.

    Выявленная ассоциация активированных клеточных ансамблей Кеньона с поражением электрическим током зависит от временного совпадения обоих стимулов

    Чтобы проверить, действительно ли вызванное тренировкой изменение поведения вызвано временным совпадением или смежностью активности клеток Кеньона и наказания, мы временно разделили термогенетическую активацию нейронов и электрический шок на 5 минут («непарное обучение»).Никакого значительного изменения температурных предпочтений обработанных и контрольных мух, которые не подвергались воздействию электрического тока, не наблюдалось (рис. 7A). Чтобы дополнительно проверить, влияет ли временная последовательность искусственно созданных ансамблей клеток Кеньона и наказания на обучение, мы также подвергали животных «прямой» и «обратной» парадигме обучения. Мухи действительно показали значительное изменение в поведении, когда термогенетическая активация клеток Кеньона предшествовала последующему наказанию («прямая тренировка», рис. 7В).Напротив, «обратное обучение», во время которого наказание предшествовало активации клетки Кеньона, не вызывало никаких изменений в поведении (рис. 7C). Эти эксперименты демонстрируют, что действительно временная связь между активностью клеток Кеньона и наказанием вызывает формирование аверсивной памяти. В заключение, вход в грибовидное тело не требуется для формирования ассоциативной памяти, и активность обученных клеток Кеньона управляет выученным поведением избегания.

    Рисунок 7.Прямое, но не обратное или непарное обучение вызывает обучение. (A) «Непарная» парадигма обучения. Мух, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Kenyon, подвергали в течение 2 минут электрошоку и, после 5-минутной задержки, подвергали воздействию 30 ° C для активации клеток Kenyon («Обучение»). Контрольные животные лечились одинаково, но без поражения электрическим током. Не наблюдалось значимой ( p > 0,1) разницы в предпочтениях температуры между обученными животными и контрольными животными.Столбцы указывают количество мух с предпочтениями для диапазона температур в ячейках 1 ° C, указанных на оси абсцисс. Точки указывают на температурные предпочтения каждой отдельной мухи. Наложенные линии указывают медианы и межквартильный размах. (B) Парадигма обучения «Вперед». Мух, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Kenyon, инкубировали при 30 ° C для активации клеток Kenyon, а затем подвергали в течение 2 минут электрошоку. Контрольные животные лечились одинаково, но без поражения электрическим током.Дрессированные мухи показали значительный ( p <0,001) сдвиг в предпочтении температуры по сравнению с контрольными животными. (C) Парадигма «обратного обучения». Мух, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 в случайных ансамблях клеток Kenyon, подвергали в течение 2 минут электрошоку, а затем подвергали воздействию 30 ° C для активации клеток Kenyon. Контрольные животные лечились одинаково, но не подвергались воздействию электрического тока. Дрессированные мухи не показали каких-либо значимых ( p > 0.05) изменение температурных предпочтений по сравнению с контрольными животными. Статистический тест: U-критерий Манна-Уитни (*** p <0,001).

    Термогенетическая активация нейронов после клеток Кеньона не вызывает обучения

    Затем мы проверили, может ли обучение быть локализовано в нейронах ниже по течению от клеток Кеньона (выходных нейронов грибовидного тела). Мы сосредоточились на тех выходных нейронах грибовидного тела, которые, как было показано, необходимы для восстановления памяти (Séjourné et al., 2011).Было показано, что эти выходные нейроны грибовидного тела реагируют на обонятельные стимулы (Séjourné et al., 2011). Временное сочетание запаха с наказанием электрическим током вызывает снижение активности Ca 2+ , вызванное обученным запахом, но не контрольным запахом после обучения. Поскольку эти нейроны сильно реагируют на запаховые стимулы, мы проверили, может ли активность этих нейронов, совпадающая с поражением электрическим током во время тренировки, вызвать обучение ниже по течению от грибовидных тел.Мы экспрессировали d TRPA1-mCherry в этих нейронах и некоторых неидентифицированных нейронах в грудных ганглиях, используя штамм мух R71D08-Gal4 (Фигуры 8A, C, D), и представили электрические разряды одновременно с термогенетической активацией нейронов. Мы не смогли наблюдать значительных поведенческих изменений в тестовой ситуации (рис. 8B). Хотя было показано, что эти выходные нейроны необходимы для декодирования воспоминаний (Séjourné et al., 2011), мы обнаружили, что термогенетическая активация этих нейронов при совпадении с наказанием недостаточна для приобретения или восстановления памяти.Конечно, нельзя исключить, что искусственная активация других типов или большего количества нейронов ниже по течению от клеток Кеньона при совпадении с карательным стимулом может вызвать усвоенную ассоциацию.

    Рис. 8. Искусственная активация выходных нейронов грибовидного тела, временно связанная с электрическим током, не вызывает обучения. (A) d Экспрессия TRPA1-mCherry, управляемая R71D08-Gal4 в головном мозге и грудном ганглии. (B) Температурные предпочтения обученных и контрольных мух, которые экспрессируют d TRPA1-mCherry в выходных нейронах грибовидного тела.Столбцы указывают количество мух с предпочтением диапазона температур в ячейках 1 ° C, указанных на оси абсцисс. Точки указывают на температурные предпочтения отдельных мух. Наложенные линии указывают медианы и межквартильный размах. Мухи, обученные при 30 ° C, не показали значительного сдвига в предпочтении температуры по сравнению с контрольной группой ( p > 0,4; U-критерий Манна-Уитни). (C) Увеличенное изображение экспрессии d TRPA1-mCherry в популяции выходных нейронов грибовидного тельца, определенной с помощью R71D08-Gal4. (D) Трехмерная реконструкция выходных нейронов положительного грибовидного тельца R71D08-Gal4. Нейропилы, окрашенные антителом против bruchpilot, изображены зеленым, а экспрессия d TRPA1-mCherry, окрашенная антителом против RFP, — пурпурным. Масштабные линейки = 50 мкм.

    Редкость активированных клеточных ансамблей Kenyon критична для ассоциативного обучения

    У Drosophila и других насекомых запаховые стимулы вызывают активность нейронов в относительно небольшом количестве клеток Кеньона из больших популяций нейронов, принцип кодирования информации, обычно называемый «разреженным кодированием» (Perez-Orive et al., 2002; Шишка и др., 2005; Джортнер и др., 2007; Ито и др., 2008; Мурти и др., 2008; Тернер и др., 2008; Луо и др., 2010; Honegger et al., 2011). Мы проверили, влияет ли фактическое количество активированных клеток Кеньона на эффективность ассоциативного обучения и восстановления памяти. Мы использовали промотор теплового шока для контроля экспрессии флиппазы с помощью различной продолжительности теплового шока. Количество клеток Kenyon, экспрессирующих mCherry- d TRPA1, увеличивалось с увеличением продолжительности теплового шока (Фигуры 9A, B, E).Клетки Kenyon, экспрессирующие mCherry- d TRPA1, проецируются на все доли, включенные в линию mb247-Gal4, то есть α / β- и γ-доли (Фигуры 9D, E). Мухи, которые экспрессировали mCherry- d TRPA1 в 76 ± 17 (среднее ± стандартное отклонение) клетках Kenyon, не показали какого-либо ассоциативного обучения (фигура 9C). Однако мухи, которые экспрессировали mCherry- d TRPA1 в 116 ± 17 (среднее ± стандартное отклонение), показали значительный сдвиг температурных предпочтений у обученных мух (фигура 9C). Эти результаты демонстрируют, что обучение, вызванное искусственной активацией клеток Кеньона, совпадающей с поражением электрическим током, требует минимального количества клеток Кеньона.Однако дальнейшее увеличение количества клеток Kenyon, активированных mCherry- d TRPA1, до 211 ± 48 (среднее ± стандартное отклонение) (фиг. 9C) или путем экспрессии d TRPA1-mCherry в больших пропорциях α / β- и γ-доли с использованием mb247-Gal4 (рисунки 10A, B, D, E) не привели к какому-либо значительному обучению (рисунок 10C). Следовательно, ассоциативное обучение ансамблями клеток Кеньона зависит как от минимального, так и от максимального количества клеток Кеньона.

    Рис. 9. Количество активированных клеток Кеньона влияет на способность к обучению.(A) Типичные изображения чашечек грибовидных тел мух, не получавших теплового шока, 1 или 4 ч теплового шока во время развития, чтобы вызвать экспрессию mCherry- d TRPA1. Масштабные линейки = 30 мкм. (B) Продление теплового шока во время развития вызывает увеличение количества клеток Кеньона, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 (** p <0,01; *** p <0,001. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA) . Полоски указывают средние значения ± стандартное отклонение. (C) Температурное предпочтение мух, которые экспрессируют mCherry- d TRPA1 в ансамблях клеток Kenyon и которые подвергались воздействию электрического тока при 30 ° C («обучены»), по сравнению с мухами, которые не подвергались ударам электрическим током ( «контроль»).Эти три группы различаются по продолжительности индукции экспрессии гена и количеству клеток Kenyon, экспрессирующих mCherry- d TRPA1, как указано в (B) . На графиках указаны медианы, межквартильные диапазоны, минимальные и максимальные значения. Значительный сдвиг в предпочтении температуры во время тестовой ситуации обнаруживается только у животных, которые получили 1-часовую индукцию экспрессии гена во время развития, по сравнению с контрольными мухами ( p <0,05). Нет значительной разницы в температурных предпочтениях у мух, не получивших теплового шока ( p > 0.1) или которые получили 4-часовой тепловой шок во время развития ( p > 0,9) по сравнению с соответствующими контролями. Статистический тест: U-критерий Манна-Уитни с поправкой на Бонферрони. (* p <0,05). (D) Типичные изображения лепестков α / β- и γ-лепестков грибовидного тела мух, которые не получили теплового шока, 1 или 4 ч теплового шока во время развития, чтобы вызвать экспрессию mCherry-dTRPA1. Масштабные линейки = 50 мкм. (E) Слева: трехмерная реконструкция грибовидных тел и клеток Кеньона, экспрессирующих mCherry- d TRPA1 (4-часовой тепловой шок во время развития).Вход указывает на фокальную плоскость (синий прямоугольник) в области стебля, в которой могут быть анатомически дифференцированы α / β- и γ-доли. Справа: количественная оценка площади внутри подобластей стебля, которая показывает экспрессию mCherry- d TRPA1, нормализованную к общей площади, определенной окрашиванием анти-bruchpilot (brp). Продление теплового шока во время развития вызывает увеличение относительной площади, занимаемой клетками Kenyon, экспрессирующими mCherry- d TRPA1 в фокальной плоскости (* p <0.05; Односторонний дисперсионный анализ, N ≥ 8 грибовидных тел от 5 до 7 животных). Масштабные линейки = 10 мкм.

    Рис. 10. Искусственная активация большинства α / β- и γ-долевых клеток Kenyon одновременно с электрическим током не вызывает обучения. (A) d Экспрессия TRPA1-mCherry в головном мозге и грудном ганглии с использованием драйвера mb247-Gal4 (B) Увеличение соматы клеток Кеньона (so) и чашечки грибовидного тела (cx). Масштабная линейка = 30 мкм. (C) Температурные предпочтения обученных и контрольных мух, которые экспрессируют d TRPA1-mCherry в клетках Kenyon под контролем mb247-Gal4.На прямоугольных диаграммах показаны медианы, межквартильные диапазоны, минимальные и максимальные значения. Мухи, обученные при 30 ° C с помощью электрического шока, показали температурные предпочтения, которые существенно не отличались ( p > 0,08; U-критерий Манна-Уитни) по сравнению с контрольными животными, которые не получали электрический шок. (D) Mb247-Gal4-индуцированная экспрессия d TRPA1-mCherry (1) ограничена α / β- и γ-долями. На панели (2) показано иммунное окрашивание против bruchpilot в качестве маркера нейропила.Панель (3) показывает оверлей (пурпурный: mCherry, зеленый: bruchpilot). (E) Не обнаруживается экспрессия d TRPA1-mCherry в грудном ганглии (1) . Нейропилы окрашиваются антителом против bruchpilot (2) . Панель (3) показывает оверлей (пурпурный: mCherry, зеленый: bruchpilot). Масштабные линейки = 50 мкм.

    Обсуждение

    Десятилетия исследований привели к нынешней концепции, согласно которой грибовидное тело насекомых играет решающую роль в ассоциативном обонятельном обучении (Heisenberg, 2003; Davis, 2005; Fiala, 2007).Наша работа способствует реализации этой концепции в двух аспектах. Во-первых, мы впервые показываем, что возбуждение ансамблей клеток Кеньона при совпадении с электрическим током достаточно и причинно, чтобы вызвать ассоциативную память. Во-вторых, наши данные дают представление о том, как извлекается память, хранящаяся в ансамблях ячеек Кеньона. Реакция избегания, которую животные проявляют после обучения, основывается на замкнутой обратной связи между поведенческими действиями животных и результирующей реактивацией (или ее избеганием) клеток Кеньона.Подмножества клеток Kenyon, которые искусственно активируются в наших экспериментах, были определены линией mb247-Gal4 (Zars et al., 2000), которая управляет экспрессией генов в клетках Kenyon α / β- и γ-долей, но не экспрессии генов. лепестки α ‘/ β’. Для обонятельного обучения требуется экспрессия брюквы и экспрессия D1-подобного допаминового рецептора DopR только в γ-долях (Zars et al., 2000; Qin et al., 2012), что указывает на преобладающую роль этой субпопуляции клеток Kenyon. для обонятельного ассоциативного обучения и формирования кратковременной памяти.Α / β-доли также участвуют в восстановлении кратковременной обонятельной памяти (McGuire et al., 2001; Krashes et al., 2007). Роль альфа / бета-долей в ассоциативном обучении запахам остается неясной, поскольку сообщалось, что синаптическая передача от нейронов альфа / бета-долей необходима для приобретения и консолидации обонятельной кратковременной памяти ( Krashes et al., 2007), но генетическое спасение мутации брюквы в α ‘/ β’ -долях не восстанавливает кратковременную память (Blum et al., 2009). Наши данные предполагают, что обучение может происходить в отсутствие активности нейронов α ‘/ β’ -долей, предполагая, что эти нейроны не требуются для приобретения и восстановления ассоциативной памяти в нашей парадигме. Это, однако, не исключает возможности того, что клетки Кеньона α ‘/ β’ -долей могут выполнять эквивалентную функцию. Однако мы обнаружили, что для обучения, вызванного искусственной активацией клеток Кеньона, совпадающей с поражением электрическим током, требуется минимальное и максимальное количество клеток Кеньона.Это соответствует анатомии и физиологии выходных нейронов грибовидных тел, что предполагает интеграцию синаптически взвешенных и суммарных выходных данных в больших популяциях клеток Кеньона (Cassenaer and Laurent, 2007, 2012; Séjourné et al., 2011). Интересно, что количество клеток Kenyon, которые эффективно вызывают ассоциативную память (~ 5%), совпадает с зарегистрированным количеством клеток Kenyon, активируемых запахами (Turner et al., 2008; Honegger et al., 2011), и, по-видимому, отражает диапазон разреженности, оптимизированный не только для хранения (кодирования) информации, но и для считывания (декодирования) из памяти.В какой степени наш экспериментальный подход, использующий искусственную активацию нейронов, действительно воспроизводит процессы ассоциативного обучения естественному запаховому стимулу, еще предстоит исследовать. Однако наш вывод о том, что энграмма памяти может быть индуцирована в редко активированных ансамблях клеток Кеньона, демонстрирует поразительные параллели с сообщениями с участием мышей, в которых случайные ансамбли корковых нейронов разных областей мозга были оптогенетически активированы вместе с вознаграждением или наказанием (Huber и другие., 2008; Choi et al., 2011; Лю и др., 2012). Здесь животные также научились приближаться или активно избегать реактивации тех клеток, которые были оптогенетически стимулированы одновременно с наказанием или вознаграждением, соответственно (Choi et al., 2011). Эта ситуация аналогична нашему открытию, в котором восстановление аверсивной памяти характеризуется замкнутым контуром обратной связи между поведенческим действием и, как следствие, активностью обученных клеток Кеньона. Следовательно, несмотря на эволюционное расстояние между млекопитающими и насекомыми, их нейронные сети разделяют общие принципы обработки информации и формирования памяти.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Мы признательны Х. Танимото, Г. Струлу и П. Гаррити за штаммы мух и конструкции ДНК, Э. Бюхнеру за антитела, У. Печу и С. Диппелю за создание штаммов мух и Х. Урбанке, С. Демпевольф, Дж. Бёкер, С. Кастельон, Т.Мюмеру и Й. Хоффманну за техническую помощь. Работа была поддержана Немецким исследовательским фондом (SFB 889 / B04, FI 821 / 3-1) и Министерством образования и исследований Германии через Центр вычислительной нейробиологии им. Бернштейна в Геттингене (01GQ1005A). Дэвид Фасмер получил стипендию за выдающиеся достижения в Геттингенской высшей школе неврологии, биофизики и молекулярной биологии (GGNB). Мы признательны за поддержку Немецкому исследовательскому фонду и Фонду публикаций открытого доступа Геттингенского университета.

    Список литературы

    Блюм А., Ли В., Кресси М. и Дубнау Дж. (2009). Кратковременная и долговременная память у Drosophila требует передачи сигналов цАМФ в разных типах нейронов. Curr. Биол . 19, 1341–1350. DOI: 10.1016 / j.cub.2009.07.016

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Брэнд, А. Х. и Перримон, Н. (1993). Нацеленная экспрессия генов как средство изменения судьбы клеток и создания доминантных фенотипов. Развитие 118, 401–415.

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст

    Чой, Г. Б., Стеттлер, Д. Д., Каллман, Б. Р., Бхаскар, С. Т., Флейшманн, А., и Аксель, Р. (2011). Управление противоположным поведением с помощью ансамблей грушевидных нейронов. Ячейка 146, 1004–1015. DOI: 10.1016 / j.cell.2011.07.041

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Коннолли, Дж. Б., Робертс, И. Дж., Армстронг, Дж. Д., Кайзер, К., Форте, М., Талли, Т. и др. (1996). Ассоциативное обучение нарушено нарушенной передачей сигналов Gs у грибовидных тел Drosophila . Наука 274, 2104–2107. DOI: 10.1126 / science.274.5295.2104

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Дубнау, Дж., Грейди, Л., Китамото, Т., и Талли, Т. (2001). Нарушение нейротрансмиссии у грибовидного тела Drosophila блокирует извлечение, но не приобретение памяти. Природа 411, 476–480. DOI: 10.1038 / 35078077

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Хамада, Ф. Н., Розенцвейг, М., Канг, К., Пулвер, С. Р., Геззи, А., Джегла, Т. Дж. И др. (2008). Внутренний термодатчик, контролирующий предпочтительную температуру в Drosophila . Природа 454, 217–220. DOI: 10.1038 / nature07001

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Онеггер, К.С., Кэмпбелл, Р.А.А., и Тернер, Г.С. (2011). Визуализация популяции с клеточным разрешением показывает устойчивое разреженное кодирование в теле гриба Drosophila . Дж.Neurosci . 31, 11772–11785. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1099-11.2011

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Huber, D., Petreanu, L., Ghitani, N., Ranade, S., Hromádka, T., Mainen, Z., et al. (2008). Редкая оптическая микростимуляция в бочкообразной коре головного мозга способствует обучению поведению свободно движущихся мышей. Природа 451, 61–64. DOI: 10.1038 / nature06445

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Джортнер Р.А., Фаривар, С. С., Лоран, Г. (2007). Простая схема подключения для разреженного кодирования в обонятельной системе. Дж. Neurosci . 27, 1659–1669. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.4171-06.2007

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Крашес, М. Дж., Кин, А. К., Люнг, Б., Армстронг, Дж. Д., и Уодделл, С. (2007). Последовательное использование подмножеств нейронов грибовидных тел во время обработки памяти запаха Drosophila . Нейрон 53, 103–115. DOI: 10.1016 / j.neuron.2006.11.021

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Лю, X., Рамирес, С., Панг, П. Т., Пурье, К. Б., Говиндараджан, А., Дейссерот, К., и др. (2012). Оптогенетическая стимуляция инграммы гиппокампа активирует воспоминание о страхе. Природа 484, 381–385. DOI: 10.1038 / природа11028

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Луо, С. X., Аксель, Р., Эбботт, Л. Ф. (2010). Генерация редких и избирательных ответов третьего порядка в обонятельной системе мух. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 107, 10713–10718. DOI: 10.1073 / pnas.1005635107

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Паркс, Т. Л., Элиа, А. Дж., Дикинсон, Д., Хилликер, А. Дж., Филлипс, Дж. П., и Булиан, Г. Л. (1998). Увеличение продолжительности жизни Drosophila за счет сверхэкспрессии человеческого SOD1 в моторнейронах. Нат. Genet . 19, 171–174. DOI: 10.1038 / 534

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Печ, У., Dipt, S., Barth, J., Singh, P., Jauch, M., Thum, A.S, et al. (2013). Разное грибовидное тело: трансгенные штаммы Drosophila , экспрессирующие анатомические и физиологические сенсорные белки в клетках Кеньона. Перед. Neural. Схемы . 7: 147. DOI: 10.3389 / fncir.2013.00147

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Перес-Орив, Дж., Мазор, О., Тернер, Г. К., Кассенаер, С., Уилсон, Р. И., и Лоран, Г. (2002). Колебания и разрежение представлений запаха в грибовидном теле. Наука 297, 359–365. DOI: 10.1126 / science.1070502

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Цинь, Х., Кресси, М., Ли, В., Коравос, Дж. С., Иззи, С. А., и Дубнау, Дж. (2012). Гамма-нейроны обеспечивают дофаминергический ввод во время формирования аверсивной обонятельной памяти у Drosophila . Curr. Биол . 22, 608–614. DOI: 10.1016 / j.cub.2012.02.014

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Рименспергер, Т., и Фиала, А. (2013). «Оптофизиологические подходы к обучению и памяти у Drosophila melanogaster», в Обучение и память беспозвоночных , ред. Р. Мензель и П. Р. Бенджамин (Лондон: Academic Press / Elsevier), 59–66.

    Schlake, T. и Bode, J. (1994). Использование мутированных сайтов-мишеней распознавания FLP (FRT) для обмена кассетами экспрессии в определенных хромосомных локусах. Биохимия 33, 12746–12751. DOI: 10.1021 / bi00209a003

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Сежурне, Ж., Plaçais, P. Y., Aso, Y., Siwanowicz, I., Trannoy, S., Thoma, V., et al. (2011). Эфферентные нейроны грибовидного тела, ответственные за аверсивное восстановление обонятельной памяти у Drosophila . Нат. Neurosci . 14, 903–910. DOI: 10.1038 / nn.2846

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Синакевич, И. Грау, Ю., Штраусфельд, Н. Дж., И Бирман, С. (2010). Динамика глутаматергической передачи сигналов в грибовидном теле молодого имаго Drosophila . Neural Dev . 5:10. DOI: 10.1186 / 1749-8104-5-10

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Шишка П., Дитцен М., Галкин А., Галиция К. Г. и Мензель Р. (2005). Редкость и временное обострение обонятельных представлений грибовидных тел медоносных пчел. J. Neurophysiol . 94, 3303–3313. DOI: 10.1152 / jn.00397.2005

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Танг, X., Платт, M.D., Лагнезе, К. М., Лесли, Дж. Р. и Хамада, Ф. Н. (2013). Интеграция температуры на термочувствительных нейронах AC в Drosophila . Дж. Neurosci . 33, 894–901. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1894-12.2013

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Тиан, Л., Хайрес, С. А., Мао, Т., Хубер, Д., Чиаппе, М. Э., Чаласани, С. Х. и др. (2009). Визуализация нейронной активности у червей, мух и мышей с улучшенными показателями кальция GCaMP. Нат. Методы 6, 875–881.DOI: 10.1038 / nmeth.1398

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., et al. (2006). Bruchpilot, белок, гомологичный ELKS / CAST, необходим для структурной целостности и функции синаптических активных зон в Drosophila . Нейрон 49, 833–844. DOI: 10.1016 / j.neuron.2006.02.008

    Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    .

    Ответить

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *