Пп на: Правильное питание (ПП) ⇔ Меню здорового, сбалансированного питания на каждый день

Содержание

Правильное (здоровое) питание (ПП) — «Как я похудела на ПП на 20 кг до размера S. Фото до и после. ПП РЕЦЕПТЫ и МНОГО АППЕТИТНЫХ БЛЮД. Мотивация, с чего начать ПП и как не срываться. ПП преображает не только тело, но и жизнь.»

💚 Доброго времени суток всем!

 

У каждого своя история перехода на ПП. Одни открывают для себя правильное питание когда стремятся похудеть, другие приходят к этой системе питания в надежде улучшить своё состояние здоровья, третьи следуют моде и т.д.

Я обратилась к ПП сначала в надежде похудеть, затем я увидела не только изменения к лучшему моей фигуры (всё же похудеть на 20 кг это заметно), но и самочувствия.

Естественно я сама набрала лишние килограммы, никогда не заморачивалась и не ограничивала себя в сладком, особо не переедала, но постепенно вес стал критическим.

И когда пришло осознание того, что фигура мягко говоря далека от идеала, что я могу выглядеть намного лучше, я просто решила уменьшить порции, стала изучать разные методики питания, занялась подсчётом калорий и мне это приносило удовольствие. Конечно спорт снова вошёл в мою жизнь, я снова стала заниматься по своей любимой фитнес-программе.

Но постоянно считать калории — скучно, необходимо так наладить свой режим дня, чтобы организм насыщался полезными нутриентами из качественной еды и воды.

Правильное питание

Я более 1,5 лет на ПП и понимаю, что это самый верный способ оставаться в форме, никакие диеты в долгосрочной перспективе не дадут такого устойчивого результата. Качество тела и даже жизни, здоровья также зависит и от того, что мы едим.

«Не для того я живу, чтобы есть, а для того, чтобы жить — ем»

Марк Фабий Квинтилиан

Поэтому в этом отзыве я хотела бы более подробно остановиться на принципах ПП, меню, поделиться своими рецептами и результатами.

Итак, поехали

📍 ПП — это не диета, это способ жизни, при котором ты осознанно выбираешь те продукты, которые насыщают организм полезными нутриентами, продлевают молодость и дают энергию.

 

К сожалению, многие считают, что:

  • правильно питаться — это дорого
  • не представляют как разнообразить меню на ПП, чтобы оно было вкусным.

 

Мой опыт подсказывает, что статья расходов на еду в нашем семейном бюджете снизилась по сравнению с тем, что мы покупали ранее. Ведь колбасы, пирожные, тортики, конфеты — самые дорогие продукты и не зря производители так их рекламируют и красиво упаковывают. Затраты на фрукты, овощи, гречку, бурый рис, овсянку, куриную грудку, рыбу, яйца, творог в сумме выходят немного ниже, чем на вышеперечисленные вредные продукты.

А по 2 пункту, меню на ПП может быть очень разнообразным и аппетитным, всё зависит только от вас и вашего желания приготовить своим домашним что-то полезное и вкусное. Иногда можно даже не готовить, а съесть сочные и вкусные фрукты, овощи.

ПП перекус

А теперь поговорим о принципах ПП.

📍 ПРИНЦИПЫ ПП:

✔️ исключаем из рациона заведомо вредные продукты —

полуфабрикаты, фаст-фуд, газированные напитки, сладости, колбасные изделия, консервы, чипсы и т.п.

Покупайте продукты по сезону, так снижается вероятность наличия пестицидов в овощах и фруктах.

Обожаю клубнику, покупаю только в сезон:

ПП перекус

Без вредной еды легко жить, хотя иногда можно себе позволить немного, если душа просит)

✔️ вода — большинство знают, что пить лучше всего чистую, негазированную воду около 1,5-2 литров в день, но не надо себя заставлять столько пить. Ежедневно после пробуждения выпивать стакан воды и пить воду за 20 минут до приёма пищи и не запивать ей еду. Вода действительно помогает хорошо худеть и

я заметила, что волосы не секутся.

✔️ питание должно быть сбалансированным по БЖУ, поэтому мне очень пригодился подсчёт калорий, мне уже было просто сформировать хороший рацион — около 50% отводится углеводам, около 30 % — белкам и 20 % — жирам:

  • обычно норму белка предполагается рассчитывать по массе тела, на 1 кг массы тела желательно поступление минимум 1 г белка;
  • желательно применение полиненасыщенных жиров, т.е. оливковое, льняное масло, рыбу, семечки, орехи, авокадо и т. д.;
  • лучше всего заменить быстрые углеводы на медленные — каши, цельнозерновой хлеб, макаронные изделия из муки дурум, овощи. А фрукты, ягоды, мёд включают в рацион до 16-17 вечера.

✔️не сбивать пищевой режим — по возможности питаться следует в одно и то же время, при этом завтрак должен быть полноценным, обед — также хорошим, а вот ужин — более лёгким.

У меня обычно 2 основных приёма пищи + 2-3 перекуса (фрукты, орехи). Для похудения лучше питаться небольшими порциями и 4-5 раз в день.

✔️ после 18.00 есть можно, только ужин должен быть по-возможности лёгким и последний раз принимать пищу лучше за 3 часа до сна;

✔️ исключить жареное — блюда лучше варить, запекать, отваривать на пару, тушить.

Рецепты ПП

✔️

снизить потребление соли;

✔️ включить в рацион свежие овощи и зелень, салаты из них, они помогают процессу пищеварения и насыщают организм полезными микронутриентами;

✔️ фрукты — кладезь витаминов, кроме того они такие вкусные, только не следует ими заедать пищу;

ПП перекус

✔️ отказаться от рафинированного сахара и от синтетических сахарозаменителей, от скрытого сахара также. Лучше применять мёд, фрукты, яблочное пюре, банан, стевию.

Если совсем сложно отказаться от сладкого, то в первой половине дня иногда можно полакомиться

небольшим количеством чёрного шоколада, пастилы, мармелада, зефира или сухофруктов.

Чёрный шоколад на ПП

✔️ наладить нормальный обмен веществ — такой режим питания сам по себе уже способствует этому.

Сначала кажется, что очень много ограничений, что всё это сложно, какой-то непонятный режим, но постепенно всё становится на свои места и такая система становится нормой и ничего не надо считать или подсматривать в правила.

Такой подход позволяет наслаждаться пищей, чувствовать весь спектр вкуса и при этом держать себя в форме.

 

Немного о себе

📍 Параметры до перехода на ПП:

  • Исходный вес до ПП- 73 кг
  • Размер одежды до ПП- 50
  • Объем груди — 96 см
  • Объем талии — 78 см
  • Объем бедер — 108 см
  • Рост — 167 см

Фотография до:

Я наконец-то взяла себя в руки и стала тренироваться и достаточно быстро перешла на ПП. Сложнее всего было отказаться от шоколада, а на булочки и тортики меня никогда не тянуло и чай я уже давно пила без сахара.

Чёрный шоколад на ПП

Самый верный метод отказаться от сладкого — не покупать шоколад и другие сладости, не включать их в рацион и через 1,5-2 недели тяга ослабевает и потом проходит. Проверено на себе.

Для того, чтобы похудеть я определила свой калорийный коридор, который находился в рамках от 1300-1500 ккал. Хотя были дни, когда я потребляла чуть меньше 1200 Ккал, зная что это очень мало и даже вредно.

В самом начале я даже вела дневник и все записывала, но через пару месяцев режим наладился и я постепенно перестала так заморачиваться.

Благодаря ПП и тренировкам я плавно сбросила 20 кг. За первый месяц я сбросила 3 кг, в последующие месяцы вес снижался на 1,5 — 2 кг в месяц, и так за 10 месяцев я скинула 20 кг. Сменила 50 размер на 42.

Для сравнения фото до и после перехода на ПП:

Фото до и после перехода на ПП

 

За 10 месяцев я похудела на 20 кг, параметры стали такими:

  • Вес — 53 кг
  • Размер одежды — 42-44
  • Объем груди — 84 см, итого — 12 см
  • Объем талии — 62 см, итого — 16 см
  • Объем бедер — 90 см, итого — 18 см
  • Рост — 167 см

ПП мотивация

Конечно был эксперимент и я в последний месяц провела

БУЧ и просушила тело, избавилась от проблемных зон, но главная заслуга в похудении и поддержании результата всё же ПП. При этом в последние полгода я тренируюсь не так часто, придерживаюсь ПП, только этой зимой позволяла себе немного конфет и шоколада.

 

📍 КАКИЕ ПРОДУКТЫ ЛУЧШЕ ВКЛЮЧИТЬ В РАЦИОН:

 

✔️ ФРУКТЫ, СУХОФРУКТЫ И МЁД

Они прекрасно заменяют сахар и продукты, их содержащие. Кроме того, фрукты — кладезь витаминов и микроэлементов, необходимых нашему организму. Я стараюсь покупать фрукты по сезону, хорошего качества.

Фрукты — прекрасный десерт. Я очень редко из них что-то готовлю, могу только положить банан, ягоды или яблоки в выпечку, но очень редко, так как при теплообработке они теряют большую часть витаминов.

Фрукты, сухофрукты и мёд лучше кушать до 17.00. Хотя я признаюсь, что могла их кушать и в 7-8 вечера.

ПП перекус

ПП перекусы

✔️ ОВОЩИ И ЗЕЛЕНЬ

Овощи я покупаю по сезону, редко приобретаю зимой огурцы, так как они не очень вкусные и содержат мало полезных веществ. Зато осенью-зимой часто готовлю блюда с тыквой, она сочетается практически со всеми продуктами.

✔️ КРУПЫ

Являются прекрасным источником сложных углеводов и отчасти белка. Особенно полезна каша на завтрак или на обед.

Мои любимые каши — овсяная крупа, гречневая, смесь бурого и дикого риса (он имеет аромат шоколада), пшеничка.

Овсяным хлопьям быстрого приготовления лучше предпочесть крупы, которые необходимо варить. Если с утра мало времени, то можно замочить их на несколько часов вечером, так из некоторых круп выйдет вредная фитиновая кислота.

Крупы лучше употреблять до 17.00.

✔️ БОБОВЫЕ

Отличный источник растительного белка.

Источник белка на ПП

Из чечевицы, фасоли, гороха, нута можно приготовить множество блюд от супов до запеканок.

✔️ ЖИРЫ

Отдаём предпочтение оливковому, льняному маслу и другим нерафинированным маслам, рыбе, орехам и семечкам, авокадо. Мне авокадо не понравилось, я его так и не смогла применять в рационе.

Я покупаю льняное, оливковое, подсолнечное масло первого отжима и обычно заправляю им салаты и уже готовые каши.

Жиры на ПП

Вот только хранится нерафинированное масло не так долго, может помутнеть и прогоркнуть. Особенно быстро портится льняное масло (срок хранения после вскрытия около 1 месяца), поэтому я обычно покупаю его в маленьких бутылочках — до 100 г. Подсолнечное хранится после вскрытия около 3 месяцев.

Для жарки больше подойдёт кокосовое масло. Хотя я редко обжариваю продукты, если приходится, то применяю рафинированное масло, иногда оливковое.

 

Сливочное масло

Я не любитель сливочного масла. На ПП его можно включать в рацион, например добавлять в каши до 10 г.

Орехи

Я покупаю необжаренные и несолёные орехи. Для снижения содержания фитиновой кислоты их следует замачивать, я так не всегда делаю.

 

✔️ Нежирные сорта мяса

На ПП предполагается применение в рационе нежирных сортов мяса: куриная грудка, филе индейки, говядина.

Их желательно запекать, отваривать, тушить, готовить на гриле без добавления масла.

После БУЧ я практически не включаю эту категорию в рацион, это уже выбор каждого.

✔️ Яйца

Яйца содержат не только белок в легкоусваяемой форме, но и полезные жиры, витамины, микроэлементы:

Это фолиевая кислота, биотин, холин, витамины А, Е, D, В12, В3, селен, магний, калий, фосфор, железо и кальций. Но вот усваиваются хорошо не все витамины и минералы. Например, не стоит обольщаться высоким содержанием в яйце кальция — он весьма плохо усваивается (усвоению кальция из яиц, как и из молока, мешает животный белок, которого в яйце предостаточно).

Конечно не стоит злоупотреблять ими, лучше ограничиться 2-4 шт в неделю.

Потенциальный вред от яиц :

сальмонеллез, холестерин, антибиотики, нитраты, гормоны

 

Одно большое яйцо содержит около 260 мг холестерина. Министерство Здравоохранения рекомендует ограничить потребление холестерина 200 мг в сутки из всех продуктов.

 

✔️ ТВОРОГ и молочные продукты

 

Сразу скажу, что я с детства не люблю молочные продукты, практически их не включаю в рацион. О пользе и вреде молочных продуктов сказано много, есть как сторонники, так и противники включения этих продуктов в рацион. Решать каждому самостоятельно и ещё это дело вкуса.

Рецепты ПП

Меню ПП

К сожалению, молочные продукты сейчас активно подделываются, разбавляются и т.п. Поэтому лучше выбирать домашний творог и молочку у знакомых фермеров, хотя это не гарантия качественного продукта.


📍 РЕЦЕПТЫ ПРАВИЛЬНОГО ПИТАНИЯ

МЕНЮ НА КАЖДЫЙ ДЕНЬ

✔️ЗАВТРАК

КАШИ

Каша на завтрак дают заряд энергии до обеда. Я обычно готовлю на воде, а вот мужу на молоке.

Не стану повторять блюда из других отзывов, гранола, овсяноблин, мюсли, ленивые вареники — уже многие их готовили, покажу немного новых и несколько весенних и летних рецептов.

Мои любимые каши: овсяная с сухофруктами или фруктами и мёдом, пшеничная с маслом или также с сухофруктами, гречка зелёная или обычная, рисовая с изюмом и тыквой, кукурузная с кусочком сыра:

ПП овсянка

ПП рецепты

Рисовую кашу готовлю на воде, мужу нравится на молоке. Отдельно отвариваем рис, отдельно тыкву кусочками, потом объединяем и украшаем ягодами. Кому-то нравится рисовая каша вязкая, сваренная на молоке, а потом уже добавляют тыкву, так выходит более сытно.

ПП рецепты

ПП рецепты

А каким ароматным оказалась смесь бурого и дикого риса — мне напоминает аромат кэроба, какао:

ПП рецепты

✔️ Блюда из яиц и творога

Вариаций множество, от обычного омлета или глазуньи до овсяноблина, запеканок и т.д.

ПП рецепты

 

ОБЕД

 

✔️ ПЕРВЫЕ БЛЮДА

Супы нас приучали кушать с детства, это удобный вариант, если необходимо накормить много людей и при этом сэкономить.

Лучше варить супы на овощных и рыбных бульонах, если варите на мясе или птице, то следует готовить на втором бульоне, т.е. первый бульон сливать.

Вот несколько моих вариаций супов:

крем-суп готовится быстро и просто, можно приготовить тыквенный или томатный крем-суп, просто нарезать тыкву кусочками, можно добавить немного картофелин, морковки, лука,такой себе овощной бульон — так суп будет сытнее, отварить до готовности, взбить блендером, добавить обжаренные грибы с луком, посыпать зеленью:

ПП суп

Супы на овощных бульонах:

ПП рецепты

Или вот такая необычная вариация борща с цветной капустой, фасолью, щавелем:

Борщ

Супы на рыбном бульоне:

ПП рецепты

✔️ ВТОРЫЕ БЛЮДА

 

Обычно вторые блюда я запекаю, так и быстрее, и полезнее, или тушу, варю. Масло добавляю уже в готовое блюдо и не всегда.

Готовые соусы давно не покупаю.

Вариаций вторых блюд множество, на обед это может быть рыба, или грибы, или просто тушёные овощи со сложными углеводами и салатами. А на ужин — с овощным гарниром.

Или это могут быть грибы с овощами или макаронами из твёрдых сортов пшеницы:

Углеводы на ПП

А какой аппетитный молодой картофель:

На ужин стоит отдать предпочтение овощам с белковыми продуктами или без них:

ПП меню

Среди «вредностей» на ПП иногда готовлю (чаще мужу) хинкали, пиццу на лаваше или ПП запеканки:

Рецепты ПП

Рецепт кекса с грибами:

на 6 небольших кексов

взбить 2 яйца + щепотка соли (совсем немного) + 75-80 г муки + гашенную соду 1/4 ч.л. + 5 г оливкового или другого масла. Из этих ингредиентов получится тесто как густая сметана.

Отдельно обжарить, потушить грибы с луком на небольшом количестве масла, выложить на дно формы, залить тестом, поставить запекаться в духовку на 25 минут при 180 С (если форма большая, то дольше).

Готовые кексы можно украсить сыром и зеленью:

ПП выпечка

Пиццу на лаваше делать очень просто:

можно самой приготовить тонкий лаваш. Для этого налить в кастрюлю 80 мл воды + щепотку соли + 5 мл (или 1 ч.л.) растительного масла, поставить на огонь, довести до кипения. Затем просеиваем 1 стакан муки (130-140г) в отдельную миску и понемногу вливаем горячую водную смесь в муку, помешивая, чтобы не было комочков.

Скатать тесто, чтобы не липло к рукам (можно ещё добавлять муки, если липнет), положить в п/э пакет, даём настояться 1 час, затем делим на части и очень тонко раскатываем тесто. Затем обжариваем на сухой, горячей сковороде без масла с обеих сторон.

Проще конечно купить готовый лаваш и потом делать пиццу:

ПП пицца

Или можно из лаваша приготовить лазанью, ПП рулет в лаваше:

ПП рулет

На перекусы из того же тонкого лаваша можно приготовить рулеты с творогом и лососем, или просто с творогом, огурчиком и зеленью и т.д.:

✔️ РЫБА

Хотелось бы чаще включать в рацион красную рыбу, но обычно я покупаю скумбрию, иногда лосось или форель. Для меня быстрее и вкуснее всего готовить рыбу в фольге без добавления масла, немного посолив и добавив специи по вкусу и дольки лимона или апельсина:

ПП рецепты

ПП рецепты

ПП рецепты

✔️ САЛАТЫ

Салаты ем каждый день, особенно обожаю лёгкие весенне-летние салаты. Давно не покупаю майонез, заправляю нерафинированным маслом, соком лимона или апельсина, специями, зеленью:

ПП рецепты

ПП рецепты

ПП рецепты

Сметану редко добавляю, просто молочка не моё.

Сейчас отдаю предпочтение салатам из овощей:

ПП рецепты

ПП салат

На праздники готовлю различные вариации салатов с рыбой или креветками:

ПП салат

✔️ ПП СЛАДОСТИ

Иногда позволяю себе ПП конфеты, готовятся они быстро из смеси сухофруктов, банана, можно добавить орешков, украсить по желанию:

ПП конфеты

Панкейки на ржаной муке с творогом или бананом:

ПП выпечка, панкейки

Рецепт очень нежных панкейков

Взбить 1 яйцо + щепотка соли + вода 100 мл или 100 мл молока (1/2 стакана) + цельнозерновая пшеничная мука или овсяная, или ржаная мука 70 г (1/2 стакана) добавлять понемногу и вымешивать + размятый вилкой или блендером творог 80 г с бананом 80 г (1 небольшой банан) + 5 г подсолнечного или другого масла (1 ч.л.).

Получится тесто густой консистенции как сметана. Выкладывать столовой ложкой тесто на раскалённую сухую сковородку с антипригарным покрытием, можно в виде сердечек:)

Панкейки быстро обжариваются, около минуты с одной стороны и со второй.

Иногда делаю овсяное печенье — хорошо и для перекуса, можно взять с собой:

ПП сладости

Рецепт овсяного печенья:

в готовую вязкую овсяную кашу 100- 150 г добавляю 1 банан, несколько фиников без косточки (даже яйцо не всегда добавляю), выкладываю ложкой эту массу на противень, застелённый пергаментной бумагой и выпекаю при 180 С минут 30-40.

ПП кексы

Или выпекаю самые разные кексы: с творогом, с яблоком (мини-шарлотка), с ягодами

ПП кексы

ПП сладости

ПП шарлотка

Рецепт кекса с разными ягодами, яблоком:

на 6 небольших кексов

взбить 2 яйца + 10 г мёда (1,5 ч.л.), или 10 г сахара, или заменить стевией + щепотка соли (совсем немного) + 75-80 г муки овсяной или ржаной + гашенную соду 1/4 ч.л. + 5 г оливкового или другого масла. Из этих ингредиентов получится тесто по консистенции как густая сметана.

Для шоколадных кексов добавить 1 ч.л. без горки какао-порошка в тесто, хорошо вымесить.

Нарезать яблоко маленькими кусочками, выложить на дно формы, посыпать ягодами, можно финики или изюм, залить тестом, поставить запекаться в духовку на 25 минут при 180 С (если форма большая, то дольше).

ПП мини запеканка с творогом

ПП сладости

Такие аппетитные кексы можно взять с собой или перекусить (желательно не каждый день:)

Безе цветное или обычное готовится очень быстро, напоминает макаруны, только без добавления миндальной муки:

ПП безе

Для безе понадобится белок 1 яйца (на порцию — 4-6 двойных безе), его надо взбивать с соком лимона и 1/2 ч.л. сахара или мёда до устойчивых пиков блендером 4-5 минут, потом выложить чайной ложкой на противень, застелённый пергаментной бумагой и выпекать при 180 С 15 минут.

Для цветного безе используем немного какао-порошка, или сок ягод (смородины). Безе немного липнет к зубам, зато оно очень нежное с хрустящей корочкой:

Безе цветное

До обеда иногда позволяю себе немного чёрного шоколада, когда активно худела, то совсем его исключала:

✔️ СМУЗИ

С прошлого лета я стала готовить смузи — ягодные, с какао, зелёные (с листьями шпината). Особенно приятны такие напитки летом, когда так много ягод и сочных фруктов:

Рецепты ПП Смузи

Рецепты ПП Смузи

Шоколадный ПП смузи

Делать их просто и быстро. На основе таких смузи можно делать мороженое без сахара, особенно мне нравится шоколадно-банановое — очень вкусное:)

ПП мороженое

Для шоколадного мороженого взбиваю 1 банан, нарезанный кусочками, лучше добавить немного воды (до 100 мл) + 1 ч.л. какао-порошка без горки (4 г), можно добавить кокосовую стружку — она вносит свой оттенок вкуса. Выложить массу в форму и положить форму в морозилку на 3 часа.

ПП мороженое шоколадное

ПП мороженое

Конечно я не каждый день так украшаю блюда, но для родных и для себя стараюсь, чтобы ПП блюда были не только вкусными, полезными, но и красивыми:)

Можно не заморачиваться и съесть просто фрукты, просто сваренную кашу, овощи:

ПП перекус

Сейчас я чаще отдаю предпочтение более простым блюдам:

ПП перекусы

🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃

 

Главное не загонять себя в рамки, не зацикливаться на еде (было у меня и такое:), а жить на полную по мере своих возможностей, развиваться если есть желание и время. А хорошее питание, качественное — залог более крепкого здоровья, хотя всегда есть к чему стремиться.

Сначала я соблюдала все принципы ПП и действительно тело стало меняться, стало меняться и сознание. На ПП у меня не было срывов, я питалась сбалансированно и вкусно, при этом самочувствие улучшилось. Интересно было изучать разные исследования о продуктах, о системах питания, как питание влияет на нас и на сколько можно продлить молодость и сохранить здоровье.

Если Вы действительно желаете похудеть, то необходимо сделать первые шаги, начать заниматься собой, начать с питания, подключить тренировки (не обязательно ходить в спортзал — я тренировалась дома), можно пойти на плавание, тем более летом, т.е. заняться любимым видом спорта, танцами и постепенно всё изменится — у кого-то быстрее, а для кого-то эти изменения будут происходить плавно и постепенно.

 

Желаю Вам достичь поставленных целей и цените жизнь)💐💐💐

Спасибо за внимание!

🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃🍃

📍 Как я похудела на 7 кг за месяц, подсушила тело и избавилась от проблемных зон

📍 Фитнес-программа, которая помогла мне похудеть на ПП

📍 «Мой здоровый рацион» — сайт для подсчёта калорийности и БЖУ блюд

 

Больше отзывов на мои методы похудения и натуральную косметику, на путешествия, на новинки кино в профиле 🌺 IraLight🌺

Муфта переходная с ПП на Евроконус 20х3/4″ (Pro Aqua)

Характеристики

Диаметр резьбы 3/4″
Резьба Внутренняя
ДиаметрПП 20
PN 25 бар
Материал Полипропилен + латунь
Максимальная рабочая температура + 95°С
Бренд Pro Aqua
Артикул PA75010P
Вес 0 кг
Страна Россия
БрендПП ProAqua
ТипПП Прочее
pp_Цвет белый

Гарантия и Возврат

Гарантия

Вы можете быть уверены в качестве приобретаемых товаров, так как абсолютно все наши поставщики – проверенные производители и официальные дилеры.

Товары, приобретенные в нашем интернет-магазине, в случае поломки или неисправности обслуживаются по гарантии сервис-центрами, авторизованными производителями. 

Обратите внимание, гарантийный срок на изделия устанавливают производители, он отмечен в гарантийном талоне. Обязательно проверяйте наличие гарантийного талона при приемке товара! 

Если гарантийные сроки соблюдены, но сервисный центр отказывается принять изделие на постпродажное обслуживание, обратитесь к нам по телефону +7-800-505-13-83, мы постараемся вам помочь.

Обмен или возврат товара надлежащего качества


Потребитель вправе отказаться от товара в любое время до его передачи, а после передачи товара — в течение 7 дней.

Условия обмена товара:
· товар не был подключен к коммуникациям;
· сохранены упаковка и товарный вид изделия;
· сохранены пломбы, фабричные ярлыки товара;
· сохранены товарный и кассовый чеки;
· сохранены установленные производителем комплектующие и документы (инструкция по эксплуатации, гарантийные талоны и т.д.).

Для обмена и возврата товара вы можете воспользоваться инструкциями нашего сотрудника по телефону +7-800-505-13-83 и заполнить заявление.

При обмене и возврате товара надлежащего качества соответствующие транспортные расходы продавцом не возмещаются.
Возврат денежных средств осуществляется наличным или безналичным расчетом, в зависимости от того, в какой форме была произведена оплата.

Возврат товара ненадлежащего качества

Вы можете отказаться от заказа при приемке товара, если нарушена его целостность, внешний вид или его размеры, комплектация не соответствуют характеристикам, описанным на сайте. 

Рекомендуем внимательно ознакомиться с изделием во время приемки.

Потребитель вправе отказаться от товара в любое время до его передачи, а после передачи товара — в течение 7 дней.

Для возврата товара вы можете воспользоваться инструкциями нашего сотрудника по телефону +7-800-505-13-83 и заполнить заявление.

Возврат денежных средств осуществляется наличным или безналичным расчетом, в зависимости от того, в какой форме была произведена оплата.

Для ПП на 1С:Предприятие 8.0-8.2

Имя *

Укажите, пожалуйста, как вас зовут

Телефон *

Некорректный формат мобильного телефона или номер введен не полностью

Комментарий

Эл. почта

Электронная почта указывается только латиницей, обязательно должен присутствовать знак @, доменное имя не может быть короче двух символов.

Отправляя эту форму, Вы соглашаетесь с Политикой конфиденциальности
и даете согласие на обработку персональных данных компанией «1С‑Рарус».

Блок из 2 подсумков под маг. ПП на лип.

Основные характеристики

Описание: Блок из 2 подсумков под маг. ПП на лип.

Блок из 2 подсумков на липучке под магазины к распространенным в России моделям пистолетов-пулеметов. С возможностью регулировки по высоте и поперечными утяжками

  • Крепление: две съемные клипсы, в комплект не входят. Для крепления на классическую систему PALS/MOLLE необходимо две ячейки в ширину и от двух до трех горизонтальных рядов ячеек в высоту. Внимание! Для крепления подсумка необходимо приобрести две одинаковых клипсы следующих типов:
  • Для платформ PALS/MOLLE и ремней шириной до 50 мм включительно:
    2M MOLLE 125 мм
    5″ TacTie (Maxpedition)
    MALICE Long (Tactical Tailor)
    FixClip 5″ (Kiwidition)
  • Для ремней шириной до 60 мм включительно:
    2M MOLLE 60 мм
  • Для ремней шириной 58-60 мм (например, Ремень US):
    ALICE
    2M MOLLE 60 мм
  • Обеспечивается совместимость со следующими магазинами:
    30-ти зарядный 9×19 ПП-19-01 Витязь/Сайга-9
    30-ти зарядный 9×18 ПМ ПП-90
    30-ти зарядный 9×18 ПМ Кедр ПП-91
    30-ти зарядный 9×18 ПМ АЕК-919К Каштан
    30-ти зарядный 9×21 СР-2 Вереск
    20-ти зарядный 9×19 ПП-2000
    30-ти зарядный 9×19 HK MP-5
    32-х зарядный 9×19 UZI
  • Подсумок рассчитан на плотную посадку магазинов
  • Основное отделение подсумка сшито целиком из двух слоев ткани Cordura® 500d для прочности. Клапаны изготовлены из одного слоя нейлоновой 38 мм стропы
  • Из каждого отделения выглядывает минимум по 3 см высоты самых коротких магазинов, что удобно для их извлечения
  • Поперечное сечение каждого отделения утягивается вшитой 50 мм резинкой. Благодаря утяжке магазин плотно удерживается в подсумке даже при расстегнутом клапане (клапан за ненадобностью можно заправить под магазин, когда требуется быстрый доступ). Резинка расположена ниже входа в подсумок, благодаря чему вход образует расширяющуюся кверху горловину, облегчая введение магазинов
  • Подсумок застегивается на липучки. Липучка на самом подсумке длиннее, чем на клапане. Это нужно для надежного сцепления по всей возможной площади при регулировке для магазинов разной высоты
  • На концах клапанов 2 см ухватки для удобства расстегивания подсумка даже в толстых перчатках
  • Все липучки пришиты усиленным способом
  • Все срезы ткани и строп спрятаны под швы или окантованы для надежности и аккуратного внешнего вида
  • На дне имеются люверсы для дренажа воды

ХАРАКТЕРИСТИКИ:

  • Стропы: 100% нейлон
  • Нитки: Liberty® (Нидерланды) филаментные нейлоновые бондированные
  • Материал: Cordura® 500d (100% нейлон)
  • Липучка: Alfatex® (Бельгия)
  • Вес: 76 г
  • Размер (В×Ш×Т): 20×9,5×2,5 см (указана минимальная высота)

 

В нашем интернет-магазине «Варяг» вы можете купить оригинальный Блок из 2 подсумков под маг. ПП на лип. компании ООО «Сплав».

Мы осуществляем поставки непосредственно с предприятия, которое обеспечивает обмундированием отечественные Вооруженные Силы. Наша продукция – это оригинальные товары по низким ценам, и качество – на высоком уровне. Заказать товар можно из любого уголка России.

 

Все товары всегда имеются на складе, поэтому вам не придется долго ждать своего заказа. Если же что-то не подошло – вы можете отказаться от покупки и забрать свои деньги обратно.

 

Если у вас остались вопросы – вы можете позвонить нам по номерам телефона +7(499)-136-96-55 и +7(962)538-65-55 или заказать обратный звонок. Наши менеджеры предоставят вам подробную консультацию и помогут оформить заказ.

Рекомендуемые товары

Коврик придверный Toledo 60×80см влаговпит ПП на осн ПВХ Indavo арт660-230

Интерьер и отделка

Напольные покрытия

Плитка керамическая и сопутствующие товары

Камень декоративный и сопутствующие товары

Лакокрасочные материалы

Пены, клеи, герметики

Панели для отделки стен

Двери

Фурнитура и скобяные изделия

Окна и комплектующие

Карнизы, шторы, жалюзи

Обои

Потолочные системы

Декоративные элементы

Предметы декора и сувениры

Текстиль

Посуда

Организация хранения на кухне

Благоустройство

Садовая техника

Садовый инструмент

Моющая техника

Снегоуборочная техника и инвентарь

Тачки и комплектующие

Емкости, полив

Обустройство сада

Тротуарная плитка

Садовая мебель

Заборы и ограждения

Уход за растениями

Семена и растения

Бытовая химия и косметика

Товары для уборки

Уход за одеждой и обувью

Системы хранения

Канцтовары

Товары для животных

Стройматериалы

Изоляционные материалы

Строительные смеси

Кровля и водосточные системы

Устройство стен и потолка

Древесно-плитные материалы

Пиломатериалы

Металлопрокат

Общестроительные материалы

Стеновые и фасадные материалы

Инструмент

Электроинструмент

Ручной инструмент

Расходные материалы к инструменту

Газовое и сварочное оборудование

Спецодежда и средства защиты

Хозтовары, расходные материалы

Пневмоинструмент

Высотные конструкции

Измерительные инструменты

Станки и оборудование

Силовая и строительная техника

Бензоинструмент

Мебель

Мебель столовая

Мебель для кухни

Мебель для прихожих

Мебель офисная

Мебель для ванной

Электрика

Электромонтажное оборудование

Освещение

Удлинители и сетевые разъемы

Фонари и элементы питания

Кабели и провода

Системы прокладки кабеля

Электрощитовое оборудование

Электромонтаж

Телекоммуникация

Системы наблюдения и оповещения

Инструмент и материалы для пайки

Инженерные системы

Отопление

Водоснабжение

Насосное оборудование

Системы фильтрации воды

Вентиляция

Печное оборудование

Канализация

Газоснабжение

Дренажные системы

Бытовая техника

Крупногабаритная бытовая техника

Встраиваемая техника

Мелкая техника для кухни

Климатическая техника

Мелкая техника для дома

Прокат

Прокат Генераторов

Прокат Грузоподъемного оборудования

Прокат Измерительного инструмента

Прокат Компрессоров

Прокат Мотопомп и погружных насосов

Прокат Нагревателей воздуха

Прокат Оборудования для работы на высоте

Прокат Оборудования для стройплощадки

Прокат Опалубки

Прокат Освещения

Прокат Расходных материалов

Прокат Резьбонарезного оборудования

Прокат Садовой техники

Прокат Сварочного оборудования

Прокат Строительного оборудования

Прокат Строительной техники

Прокат Уборочного оборудования

Прокат Электроинструмента

Подписание письма от чужого имени

Если вы работаете в компании, которая рассылает несколько писем различным государственным учреждениям, поставщикам, клиентам или потенциальным клиентам, то, вероятно, невозможно, чтобы каждый документ лично подписывал отправитель после того, как документы были подготовлены секретарем или персоналом. В этих случаях третье лицо может подписаться от имени другого лица.

Простые заочные подписи

Компании часто рассылают простые письма с просьбой об одном и том же от нескольких клиентов.Если вы отправляете такие письма, чтобы сделать один и тот же запрос от всех ваших клиентов или клиентов, вы можете использовать печать с подписью или инициалы «p.p.» Это латинское выражение «per procurationem», что означает «заботиться о чем-то». Его следует использовать, если вы являетесь сотрудником, подписывающим свою подпись на форме.

Процедура и методы

Существует ряд методов, которые можно использовать при написании «p.p.» Его можно разместить перед вашей подписью или над напечатанным именем отправителя.Кроме того, вы также можете подписать форму и напечатать имя отправителя над своей подписью. В этом случае вы поместите «p.p.» перед вашей подписью.

Какой бы метод вы ни выбрали, он должен стать стандартизированным, чтобы вы всегда использовали один и тот же метод. Такая последовательность поможет избежать недоразумений, если письма от имени другой стороны подписывают несколько сотрудников.

Подписи доверенности

Вы также можете использовать доверенность для выполнения подписи от имени другого лица.Закон позволяет вам продолжать финансовую или юридическую деятельность, используя этот метод.

Если кто-то дает вам доверенность на подпись за него, вы должны сначала подписать имя этого человека, а затем указать свое собственное имя. Это будет сопровождаться словом «кем», которое следует поместить под или сбоку от имени человека, за которого вы подписываетесь. После подписи вы должны написать инициалы «доверенность» или «доверенность».

Например, если имя человека, для которого вы подписываете, — Джо Джексон, а ваше имя — Блейк Смит, вы должны написать «Джо Джексон, автор — Блейк Смит, доверенность.В некоторых случаях вам нужно будет приложить формы, подтверждающие, что у вас есть доверенность.

Подпись родителей и опекунов

В некоторых штатах несовершеннолетние не могут нести юридическую ответственность по контракту. В ситуациях, когда речь идет о несовершеннолетнем, а вы являетесь его родителем или опекуном (формы выпуска или банковские счета), вам может потребоваться подпись от их имени.

Для этого в качестве родителя или опекуна вы должны подписать их подпись, включить фразу «от имени и по поручению», а затем подписать имя несовершеннолетнего.На этом типе документа также может потребоваться подпись или напечатанное имя несовершеннолетнего.

Выполняя эти действия для подписи от имени другого лица, вы будете следовать передовым практикам и договорному праву.

Джим Триболд — писатель из Северной Каролины. Он живет согласно мантре «Учите по одной новой вещи каждый день»! Джим любит писать, читать, крутить педали на своем электрическом велосипеде и мечтать о больших вещах. Напишите ему, если вам нравится его текст, он любит слышать от своих читателей!

Полипропилен — обзор | Темы ScienceDirect

7.12.1 Полипропилен — стерилизация паром или ЭО

Полипропилен менее токсичен и более биосовместим с тканями, чем полиэтилен. Однако, чтобы быть совместимым с облучением, природный полипропилен должен быть модифицирован путем включения добавок (или путем сополимеризации), способных улавливать свободные радикалы и предотвращать дальнейшее окисление. Следовательно, он менее биосовместим, чем натуральный полипропилен. Таким образом, для натурального полипропилена предпочтительны другие методы, чем облучение, чтобы гарантировать биосовместимость. ПП более восприимчив к сильным окислителям (например.грамм. озон), чем полиэтилен. Термостабилизированный полипропилен для ортопедических имплантатов можно стерилизовать паром.

PP использовался в небольших секциях для различных хирургических нужд. Влияние гидролитических ферментов на полипропилен минимально, но он может разлагаться из-за окисления. Однако сумма, необходимая для создания грудного имплантата, вызывает серьезные проблемы у пациентов. ПП — это губчатый материал, который может впитывать жидкость и расширяться после имплантации. Риск быстрого расширения представляет собой серьезные проблемы, и, следовательно, полипропилен не рекомендуется для имплантатов груди.

Хирургическая сетка из полипропилена может быть стерилизована паром или ЭО. Осложнения, которые могут возникнуть после имплантации любой хирургической сетки, включают инфекцию, воспаление, образование свищей, экструзию и образование спаек при непосредственном контакте с кишечником. Любой имплантированный материал не должен физически изменяться тканевыми жидкостями, быть химически инертным, вызывать воспалительную реакцию или реакцию клеток инородного тела, быть неканцерогенным, вызывать аллергические реакции, выдерживать механические нагрузки и быть пригодным для недорогого изготовления и стерилизация без тканевой реакции.

PP, который часто используется в качестве имплантируемой сетки, вызывает заметную хемотаксическую активность в тканях, прилегающих к протезу грыжи. PP может стимулировать иммунокомпетентные клетки пациентов с протезными имплантатами. На степень реакции с инородным телом также влияет структура полипропиленовой нити и площадь поверхности, которые отдают предпочтение моноволоконным материалам. Тканевая реакция на легкий полипропилен характеризуется более низкой хронической воспалительной реакцией, чем на тяжелый полипропилен. Полипропилен использовался в качестве биоразлагаемых швов при операциях на глазах, а также в структурах сердечных клапанов.

Во многих ситуациях температуры стерилизации паром могут быть слишком высокими, чтобы полимеры и биоматериалы, устойчивые только к низким температурам, могли нормально функционировать после стерилизации. В то время как термостабилизированный полипропилен более совместим с паровой стерилизацией, нестабилизированный полипропилен может разрушаться под действием тепла. Деградация ПП может произойти после трех автоклавов. Следовательно, ЭО является предпочтительным методом стерилизации, если требуется более одной повторной стерилизации. В противном случае стерилизацию ПП сетки паром следует проводить только один раз.

Ингибитор передачи сигналов Ras LOX-PP взаимодействует с Hsp70 и c-Raf для снижения активации Erk и трансформированного фенотипа клеток рака молочной железы

Аннотация

Ген лизилоксидазы ( LOX ) ингибирует передачу сигналов Ras в трансформированных фибробластах и ​​раке груди клетки. Его активность была сопоставлена ​​с пропептидным доменом из 162 аминокислот (LOX-PP) белка-предшественника лизилоксидазы. LOX-PP ингибирует передачу сигналов Erk, подвижность и образование опухоли в модели ксенотрансплантата рака груди; однако его механизм действия в значительной степени неизвестен.Здесь был использован подход соочищения-масс-спектрометрии с использованием эктопически экспрессированного LOX-PP в клетках HEK293T и идентифицированного белка теплового шока / шаперона Hsp70. Взаимодействие Hsp70 с LOX-PP было подтверждено с помощью коиммунопреципитации внутриклеточно и бактериально экспрессируемых и эндогенных белков. Взаимодействие было сопоставлено с пептидсвязывающим доменом Hsp70 и аминокислотами LOX-PP с 26 по 100. Ассоциация LOX-PP снижала активность шаперона Hsp70, связанную с рефолдингом белка и выживаемостью после теплового шока.LOX-PP взаимодействовал с шаперонированным белком c-Raf Hsp70. Было показано, что при использовании эктопической экспрессии LOX-PP дикого типа и белков делеции, нокдауна малой интерферирующей РНК (siRNA) и Lox — / — эмбриональных фибробластов мыши взаимодействие LOX-PP с c-Raf снижается. нижестоящая активация MEK и NF-κB, миграция и независимый от закрепления рост и снижение его митохондриальной локализации. Таким образом, взаимодействие LOX-PP с Hsp70 и c-Raf ингибирует критический промежуточный продукт в Ras-индуцированной передаче сигналов MEK и играет важную роль в функции этого опухолевого супрессора.

ВВЕДЕНИЕ

Лизилоксидаза (LOX) (протеин-6-оксидаза; EC 1.4.3.13) является ключевым внеклеточным ферментом, который контролирует сшивание коллагена и эластина, которое требуется для биосинтеза функциональных внеклеточных матриксов. Ген LOX был выделен как рецизионный ген Ras ( rrg ), обладающий способностью ингибировать трансформирующую активность онкогена H- Ras в фибробластах NIH 3T3 (10, 35). Сообщалось о снижении экспрессии LOX при многих карциномах (5, 21, 23, 33, 60, 63, 73).Экспрессия гена Ectopic LOX в клетках рака желудка приводила к снижению образования опухолей у мышей nude (33). Лизилоксидаза синтезируется и секретируется в виде неактивного профермента массой 50 кДа (Pro – LOX), который процессируется протеолитическим расщеплением до функционального фермента 32 кДа (LOX) и пропептида 18 кДа (LOX-PP). Экспрессия Pro – LOX в Ras -трансформированных фибробластах NIH 3T3 ингибировала активность киназ Erk1 / 2 и Akt и фактора транскрипции NF-κB (30). Впоследствии LOX-PP был идентифицирован как ингибитор передачи сигналов Ras и трансформированного фенотипа в фибробластах NIH 3T3 (51), клетках рака молочной железы NF639 (44), раке легких h2299 и клетках рака поджелудочной железы PANC-1 с мутантом RAS и TP53 гены (73).В клетках NF639, управляемых Her-2 / neu, который передает сигналы через Ras, экспрессия LOX-PP снижает Her-2 / neu-опосредованную передачу сигналов и активацию Erk в экспоненциально растущих клетках или после стимуляции сывороткой (44). LOX-PP также уменьшал мезенхимальный фенотип in vitro , о чем судили по индукции эпителия и снижению мезенхимальных маркеров, а также по образованию инвазивных колоний в матригеле и образованию ксенотрансплантата опухоли на модели голых мышей (44). Кроме того, LOX-PP ослаблял стимулированную фибронектином передачу сигналов интегрина и миграцию в клетках рака молочной железы (75).Вместе эти исследования предполагают роль LOX-PP в ингибировании инвазивного фенотипа карцином, но точные механизмы, с помощью которых он функционирует, не выяснены.

Hsp70s представляют собой семейство белков стрессовой реакции, которые действуют как молекулярные шапероны, которые предотвращают агрегацию белков, а также повторно укладывают денатурированные или развернутые белки за счет их АТФазной активности, катализируемой АТФ-гидролизом (22, 32). Семейство Hsp70 человека включает по крайней мере 8 различных генов, которые кодируют изоформы Hsp70, расположенные на нескольких разных хромосомах.Белки семейства Hsp70 являются структурно консервативными и включают домен АТФазы в аминоконцевой области, пептид-связывающий домен в карбоксиконцевой области и кислотный мотив (EEVD) в крайней карбоксиконцевой области. Белки семейства Hsp70 локализуются в ядре, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, аппарате Гольджи, цитозоле и внеклеточной поверхности клетки. Двумя основными цитоплазматическими изоформами являются Hsc70 и Hsp70 / Hsp72, которые также называют Hsp70. Как правило, Hsc70 широко и повсеместно экспрессируется в неопухолевых тканях, тогда как экспрессия Hsp70 / Hsp72 индуцируется различными сигналами.Конститутивно экспрессируемые белки Hsp70 / Hsp72 были обнаружены в нескольких опухолях. При раке груди сверхэкспрессия Hsp70 была связана с более короткой выживаемостью без болезней, более инвазивным фенотипом и худшим прогнозом (9). Точная роль семейства Hsp70 / Hsp72 при раке полностью не изучена; однако эти белки могут вносить вклад в выживаемость опухолевых клеток и туморогенез за счет множества антиапоптотических функций и своей роли в качестве коаперона для Hsp90 (47, 66, 76). Интересно, что сообщается, что двойное молчание Hsc70 и Hsp70 индуцирует опухолеспецифический апоптоз (57).В настоящем исследовании мы идентифицировали белок Hsp70 как нового партнера по связыванию LOX-PP, картировали домены взаимодействия и продемонстрировали, что LOX-PP может также связываться с c-Raf, клиентом Hsp70. Функционально взаимодействие с LOX-PP снижает функции шаперона и выживания Hsp70 при стрессе и снижает активацию c-Raf, который способствует более трансформированному фенотипу клеток рака молочной железы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Конструирование плазмид.

Для конструирования LOX-PP, меченного глутатионом на N-конце, S (GST) и его делеционных мутантов, кДНК, кодирующие аминокислоты (аа) от 1 до 162 (полная длина), от 1 до 115 (ΔC1), От 1 до 100 (ΔC2), от 1 до 77 (ΔC3), от 1 до 61 (ΔC4), от 1 до 25 (ΔC5), от 26 до 162 (ΔN1), от 62 до 162 (ΔN2), от 78 до 162 (ΔN3), 101 до 162 (ΔN4), от 116 до 162 (ΔN5) и от 26 до 100 (M1) и делеции аминокислот от 26 до 61 (ΔM1), от 26 до 77 (ΔM2) и от 26 до 100 (ΔM3) LOX-PP были амплифицирован из полноразмерной кДНК (44) и вставлен в сайт BamHI / ClaI вектора экспрессии млекопитающих pEBG-GST, щедрый подарок Брюса Майера (Центр здравоохранения Университета Коннектикута, Фармингтон, Коннектикут).Для конструирования LOX-PP с GST-меткой на С-конце кДНК, кодирующие GST и LOX-PP, амплифицировали и вставляли в pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Для конструирования белков, меченных V5 / His на С-конце, кДНК, кодирующие LOX-PP, LOX или Pro-LOX, вставляли в вектор pcDNA4 / V5-His (Invitrogen). Для получения рекомбинантного LOX-PP крысы рекомбинантный белок LOX-PP (rLOX-PP) –myc-His, в котором сигнальный пептид Pro – LOX был заменен пептидом из остеонектина (BM-40) в pcDNA4 / TO Вектор / myc-His использовали, как описано ранее (70).pCX bsr -Hsp70 и pAD-c-Raf были любезно предоставлены Майклом Шерманом и Владимиром Габаем (Школа медицины Бостонского университета, Бостон, Массачусетс) и Линдой Ван Элст (Лаборатории Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк), соответственно. . КДНК, кодирующая Hsp70 дикого типа (WT), была вставлена ​​в pEBG, pGEX4T-3 (GE Healthcare, Уппсала, Швеция) и pFLAG-CMV-2 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). КДНК, кодирующие Hsp70 ΔSmaI и ΔBglII, расщепляли SmaI и BglII соответственно, как описано Milarski и Morimoto (43), и вставляли в pFLAG-CMV2.КДНК, кодирующая c-Raf WT, была субклонирована в вектор pEGFP-C1 (Clontech, Пало-Альто, Калифорния) и pGEX4T-3. КДНК, кодирующая LOX-PP WT и ΔM3, была субклонирована в вектор pGEX4T-3. Все конструкции с делециями были созданы с помощью ПЦР и подтверждены секвенированием ДНК.

Культивирование клеток и условия обработки.

ERα-положительные клетки рака молочной железы MCF-7 и ZR-75 и ERα-отрицательные Hs578T, которые содержат мутантную конститутивно активную H-Ras, были приобретены из Американской коллекции типовых культур (ATCC; Manassas, VA).Клетки HEK293T почек эмбриона человека и клетки Bosc23 были получены из ATCC. Клетки поддерживали в минимальной необходимой среде Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамина и пенициллин-стрептомицина, как рекомендовано ATCC. Фибробласты мышиных эмбрионов (MEF) от Lox — / — или контрольных мышей C57BL / 6 получали, как описано ранее (39), и культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 20% FBS в среде DMEM с l-глутамином, заменимые аминокислоты, бикарбонат и антибиотики.Клетки T-Rex293 культивировали, как описано ранее (70). Клетки NIH 3T3 были любезно предоставлены Амитой Паламакумбура (Школа стоматологической медицины Голдмана Бостонского университета, Бостон, Массачусетс) и культивированы, как описано ранее (30). Линия клеток NF639, любезно предоставленная П. Ледером (Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс), была получена из опухоли молочной железы трансгенного вируса опухоли молочной железы (MMTV) — ERBB2 и культивирована, как описано ранее (18). Для обработки тепловым шоком клетки трансфицировали GST-меченным WT или ΔM3 LOX-PP или GST с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen).Через 24 часа клетки погружали в водяную баню при 45 ° C на 10 минут и оставляли для восстановления при 37 ° C в течение 24 часов. Затем клетки анализировали с использованием поглощения 0,4% трипанового синего (Invitrogen) на процент гибели клеток. Анализы были выполнены три независимых раза, каждый в двух экземплярах, и представлены средние значения ± стандартное отклонение (SD). Дуплексы РНК, используемые для нацеливания на мышь LOX (олигонуклеотид A, 5′-TAGGGCGGATGTCAGAGACTA-3 ‘; олигонуклеотид B, 5′-AACGATCCTTTCAAATTATAA-3’), были приобретены у Qiagen (Germantown, MD) и трансфицированы нМ с использованием Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

Анализ антител и иммуноблоттинг.

Антитела против Hsp70 (SPA-810), Hsp70 / Hsc70 (SPA-820) и Hsp90 (SPA-830) были приобретены у Stressgen (Виктория, Британская Колумбия, Канада). Антитела против α-тубулина (DM1A), β-тубулина (TUB 2.1), γ-тубулина (GTU-88), β-актина (AC-15) и FLAG (M2) были получены от Sigma-Aldrich. Антитела против Erk1 / 2 (№ 9102), p-Erk1 / 2 (фосфо-Thr202 / Tyr204; № 9101), Akt (№ 9272), MEK1 / 2 (L38C12; № 4694), p-MEK1 / 2 (phopho-Ser217 / 221; № 9121) и EGFR (№2232) были приобретены у Cell Signaling (Данверс, Массачусетс). Антитела от Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Калифорния) включали анти-GST (B-14) и анти-B-Raf (F-7). Антитела против c-Raf (клон 53) и Apaf-1 (A92820) были получены от BD Transduction (Franklin Lakes, NJ). Моноклональные антитела против V5 (R960-25) и COX-1 (COX 111) и поликлональные антитела против зеленого флуоресцентного белка (GFP) (A-6455) были получены от Invitrogen. Кроличьи поликлональные антитела против V5 (E14) от Delta BioLabs (Gilroy, CA) использовали для иммунопреципитации и иммунофлуоресцентной микроскопии.Антитело против метки His (120-003-812) было от Macs Miltenyi Biotec (Германия). Кроличьи поликлональные антитела против LOX-PP были либо получены, как описано ранее (27), либо были приобретены у Novus Biologicals (NBP1-30327) (Литтлтон, Колорадо) и реагировали с мышью или крысой или человеком или крысой соответственно.

Для приготовления лизатов целых клеток клетки солюбилизировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,5% SDS, 1 мМ Na 3 VO 4 и 10 мМ NaF. Лизаты разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) и подвергали иммуноблоттингу с использованием соответствующих первичных антител и вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) (козий антимышиный IgG-HRP [Santa Cruz; No.sc-2005] или антитела против кроличьего IgG-HRP [Bio-Rad; нет. 170-6515]), как описано ранее (30).

Аффинное выделение LOX-PP-взаимодействующих белков.

Клетки HEK293T, помещенные на шесть 35-мм чашек, трансфицировали 2 мкг экспрессионной плазмиды pEBG или pEBG-mLOX-PP на чашку с использованием реагента Lipofectamine 2000 в соответствии с протоколом производителя. Через 24 ч клетки лизировали в 300 мкл буфера A (25 мМ HEPES-KOH [pH 7,2], 150 мМ KCl, 2 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 1 мМ дитиотреитол, 0.5 мкг / мл лейпептина, 2 мкМ пепстатина A, 1 мкг / мл апротинина и 1% Triton X-100) на чашку. Лизаты центрифугировали в микроцентрифуге в течение 10 мин при 13000 об / мин при 4 ° C для удаления нерастворимого материала. Супернатант (около 2 мг) инкубировали с 20 мкл глутатион-сефарозы 4B (GE Healthcare) в течение 2 часов при 4 ° C. Смолу промывали четыре раза буфером для лизиса и белки элюировали загрузочным буфером SDS-PAGE. После разделения с помощью 10% SDS-PAGE белки визуализировали окрашиванием кумасси синим и выделяли полосы, соответствующие 70 кДа и 52 кДа.Протеолитическое расщепление в геле и масс-спектрометрия (жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия [ЖХ-МС-МС]) выполнялись в лаборатории биологической масс-спектрометрии Таплина (Бостон, Массачусетс).

Влияние АТФ на ассоциацию Hsp70 и LOX-PP.

Клетки HEK293T, высеянные на чашки диаметром 35 мм, трансфицировали указанными экспрессионными плазмидами. Через 24 ч лизаты клеток готовили в 300 мкл лизирующего буфера А или в том же буфере с 1 мМ АТФ и 2 мМ MgCl 2 , но без EDTA.Анализы с понижением GST выполняли, как описано выше. Гранулы промывали буфером для лизиса, и осажденные белки детектировали иммуноблоттингом.

Анализ рефолдинга люциферазы.

кДНК люциферазы, локализованной в цитоплазме (Luc-Cyto), в которой C-концевой сигнал пероксисомной локализации был разрушен мутацией Leu-Val аминокислоты в положении 550, была получена путем сайт-прямого мутагенеза, как описано Michels и другие. (42). Клетки HEK293T трансфицировали управляемой промотором цитомегаловируса (CMV) плазмидой экспрессии Luc-Cyto и меченным GST WT или ΔM3 LOX-PP или GST с использованием липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя.Через 24 ч культуры обрабатывали 20 мкг / мл циклогексимида в течение 30 мин при 37 ° C. Чтобы денатурировать экспрессированный белок люциферазы, клетки инкубировали при 45 ° C в течение 30 мин на водяной бане. Затем клетки инкубировали в течение указанных периодов времени при 37 ° C, чтобы обеспечить повторную укладку люциферазы и лизировать, и концентрации белка измеряли с использованием набора для анализа белков (Bio-Rad). Активность люциферазы в равных количествах лизатов белка измеряли с использованием системы анализа люциферазы (Promega, Madison, WI) в соответствии с протоколом производителя.

Получение рекомбинантных белков.

GST, GST-LOX-PP WT и ΔM3, GST-Hsp70 и GST-c-Raf были экспрессированы в Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen). Бактерии выращивали в бульоне Луриа при 30 ° C до A 600 0,5, и экспрессию белка индуцировали 0,1 мМ изопропил-β-d-тиогалактозидом. Через 3 часа для GST, GST-LOX-PP WT и ΔM3 и GST-Hsp70 или через 1 час для постиндукции GST-c-Raf бактерии собирали центрифугированием (3700 × g в течение 10 минут при 4 ° C), ресуспендировали в буфере для лизиса (1% Triton X-100, 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 1 мМ PMSF [pH 8.0]) и лизируется ультразвуком. Лизат центрифугировали при 13000 об / мин в течение 10 мин. Супернатант наносили на колонку глутатион-сефароза 4B, тщательно промывали лизисным буфером, содержащим 300 мМ NaCl и 0,1% Triton X-100, и элюировали фосфатным буфером (36 мМ Na 2 HPO 4 и 14 мМ NaH 2 PO 4 [pH 7,2]), содержащий 100 мМ NaCl, 0,1% тритона X-100 и 30 мМ глутатиона. Очищенный белок rLOX-PP – myc-His с сигнальным пептидом BM-40 (70) и слитыми белками GST (0.5 мкМ) использовали в анализах связывания, проводимых в фосфатном буфере, содержащем 100 мМ NaCl и 0,1% Triton X-100. Очищенные партнеры по связыванию в указанных концентрациях инкубировали в течение 3 ч при 4 ° C. Затем добавляли глутатион-сефарозу 4B и давали инкубироваться в течение 1,5 ч при 4 ° C при осторожном вращении. Гранулы осаждали на микроцентрифуге. После интенсивной промывки белки, связанные с шариками, солюбилизировали в буфере для образцов и подвергали SDS-PAGE с последующим иммуноблоттингом.

Анализ иммунопреципитации.

Клетки NF639, ZR-75 или NIH 3T3 лизировали буфером А, как описано выше. Либо кроличьи антитела против LOX-PP (ссылка 27 или NBP1-30327 [Novus Biologicals]), мышиные антитела против Hsp70 / Hsc70, либо кроличьи антитела против V5 (2 мкг) добавляли к 500 мкг клеточного лизата с последующей инкубацией в течение ночи при 4 ° С. Затем к смеси добавляли гранулы протеина G-сефарозы (Invitrogen) с последующей инкубацией при 4 ° C в течение 2 часов при осторожном встряхивании. Гранулы промывали четыре раза буфером А. Иммунные комплексы элюировали с гранул сефарозы буфером для образцов SDS-PAGE и осажденные белки анализировали вестерн-блоттингом.

Анализы миграции, инвазии, колоний и активности NF-κB.

Суспензии 1 × 10 4 клеток NF639 или MEF наслоили в трех экземплярах в верхних отсеках Transwell (Costar, Кембридж, Массачусетс) на поликарбонатном фильтре диаметром 6,5 мм (размер пор 8 мкм) и инкубировали при 37 ° C в течение указанного времени. Миграцию клеток к нижней стороне фильтра оценивали путем окрашивания кристаллическим фиолетовым и количественно оценивали спектрометрическим определением при A 570 , как описано ранее (75).Анализы проводили трижды независимо, каждый раз в трех экземплярах, и представлены средние значения ± стандартное отклонение. Суспензии 1 × 10 4 клеток NF639 наслаивали в верхнее отделение Transwell на поликарбонатный фильтр диаметром 6,5 мм (размер пор 8 мкм), предварительно покрытый 10 мкг матригеля, и инкубировали при 37 ° C в течение 6 часов. . Миграцию клеток определяли количественно, как описано выше для миграции клеток. Анализы на мягком агаре (30) и анализ люциферазы, управляемой NF-κB (73), проводили, как мы описали ранее.

Иммунофлуоресцентная микроскопия.

Клетки NF639, помещенные на покровные стекла, трансфицировали малой интерферирующей РНК (миРНК) в течение 48 часов. Клетки инкубировали в течение 30 минут в 250 нМ MitoTracker (Invitrogen), промывали PBS и фиксировали метанолом при -20 ° C в течение 5 минут. После промывки PBS клетки блокировали инкубацией в 2% (вес / объем) бычьем сывороточном альбумине (A3059; Sigma) в PBS (буфер 1) и инкубировали в течение 1 ч в первичных антителах, разведенных в буфере 1. После промывки PBS, покровные стекла инкубировали в течение 1 ч с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 488 (Invitrogen), разведенными в буфере 1.Затем покровные стекла помещали в антифадный реагент Slowfade Gold (Invitrogen) с Hoechst 33342 (Invitrogen) и наблюдали под микроскопом Nikon Eclipse E400. Изображения представляют два независимых эксперимента, выполненных в двух экземплярах.

Выделение митохондриальных мембран.

Клетки NF639, культивированные на 100-миллиметровых чашках и трансфицированные 20 нМ контрольной siRNA или siLOX олигонуклеотид B РНК в течение 48 часов или дикого типа или Lox — / — MEF, культивируемые на 150-миллиметровых чашках , собирали с помощью скребка для клеток с последующим центрифугированием.Дальнейшие действия проводили на льду или при 4 ° C. Клетки промывали 1 × PBS, а затем гомогенизировали 20 взмахами в 3 объемах буфера для гомогенизации (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,25 М сахароза, 5 мМ MgCl 2 , 10 мМ KCl и 1 мМ PMSF) в гомогенизатор из нержавеющей стали. После центрифугирования при 800 × g в течение 10 минут постнуклеарный супернатант центрифугировали при 3000 × g в течение 10 минут и полученный препарат митохондриальной мембраны один раз промывали буфером для гомогенизации.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Масс-спектрометрия идентифицирует Hsp70 как белок, связанный с LOX-PP.

Для идентификации белков, которые могут связываться с LOX-PP, мышиный пропептид был клонирован в вектор pEBG млекопитающих, который экспрессирует встроенные кДНК в виде слитых белков GST (41). Клетки HEK293T трансфицировали экспрессирующей плазмидой pEBG-mLOX-PP LOX-PP или контролем пустого вектора pEBG (EV). Через 24 ч экстракты готовили и инкубировали со смолой глутатион-сефароза 4B, а связанные белки тщательно промывали и элюировали загрузочным буфером SDS-PAGE.После 10% SDS-PAGE белки визуализировали окрашиванием кумасси синим (A). Полосы приблизительно 70 кДа и 52 кДа наблюдались в преципитатах GST-LOX-PP, но не в контрольной полосе GST. Их вырезали и подвергали протеолитическому расщеплению в геле и масс-спектрометрии (ЖХ-МС-МС). Полосы были идентифицированы как белок теплового шока 70 кДа (Hsp70) и α / β-тубулин соответственно (). Чтобы подтвердить масс-спектрометрический анализ, белки GST – LOX-PP и GST были очищены из клеток HEK293T в маломасштабном анализе GST с понижением и подвергнуты вестерн-блоттингу на Hsp70, α-тубулин, β-тубулин и γ-тубулин. и для β-актина и GST в качестве контроля нагрузки.Hsp70 специфически очищается с GST-LOX-PP, как и все три белка тубулина (B), подтверждая ассоциации, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии. Hsp90, который часто функционирует как коаперон с Hsp70, неожиданно не был обнаружен в белках, очищенных с помощью LOX-PP на колонке со смолой, что было визуализировано окрашиванием кумасси синим в A. Постоянно, когда мы тестировали его присутствие непосредственно с помощью иммуноблоттинга, Hsp90 не обнаруживался среди белков, соосаждавшихся с GST-LOX-PP (B).Связь эктопически экспрессируемого LOX-PP с эндогенными белками Hsp70 также легко наблюдалась в нескольких клеточных линиях рака молочной железы, включая ZR-75 и Hs578T (C) и MCF-7 (не показано), после переходных GST-LOX-PP по сравнению с -GST выражение. Аналогичным образом было обнаружено, что эндогенные белки LOX-PP и Hsp70 коиммунопреципитируются в экстрактах из клеток ZR-75 (D), которые экспрессируют низкие уровни LOX-PP, и из клеток NIH 3T3 (E) и NF639 (см. B).

Идентификация Hsp70 / 72 и тубулина как LOX-PP-взаимодействующих белков.(A) Клетки HEK293T трансфицировали векторами, экспрессирующими либо GST, либо GST – LOX-PP. Белки осаждали гранулами глутатион-сефароза 4B и разделяли с помощью SDS-PAGE, а гели окрашивали кумасси бриллиантовым синим R-250. Указаны положения полос GST и GST – LOX-PP. Полосы примерно 52 кДа и 70 кДа вырезали, подвергали расщеплению в геле, а затем анализировали с помощью ЖХ-МС-МС и идентифицировали как α / β-тубулин (α / β-туб.) И Hsp70 / 72 соответственно. (). Звездочки представляют полосы, присутствующие на обеих дорожках, предположительно неспецифические ассоциированные белки.Положения маркеров молекулярной массы приведены в левой полосе. (B) Лизаты клеток HEK293T, экспрессирующих либо GST, либо GST-LOX-PP, помещенные на чашку диаметром 35 мм, очищали, как описано для панели A, с использованием анализа GST с понижением и подвергали вестерн-блоттингу с указанными антителами. Для оценки количества экспрессированных белков 4% каждого лизата отделяли и подвергали иммуноблоттингу (вход). (C) Клетки рака молочной железы ZR-75 (верхние панели) и Hs578T (нижние панели) трансфицировали плазмидами экспрессии для GST или GST-LOX-PP, и полученные лизаты подвергали GST-понижению и вестерн-блоттингу, как описано для панели B.(D) Экстракты Triton X-100 клеток ZR-75 иммунопреципитировали (IP) кроличьими анти-IgG или антителами Novus LOX-PP, как указано. Осажденные белки анализировали вестерн-блоттингом с антителами против Hsp70 и LOX-PP. Поскольку полоса осажденного LOX-PP перемещалась близко к полосе легкой цепи кроличьего IgG, HRP, конъюгированный с протеином A, использовали в качестве вторичного «антитела» для обнаружения иммунопреципитированного LOX-PP. (E) Экстракты Triton X-100 фибробластов NIH 3T3 иммунопреципитировали кроличьими IgG или LOX-PP антителами (верхние панели) или мышиными IgG или Hsp70 антителами (нижние панели) и подвергали вестерн-блоттингу с указанными антителами, как описано для панели D. .

Таблица 1.

Сводка белков, идентифицированных масс-спектрометрией a

Hsp70-взаимодействующий белок c-Raf ассоциирует с LOX-PP. (A) Клетки HEK293T трансфицировали плазмидами экспрессии для GST или GST-LOX-PP (G-LOX-PP) и экспрессировали белки, очищенные на гранулах глутатион-сефарозы 4B. Связанные белки анализировали вестерн-блоттингом на присутствие Hsp70 и белков, которые, как известно, взаимодействуют с Hsp70, включая c-Raf, Apaf-1, Akt, B-Raf, EGFR, Erk1 / 2 и MEK1 / 2, а также на GST как элемент управления (раскрывающийся).Для оценки количества экспрессированных белков иммуноблотировали 4% каждого лизата (вход). (B и C) Экстракты Triton X-100 клеток NF639 (B) и фибробластов NIH 3T3 (C) иммунопреципитировали антителами, указанными вверху. Осажденные белки анализировали вестерн-блоттингом с антителами против Hsp70, c-Raf и LOX-PP. Поскольку полоса осажденных LOX-PP и Pro-LOX мигрировала близко к полосе легкой и тяжелой цепей кроличьего IgG, соответственно, HRP, конъюгированная с протеином A, использовалась в качестве вторичного «антитела» для обнаружения иммунопреципитированного LOX-PP и предшественника Pro-LOX. .(D) Клетки NF639 трансфицировали плазмидой экспрессии для пустого вектора (EV) или белков LOX-PP, LOX или Pro-LOX, меченных V5. Экстракты Triton X-100 подвергали иммунопреципитации антителами V5, а осажденные белки детектировали с помощью антител против метки c-Raf или V5. (E) rLOX-PP-myc-His (0,5 мкМ) инкубировали с GST (0,5 мкМ) или GST-c-Raf (Gc-Raf; 0,5 мкМ) в течение 3 часов, а затем с гранулами глутатион-сефарозы 4B в течение 90 минут. . Связанные со смолой белки разделяли с помощью SDS-PAGE и визуализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием антитела His tag (верхняя панель) или окрашивания кумасси бриллиантовым синим (нижняя панель).Для оценки количества присутствующего белка rLOX-PP-myc-His 5% смеси разделяли и подвергали иммуноблоттингу (вход). (Вставка) Показан окрашенный кумасси синим гель бактериального экспрессированного и очищенного GST-c-Raf с массой ~ 100 кДа (1 мкг). Звездочки обозначают предполагаемые продукты распада или неполного синтеза. Были использованы те же маркеры молекулярной массы, и их положение указано слева.

Затем мы спросили, может ли Hsp70 взаимодействовать с LOX-PP, используя очищенные препараты рекомбинантного крысиного rLOX-PP, меченного myc-His (A) и белка GST-Hsp70 (B).Белок GST-Hsp70 разрушил рекомбинантный LOX-PP, подтверждая прямую связь между этими двумя белками (C). Кроме того, LOX-PP соосаждался с GST-Hsp70 в клетках HEK293T (D). Интересно, что α-тубулин не был обнаружен в совместно очищенных белках, что указывает на то, что тубулин не является промежуточным звеном в белковом комплексе Hsp70-LOX-PP (D). Связь с α-тубулином согласуется с нашими предыдущими наблюдениями при дифференцировке клеток MC3T3-E1, где было обнаружено, что LOX-PP взаимодействует с сетью микротрубочек (19).Таким образом, LOX-PP связывается с Hsp70 и α / β / γ-тубулином. Кроме того, наши результаты позволяют предположить, что LOX-PP является клиентом Hsp70, но не Hsp90.

Взаимодействие между LOX-PP и Hsp70 является прямым и снижается АТФ-зависимым образом. (A) Клетки T-Rex293 трансфицировали вектором pcDNA4 / TO / LOX-PP / myc-His, экспрессирующим белок rLOX-PP-myc-His. Белок rLOX-PP-myc-His (LOX-PP-myc-His) очищали на никелевой аффинной колонке, образец (1 мкг) подвергали SDS-PAGE и гель окрашивали кумасси синим.(B) E. coli. -экспрессируемые GST и GST-меченные белки Hsp70 (G-Hsp70) очищали на гранулах глутатион-сефарозы 4B, и 1 мкг каждого белка разделяли гель-электрофорезом. Левая панель, гель, окрашенный синим кумасси; правая панель, вестерн-блоттинг (WB) с антителом к ​​GST. (C) rLOX-PP-myc-His (0,5 мкМ), показанный на панели A, инкубировали с GST (0,5 мкМ) или GST-Hsp70 (G-Hsp70; 0,5 мкМ) в течение 3 часов после инкубации с глутатион-сефарозой. 4B бусины на 90 мин. Осажденные белки и образец ввода анализировали иммуноблоттингом с антителами против His tag и GST.Слева указаны маркеры молекулярной массы. (D) Клетки HEK293T трансфецировали плазмидами экспрессии для GST или GST-Hsp70 (G-Hsp70) с LOX-PP-V5, и анализы GST с понижением выполняли, как описано для B, и подвергали вестерн-блоттингу с указанными антителами. (E) Клетки HEK293T трансфицировали GST, N-концевым GST-меченным LOX-PP (G-LOX-PP) или C-концевым GST-меченным LOX-PP (LOX-PP-G). Через 24 часа клеточные лизаты подвергали GST-обработке шариками глутатион-сефарозы 4B в присутствии (+) или в отсутствие (-) 1 мМ АТФ.Соосажденные белки исследовали с помощью вестерн-блоттинга с антителами против Hsp70, α-тубулина (α-tub.) И GST. Для оценки количества экспрессированных белков 4% каждого лизата отделяли и подвергали иммуноблоттингу (вход).

Взаимодействие LOX-PP с Hsp70 ингибируется при связывании АТФ.

Предыдущие исследования семейства Hsp70 показали, что связывание АТФ вызывает конформационные изменения и что взаимодействие белков Hsp70 с их партнерами по связыванию часто чувствительно к состоянию связывания нуклеотидов (20).Таким образом, мы затем проверили, зависит ли взаимодействие LOX-PP с Hsp70 от АТФ. В присутствии 1 мМ АТФ взаимодействие LOX-PP и Hsp70, но не α-тубулина, было почти полностью устранено (E). Эти данные свидетельствуют о конформационной зависимости взаимодействия с Hsp70 и регуляции посредством цикла связывания / гидролиза АТФ.

Картирование доменов Hsp70, опосредующих взаимодействие с LOX-PP.

Hsp70 имеет домены связывания как АТФазы, так и пептида (22, 32). Для картирования областей, взаимодействующих с LOX-PP, были сконструированы делеционные мутанты этих доменов в Hsp70, как описано Milarski и Morimoto (43) (A).В Hsp70 ΔBglII отсутствуют аминокислоты 121–427 во фрагменте BglII-BglII, который кодирует домен АТФазы, а в Hsp70 ΔSmaI отсутствуют аминокислоты 439–617 во фрагменте SmaI-SmaI, который кодирует домен связывания пептида. Эти конструкции Hsp70 коэкспрессировались с GST-LOX-PP или GST в качестве контроля в клетках HEK293T. После извлечения белков GST связанные белки идентифицировали вестерн-блоттингом с использованием антитела Flag (B, верхняя панель). GST – LOX-PP снижал Hsp70 ΔBglII, а также Hsp70 WT, но не Hsp70 ΔSmaI (полосы B, GST с понижением).Как и ожидалось, GST не смог разрушить какие-либо белки. Кроме того, анализ аликвот каждого из исходных лизатов подтвердил по существу одинаковую загрузку экспрессированных белков и эффективное снижение всех белков GST (B, нижняя панель). Таким образом, пептид-связывающий домен Hsp70 опосредует взаимодействие с LOX-PP.

Картирование сайта связывания LOX-PP на Hsp70. (A) Показано схематическое изображение мутантов Hsp70, используемых в этом исследовании. Полноразмерные (WT) или делеционные мутантные кДНК Hsp70 (ΔBglII и ΔSmaI) вставляли в вектор pFLAG-CMV-2.Положения доменов связывания АТФазы и пептида (bdg.) И кислотного мотива EEVD являются такими, как указано. (B) GST или GST-LOX-PP коэкспрессировался с полноразмерным FLAG-Hsp70 (WT) или мутантным FLAG-Hsp70 ΔBglII или FLAG-Hsp70 ΔSmaI в клетках HEK293T. Белки GST осаждали гранулами глутатион-сефарозы 4B, а связанные белки подвергали вестерн-блоттингу с антителами против FLAG и GST. Для оценки количества экспрессированных белков 4% каждого лизата отделяли и подвергали иммуноблоттингу (панели ввода).

Картирование доменов LOX-PP, обеспечивающих взаимодействие с Hsp70.

Структурное предсказание и анализ кругового дихроизма пропептидной области LOX-PP показал, что он собирается как внутренне неупорядоченный белок (IDP) (44, 70), который встречается в белках, которые принимают структуры, когда-то собранные в комплекс. Чтобы начать картирование области (ов), опосредующей связывание с Hsp70, были сконструированы серии прогрессивных мутантов с C-концевой (ΔC1 до ΔC5) и N-концевой (ΔN1 до ΔN5) делецией LOX-PP (A).Экспрессия делеционных белков была подтверждена после трансфекции в клетки HEK293T (B, нижняя панель). GST или GST-меченые белки удаляли с помощью гранул глутатион-сефарозы 4B, и связывание Hsp70 и α-тубулина оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Связывание Hsp70 снижалось, когда область между аминокислотами 78 и 100 была удалена с С-конца или когда аа 26-62 были удалены с N-конца (В, верхняя панель). Для дальнейшего картирования LOX-PP-взаимодействующего домена были приготовлены и проанализированы дополнительные делеционные конструкции в области от аа 25 до аа 101 (В).В то время как ΔM1 и ΔM2 сохраняли низкий уровень взаимодействия с Hsp70 и α-тубулином, вариант ΔM3 LOX-PP с делецией аа 26-100 не мог взаимодействовать ни с одним из белков (D и данные не показаны). Наконец, чтобы проверить способность этой области к взаимодействию, была приготовлена ​​конструкция M1, которая экспрессирует пептид, состоящий из этой области (от 26 до 100 аминокислот). Пептид M1 взаимодействовал как с Hsp70, так и с α-тубулином (E). Таким образом, домен LOX-PP, который взаимодействует с Hsp70 и α-тубулином, картируется внутри с аа 26 на аа 100.

Связывание LOX-PP с Hsp70 сопоставляется с 26–100 аминокислотами LOX-PP. (A) Показано схематическое изображение исходных мутантов LOX-PP, используемых в этом исследовании. SP, сигнальный пептид. (B) Клетки HEK293T трансфицировали плазмидами, экспрессирующими делеционные мутанты, указанные на панели A. Конструкции GST удаляли с помощью гранул глутатион-сефароза 4B, и связанные белки детектировали вестерн-блоттингом с антителами против Hsp70, α-тубулина (α- ванна.) и GST (верхние панели). Для оценки количества экспрессированных белков 4% каждого лизата отделяли и подвергали иммуноблоттингу (вход).(C) Показано схематическое изображение дополнительных делеционных конструкций LOX-PP. (D и E) Клетки HEK293T трансфицировали EV или плазмидами, экспрессирующими WT, ΔM1, ΔM2 и ΔM3 (D) или EV, WT, ΔM3 и M1 (E). Конструкции GST удаляли и связанные белки детектировали вестерн-блоттингом, как описано для панели B. (Вход) Десять процентов каждого из лизатов отделяли и подвергали иммуноблоттингу.

LOX-PP снижает опосредованный Hsp70 фолдинг белка и выживаемость клеток.

Чтобы выяснить функциональные эффекты LOX-PP на Hsp70, мы сначала измерили, изменяет ли LOX-PP экспрессию Hsp70.Никаких изменений ни в его уровне, ни в скорости распада не наблюдалось (не показано). Затем влияние LOX-PP на способность Hsp70 стимулировать правильную укладку белка оценивали с помощью анализа рефолдинга люциферазного белка. Была использована люцифераза, локализованная в цитоплазме (Luc-Cyto), в которой сигнал пероксисомной локализации на С-конце был разрушен, как описано в разделе «Материалы и методы». Трансфицированные клетки Luc-Cyto инактивировали инкубацией клеток HEK293T-EV, HEK293T – LOX-PP WT или HEK293T – LOX-PP ΔM3 при 45 ° C в течение 30 мин.После последующего периода восстановления в течение 1, 2 или 3 часов при 37 ° C активность люциферазы анализировали с помощью люминометра. Сниженная способность стимулировать рефолдинг люциферазы наблюдалась с течением времени у клеток HEK293T-LOX-PP WT по сравнению с клетками HEK293T-EV (A). Напротив, делеция LOX-PP-ΔM3, которая не может взаимодействовать с Hsp70, не оказывала влияния на рефолдинг люциферазы по сравнению с тем, что было обнаружено для клеток с ДНК EV. Таким образом, LOX-PP снижает способность Hsp70 способствовать сворачиванию белка, а для этого требуется область ассоциации.

LOX-PP снижает шаперон Hsp70 и функции выживания клеток. (A) Клетки HEK293T трансфицировали плазмидой экспрессии люциферазы светлячка, локализованной в цитоплазме, и либо GST-LOX-PP WT (WT), GST-LOX-PP-ΔM3 (ΔM3), либо GST (EV) с использованием Lipofectamine 2000. Через 24 часа. ч, добавляли 20 мкг / мл циклогексимида для предотвращения дальнейшего синтеза белка. Культуры инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C, а затем переводили на 45 ° C на 30 минут для денатурирования белка люциферазы. Затем клетки инкубировали при 37 ° C для восстановления сворачивания люциферазы.В указанные моменты времени клетки лизировали, измеряли концентрации белка и определяли люциферазную активность равных количеств белка с использованием системы анализа люциферазы (верхние панели). (Нижние панели) Вестерн-блоттинг был проведен для GST и α-тубулина, который подтвердил эффективный синтез белков GST и равную нагрузку, соответственно. (B) Клетки ZR-75 и NF639 (левая и правая панели соответственно) трансфицировали векторами, экспрессирующими GST-LOX-PP WT (WT), GST-LOX-PP-ΔM3 (ΔM3) или GST (EV).Через 24 часа культуры инкубировали в течение 10 минут при 45 ° C, а затем возвращали при 37 ° C на 24 часа. (Верхние панели) Клетки ZR-75 и NF639 окрашивали 0,4% трипановым синим и подсчитывали положительные (мертвые) клетки. Показаны результаты 3 индивидуальных экспериментов (средние значения ± стандартное отклонение). (Нижние панели) WCE были подвергнуты иммуноблоттингу на GST и α-тубулин, как описано для панели A.

В качестве другой меры воздействия LOX-PP на функцию Hsp70, способность Hsp70 защищать клетки от индуцированного тепловым шоком оценивали гибель клеток.В частности, мы проверили, влияет ли на выживаемость клеток рака молочной железы ZR-75 экспрессия либо LOX-PP WT, либо мутанта ΔM3 после теплового шока при 45 ° C в течение 10 минут и восстановления в течение 24 часов. Гибель клеток измеряли по поглощению трипанового синего (B). В то время как только ~ 5% клеток ZR-75 погибло с ДНК EV, наблюдалось примерно 5-кратное увеличение гибели клеток при экспрессии белка LOX-PP WT. Напротив, мутант LOX-PP-ΔM3 не оказывал заметного влияния на выживаемость клеток ZR-75, подвергшихся тепловому шоку (B, левые панели).Вестерн-блоттинг был проведен для GST и α-тубулина, который подтвердил эффективный синтез белков GST и равную нагрузку, соответственно. Аналогичным образом было обнаружено, что клетки рака молочной железы NF639 существенно более чувствительны к гибели клеток, вызванной тепловым шоком после эктопической экспрессии белка LOX-PP WT, но не мутанта LOX-PP-ΔM3 (B, правые панели). Таким образом, LOX-PP увеличивал чувствительность клеток рака молочной железы ZR-75 и NF639 к тепловому шоку. Вместе эти исследования показывают, что LOX-PP обладает способностью снижать шаперонную функцию Hsp70.Неспособность мутанта ΔM3 предотвращать рефолдинг или вызывать гибель клеток предполагает, что эти эффекты опосредуются взаимодействием Hsp70 с пропептидом.

LOX-PP связывается с c-Raf, белком, взаимодействующим с Hsp70.

Hsp70, как было обнаружено, взаимодействует с разнообразным набором белков, опосредуя свои различные функции. Чтобы начать рассмотрение функциональной роли взаимодействия LOX-PP с Hsp70, мы проверили ассоциацию LOX-PP с белками, взаимодействующими с Hsp70, которые являются медиаторами сигнальных путей, на которые, как известно, влияет LOX-PP в клетках рака молочной железы (A) .Примечательно, что GST-LOX-PP снижал c-Raf и Apaf-1 в дополнение к Hsp70, тогда как не было обнаружено ассоциации с Hsp70-взаимодействующими белками Akt, B-Raf, рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), Erk1 / 2 и MEK1 / 2 (A) и цитохром c , JNK1, Src или поли (АДФ-рибоза) полимераза (PARP) (данные не показаны). Интересно, что мы отметили, что эктопическая экспрессия LOX-PP снижает активацию Erk1 / 2 путем Ras / Raf в клетках рака молочной железы NF639, которые управляются каскадом передачи сигналов Her-2 / neu в Ras, и в Ras-трансформированном NIH 3T3. фибробласты (30, 44).Таким образом, мы стремились проверить способность эндогенного c-Raf и LOX-PP связываться в этих линиях. Растворимые лизаты Triton X-100 из клеток NF639 и NIH 3T3 иммунопреципитировали антителом против LOX-PP или Hsp70 или его изогенно подобранного антитела, кроличьего IgG или мышиного IgG соответственно (C). Антитело против LOX-PP снижало Hsp70 и c-Raf; Интересно, что в обеих линиях снижение c-Raf оказывается несколько более эффективным, чем Hsp70 (C). Антитело LOX-PP осаждает предшественник Pro – LOX, который содержит пептид на его аминоконцевом домене, и процессированный пептид LOX-PP.Антитело против Hsp70 снижало как LOX-PP, так и Pro-LOX, а также c-Raf, что согласуется с взаимодействием через пропептидный домен. Примечательно, что LOX-PP, продуцируемый внеклеточно посредством протеолитического расщепления Pro-LOX, который обнаруживался только на низких уровнях в клеточных экстрактах, судя по входным образцам, довольно легко обнаруживался в ассоциации с Hsp70, предположительно во внутриклеточном компартменте. Для дальнейшей оценки доменов взаимодействия клетки NF639 трансфицировали векторами, экспрессирующими либо LOX-PP, Pro-LOX, который содержит LOX-PP и домены ферментов LOX, либо только фермент LOX.Взаимодействие с c-Raf наблюдали с LOX-PP и Pro-LOX, но не с ферментом (D). Таким образом, LOX-PP довольно эффективно связывается с c-Raf, а также с Hsp70 в этих клетках рака молочной железы, что согласуется с нашими предыдущими наблюдениями о том, что эктопическая экспрессия LOX-PP в клетках NF639 и NIH 3T3 ингибирует активность Erk1 / 2 киназы (30, 44), которые находятся ниже c-Raf.

Затем мы проверили прямое взаимодействие LOX-PP и c-Raf с использованием белка, меченного GST (E, вставка). Рекомбинантный LOX-PP-myc-His инкубировали с GST или GST-c-Raf в течение 3 часов, а затем GST-меченные и ассоциированные белки очищали с использованием гранул глутатион-сефарозы 4B.Связанный со смолой белок визуализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием антитела His tag или окрашивания кумасси синим (E, верхняя или нижняя панель, соответственно). Полоса в положении полноразмерного LOX-PP наблюдалась с GST-Raf, но не только с GST, что указывает на то, что LOX-PP может напрямую связываться с c-Raf, хотя это взаимодействие было слабее, чем ожидалось, на основании коиммунопреципитации, наблюдаемой в клетке. экстракты, как описано выше (C). Это может быть связано с отсутствием модификации (модификаций) экспрессируемого бактериями c-Raf, необходимой для обеспечения его прямого взаимодействия с пропептидом, или возможности того, что Hsp70 может стабилизировать взаимодействие c-Raf и LOX-PP.

Взаимодействие с LOX-PP снижает передачу сигналов Raf через Erk.

Открытие того, что LOX-PP ассоциируется с c-Raf, привело нас к дальнейшей оценке эффектов пропептида на передачу сигналов ниже этой киназы. Чтобы проверить, снижает ли LOX-PP активацию MEK1 / 2 c-Raf, плазмиды, экспрессирующие GFP-меченный c-Raf или контрольный GFP, трансфицировали в клетки HEK293T в отсутствие или в присутствии GST-LOX-PP или GST (A). Полученные клеточные лизаты из клеток, экспрессирующих GST-LOX-PP и c-Raf, проявляли пониженную активность MEK1 / 2 по сравнению с лизатами из одного только GST, что согласуется с ингибированием активности c-Raf с помощью LOX-PP.Затем была оценена способность LOX-PP ингибировать активность Erk1 / 2 в двух дополнительных линиях рака молочной железы, Hs578T и ZR-75. Эктопическая экспрессия LOX-PP снижала активность Erk1 / 2 в обеих линиях, не влияя на общие уровни Erk1 / 2 (B). Затем мы проверили, необходим ли участок, содержащий от 26 до 100 LOX-PP, для его взаимодействия с c-Raf, а также с Hsp70. Лизаты получали из клеток HEK293T, эктопически экспрессирующих GST, GST-LOX-PP WT, GST-LOX-PP ΔM3 (Δ26-100) или GST-LOX-PP M1 (26-100), и подвергали воздействию гранул глутатион-сефарозы 4B. .Связывание c-Raf с полноразмерным LOX-PP и с LOX-PP M1, содержащим только аминокислотные остатки от 26 до 100, было легко обнаружено, тогда как связывание не наблюдалось с белком GST-LOX-PP ΔM3, в котором отсутствует эта область, или с контрольным белком GST (C). Затем мутанты сравнивали с WT LOX-PP по их влиянию на активацию MEK1 / 2 c-Raf, как описано выше и показано в A. Белок GST-LOX-PP ΔM3 не смог снизить активность c-Raf, поскольку судя по измеренным уровням фосфо-MEK, тогда как белки WT и M1 были эффективными.Данные трех независимых экспериментов были количественно определены с использованием программного обеспечения ImageJ, и средний уровень (± SD) относительно уровня EV, установленного на 100%, для белка LOX-PP ΔM3 составил 108% ± 13%, тогда как значения 74% ± 7% и 63% ± 10% были получены для белков LOX-PP WT и M1, соответственно (данные не показаны).

Область, содержащая от 26 до 100 аминокислот LOX-PP, которая взаимодействует с Hsp70, необходима для ингибирования киназы c-Raf и трансформированного фенотипа. (A) Клетки HEK293T трансфицировали плазмидами, экспрессирующими GFP-меченный c-Raf (Raf) или GFP (G) контроль в присутствии GST – LOX-PP (PP) или GST (G) контроля, как указано.Клеточные лизаты (20 мкг) анализировали на влияние на активность нижестоящего медиатора c-Raf MEK1 / 2 с помощью вестерн-блоттинга с использованием анти-фосфо-MEK1 / 2 (Ser-217/221), а также на общую MEK1 / 2. что касается GFP, GST и β-актина в качестве регуляторов нагрузки. (B) Клетки Hs578T и ZR-75 трансфицировали плазмидами, экспрессирующими ДНК LOX-PP или EV с меткой V5. Образцы WCE (20 мкг белка) подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против фосфо-Erk1 / 2 (Thr-202 / Tyr-204), общего Erk1 / 2, тега V5 и β-актина.(C) Клетки HEK293T трансфицировали плазмидами экспрессии для указанных белков LOX-PP, меченных GST (WT, ΔM3 или M1), или только GST (EV). Белки очищали с использованием гранул глутатион-сефарозы 4B и подвергали вестерн-блоттингу на c-Raf и GST. Для оценки количества экспрессированных белков иммуноблотировали 4% каждого лизата (исходный). (D) Бактериально экспрессируемые белки GST, GST-LOX-PP WT или GST-LOX-PP ΔM3 были очищены (нижняя панель) и оценено их влияние на способность клеток NF639 образовывать колонии после 2 недель роста в мягком агаре.Планшеты фотографировали при увеличении × 4. (E) GST (EV), GST-LOX-PP WT или GST-LOX-PP ΔM3 эктопически экспрессировался в клетках рака молочной железы NF639. Через 48 часов клетки подвергали анализу миграции в течение 16 часов в трех повторностях, и клетки, которые мигрировали в нижнюю часть фильтра, окрашивали кристаллическим фиолетовым и количественно определяли спектрометрическим определением на A 570 . Приведены средние значения ± стандартное отклонение. Значения P были рассчитаны с использованием теста Стьюдента t .*, P <0,01.

Чтобы проверить, необходимо ли взаимодействие с c-Raf и Hsp70 для наблюдаемого ингибирования трансформированного фенотипа с помощью LOX-PP (44, 75), влияние LOX-PP WT по сравнению с делецией ΔM3 на рост и миграцию, не зависящие от закрепления клеток NF639. Очищенные экспрессированные бактериями белки GST, полноразмерные белки GST-LOX-PP WT или GST-LOX-PP ΔM3 (D, нижняя панель) тестировали на их влияние на образование колоний мягкого агара клетками NF639. В то время как белок LOX-PP WT надежно подавлял рост клеток NF639 в мягком агаре, белок GST-LOX-PP ΔM3 не имел никакого эффекта по сравнению с одним белком GST (D).Анализы миграции проводили через 48 часов после эктопической экспрессии GST, полноразмерного GST-LOX-PP WT или GST-LOX-PP ΔM3 в клетках рака молочной железы NF639 (E). В соответствии с нашими предыдущими исследованиями, снижение на ~ 40% наблюдалось при экспрессии LOX-PP полной длины. Напротив, не наблюдалось снижения миграции клеток NF639 с мутантом LOX-PP ΔM3 (E). Таким образом, домен, содержащий аа 26-100, который опосредует взаимодействие LOX-PP с c-Raf, необходим для ингибирования активности c-Raf и снижения трансформированного фенотипа пропептидом.

Нокдаун или нокаут гена LOX индуцирует более трансформированный фенотип.

Для определения эффектов нокдауна эндогенного белка LOX-PP на активацию Erk использовали две РНК siLOX (олигонуклеотид А или олигонуклеотид В) и скремблированную контрольную миРНК. Клетки NF639 и NIH 3T3 трансфицировали миРНК в концентрации 20 нМ (конечная концентрация) и культуры инкубировали в течение 48 часов. Среды и изолированные экстракты целых клеток (WCE) подвергали иммуноблот-анализу на LOX-белки с использованием антитела, которое распознает пропептидный домен (A).Данные подтвердили способность обеих РНК siLOX эффективно подавлять секретируемый и внутриклеточный LOX-PP и его предшественник Pro – LOX, как и ожидалось. Примечательно, что снижение уровней LOX-PP сопровождалось значительным увеличением активного фосфо-Erk как в клетках NF639, так и в клетках NIH 3T3, тогда как в общем Erk1 / 2 изменений не наблюдалось (A). Затем мы проверили влияние нокдауна LOX на способность клеток NF639 к миграции. Устойчивое увеличение способности клеток NF639 к миграции было отмечено при обработке двумя РНК siLOX по сравнению с уровнем для контрольной siRNA, при этом олигонуклеотид B был несколько более эффективным (B, левая панель).Затем эффекты миРНК были протестированы на инвазию клетками NF639. Способность клеток NF639 проникать через матригель была значительно увеличена после обработки двумя РНК siLOX по сравнению с уровнем для контрольной миРНК, с олигонуклеотидом B, вызывающим большее увеличение (B, правая панель).

Нокдаун экспрессии гена LOX усиливает передачу сигналов Erk, а также миграцию и инвазию клеток. (A) Клетки NF639 и NIH 3T3 трансфицировали 20 нМ (каждая) siLOX РНК олигонуклеотидом A или олигонуклеотидом B или зашифрованной контрольной siRNA в течение 48 часов.Образцы среды (20 мкл) и WCE (20 мкг) подвергали иммуноблот-анализу на LOX с использованием антитела, которое распознает пропептидный домен, pErk1 / 2, общий Erk1 / 2 и β-актин. (B) Клетки NF639 трансфицировали, как описано для панели A. (Левая панель) Через 48 часов клетки подвергали анализу миграции в течение 6 часов в трех повторностях, как описано для E. Приведены средние значения ± стандартное отклонение. Значения P были рассчитаны с использованием теста Стьюдента t . *, P <0,01. (Правая панель) Через 48 часов клетки подвергали анализу инвазии в течение 6 часов в трех повторностях, как описано в разделе «Материалы и методы».Приведены средние значения ± стандартное отклонение. Значения P были рассчитаны с использованием теста Стьюдента t . *, P <0,01. (C) WT или Lox — / — MEF подвергали анализу миграции в течение 16 часов в трех повторностях, и данные количественно оценивали, как описано для E. Приведены средние значения ± стандартное отклонение. Значения P были рассчитаны с использованием теста Стьюдента t . *, P <0,01.

MEF были получены от мышей с нулевым геном LOX , которые умирают перинатально (38), и от мышей WT C57BL / 6 и исследованы на их способность к миграции.MEF от мышей Lox — / — показали повышенную миграцию по сравнению с таковыми от мышей дикого типа (C). Ранее мы продемонстрировали, что LOX-PP ингибирует активность NF-κB в Ras-трансформированных клетках NIH 3T3 (30). Соответственно, в Lox — / — MEF наблюдалось 4,28 ± 0,94-кратное увеличение активности репортера, управляемого элементом NF-κB, по сравнению с уровнем для MEF от мышей дикого типа (не показано). . Таким образом, снижение экспрессии гена LOX сопровождается более трансформированным фенотипом, о чем судят по увеличению активности Erk и NF-κB и способности клеток мигрировать и вторгаться через матригель.

Нокдаун гена LOX приводит к большей митохондриальной локализации c-Raf.

Rapp и соавторы наблюдали, что активация его нижележащих мишеней Erk1 / 2 с помощью c-Raf сопровождается большей митохондриальной локализацией c-Raf (15). Это привело нас к тестированию эффектов нокдауна гена LOX на локализацию c-Raf в митохондриях. Клетки NF639 обрабатывали 20 нМ (конечная концентрация) siLOX РНК-олигонуклеотида B или скремблированной контрольной siRNA.После 48 ч инкубации митохондриальные белки выделяли и подвергали иммуноблоттингу на c-Raf (A, верхняя панель). Нокдаун LOX-PP был связан с повышенной локализацией c-Raf в митохондриях. Вестерн-блоттинг митохондриального белка СОХ-1 подтвердил равную нагрузку. Точно так же количество c-Raf, локализованное в митохондриальной фракции из MEF Lox — / — , было существенно выше, чем количество из MEF из мышей C57BL / 6 дикого типа (A, нижняя панель).Затем использовали митотрекер и иммунофлуоресцентный анализ, чтобы визуализировать, как локализация c-Raf в митохондриях изменялась в результате нокдауна LOX-PP в клетках NF639 (B). В клетках, обработанных контрольной siRNA, c-Raf проявлял как цитоплазматическую, так и митохондриальную локализацию. Существенное увеличение окрашивания c-Raf в митохондриях было обнаружено при обработке siLOX РНК-олигонуклеотидом B клеток NF639 (B). Кроме того, митохондрии выглядели более сгруппированными и перинуклеарными, чем нитевидными, напоминая изменения, наблюдаемые при индукции конститутивного активного белка c-Raf в клетках NIH 3T3 Раппом и соавторами (15).Аналогичные данные были получены с MEF WT и Lox — / — (данные не показаны). Таким образом, LOX-PP, по-видимому, снижает локализацию c-Raf в митохондриях и снижает передачу сигналов Erk.

Нокдаун экспрессии гена LOX усиливает нацеливание c-Raf в митохондрии. (A) Клетки NF639, обработанные контрольной siRNA или siLOX олигонуклеотидом B РНК в течение 48 часов (верхние панели). Фракции митохондрий (10 мкг) подвергали 10% SDS-PAGE и анализировали иммуноблоттингом на c-Raf и COX-1.Митохондриальную фракцию (10 мкг) WT или Lox — / — MEF подвергали иммуноблоттингу на c-Raf и COX-1, как описано выше (нижние панели). (B) Клетки NF639 трансфицировали, как описано для панели A. Через 48 часов клетки инкубировали с 250 нМ Mitotracker в течение 30 минут, фиксировали метанолом и обрабатывали для иммунофлуоресцентного анализа, как описано в разделе «Материалы и методы». Штанги: 5 мкм.

ОБСУЖДЕНИЕ

Здесь представлен новый механизм действия белка-ингибитора Ras LOX-PP, который происходит через его ассоциацию с Hsp70 и c-Raf, что приводит к снижению функции Hsp70 и c-Raf-опосредованной передаче сигналов и трансформированному фенотипу в груди. раковые клетки.Hsp70 был идентифицирован как партнер по связыванию LOX-PP с использованием масс-спектрометрии совместной очистки, и было показано, что это взаимодействие снижает функциональную способность Hsp70, способствуя рефолдингу и выживанию после смерти, вызванной тепловым шоком. Домены взаимодействия были картированы на пептид-связывающую область Hsp70 и на аминокислотные остатки от 26 до 100 аминокислот LOX-PP. Тестирование известных клиентов Hsp70 показало, что LOX-PP также связан с c-Raf. Эта идентификация c-Raf согласуется с предыдущими наблюдениями, показывающими, что LOX-PP снижает передачу сигналов ниже c-Raf в клетках рака груди, легких, поджелудочной железы и простаты, включая активацию Erk1 / 2 в растущих клетках или при стимуляции сывороткой или щелочью. фактор роста фибробластов (bFGF) (30, 44, 52, 73) и миграция и трансформированный фенотип (30, 44, 45, 73).Кроме того, теперь мы показываем, что нокдаун или нокаут LOX-PP имеет обратные эффекты, т.е. приводит к увеличению миграции и инвазии клеток, а также к активностям Erk1 / 2 и NF-κB. Нокдаун уровней LOX-PP также приводит к увеличению локализации c-Raf в митохондриях, что коррелирует с активацией Erk1 / 2. Эти данные согласуются с отчетом Rapp и соавторов (15), показывающим, что активный c-Raf локализуется в митохондриях и что эта локализация играет важную роль в активации Erk1 / 2.Таким образом, LOX-PP образует комплексы, содержащие Hsp70 и c-Raf, что снижает передачу сигналов, опосредованную этими двумя факторами, которые, как было показано, вносят вклад в прогрессирование молочной железы и других раковых клеток (2, 4, 49, 72). В целом, наши результаты предполагают потенциальное использование этого пептида для лечения рака, вызванного передачей сигналов через эти пути.

LOX-PP, по-видимому, непосредственно связывается с Hsp70 в клетках рака молочной железы, о чем свидетельствуют анализы связывания in vitro, и анализ коиммунопреципитации.Повышенный уровень Hsp70 был обнаружен при многих раковых заболеваниях, включая рак груди (6, 48), а уровень экспрессии Hsp70 коррелирует с метастазированием, устойчивостью к противоопухолевым препаратам и плохим прогнозом при многих раковых заболеваниях человека (см. Ссылку 8). Hsp70 предотвращает каспазозависимую и независимую гибель клеток, вызванную апоптотическими стимулами, такими как тепловой шок, фактор некроза опухоли, синдром отмены сыворотки и химиотерапевтические агенты. Кроме того, было показано, что Hsp70 подавляет регуляцию N-концевой протеинкиназы Jun (JNK), митоген-активируемой протеинкиназы p38 (MAPK) и каспазы и стабилизирует целостность лизосомной мембраны (14).Примечательно, что ассоциация с LOX-PP функционально снижает способность Hsp70 способствовать правильной укладке белка люциферазы и приводит к значительному увеличению гибели клеток при тепловом шоке клеток рака молочной железы. Эти данные позволяют предположить, что взаимодействие с LOX-PP нарушает функции Hsp70, необходимые для роста и выживания опухолевых клеток.

Белки семейства

Hsp70 являются высококонсервативными и имеют три области, опосредующие взаимодействие с различными белками, включая домен АТФазы в N-концевой области, пептид-связывающий домен в C-концевой области и кислотный мотив (EEVD) в C конечная остановка.Сообщалось, что пептид-связывающий домен Hsp70 связывается с PKCβII, p53, Rictor, фактором, индуцирующим апоптоз (AIF), JNK1, TRAF2, TRAF6, Ku70 и MstI (7, 11, 16, 29, 37, 40, 54 , 58, 59). Между тем, Hsp70 взаимодействует с Hip, Bag-1, Bax, hYVh2, PARP-1, CD40 и Ask1 через свой АТФазный домен (3, 17, 25, 26, 36, 53, 64) и с Hop (Hsp70 / Hsp90- организующий белок) и CHIP через мотив EEVD (1, 12). В этом исследовании мутационный анализ продемонстрировал, что пептид-связывающий домен Hsp70 необходим для взаимодействия с LOX-PP.Интересно, что LOX-PP не взаимодействует с обычным кокапероном Hsp70 Hsp90 ни в раке груди, ни в клетках HEK293T. Хотя несколько реже быть единственным клиентом Hsp70, другие примеры включают Rb, CD40 и TRAF6 (3, 7, 24, 28). Важно отметить, что LOX-PP взаимодействует с c-Raf, белком, связывающим Hsp70 (65), чтобы ингибировать передачу сигналов через Erk1 / 2, которая способствует миграционному фенотипу в клетках рака молочной железы. Следует отметить, что мы не наблюдали взаимодействия LOX-PP с MEK1 / 2, Erk1 / 2 или киназой B-Raf, или H-Ras (неопубликованные результаты).Эти результаты предполагают, что наши предыдущие данные, показывающие, что LOX-PP снижает Ras-опосредованную активацию Erk1 / 2 (30, 44, 45, 73), обусловлены способностью LOX-PP снижать активность своей вышестоящей киназы c-Raf. Поскольку ген LOX был первоначально идентифицирован как рецизионный ген Ras со способностью подавлять Ras-опосредованную трансформацию (10, 35), было обнаружено, что активный фермент LOX, в котором отсутствует пропептидная область, способствует инвазивному фенотипу при раке молочной железы. клетки (13, 55, 56).Эти парадоксальные результаты можно частично объяснить тем, что мы обнаружили, что LOX-PP, но не фермент LOX, может взаимодействовать с c-Raf и снижать его активность.

Предыдущие исследования предсказания структуры LOX-PP с использованием DISOPRED, GlobPlot и DisProt, а также анализ кругового дихроизма (CD) показали, что пропептид собирается как внутренне неупорядоченный белок (44, 70). Здесь домены LOX-PP, обеспечивающие связывание с Hsp70, были картированы с аминокислотных остатков от 26 до 100. Эта последовательность содержит богатую пролином область между аминокислотами 26 и 34 и богатую аргинином область между аминокислотами 62 и 72.В то время как пролины в пептидной последовательности разрушают упорядоченные вторичные структуры, богатые пролином последовательности важны для опосредования взаимодействий с несколькими доменами взаимодействия белок-белок, включая гомологию Src 3 (Sh4), гомологию 1 Ena / VASP (EVh2) и домены WW ( 74). В самом деле, в более позднем анализе совместной очистки LOX-PP с масс-спектрометрией клеток рака молочной железы человека ZR-75 адаптерный белок, содержащий домен Sh4, был идентифицирован как новый белок, взаимодействующий с LOX-PP (S. Sato, неопубликованные наблюдения), и ведется работа по проверке их связи.Известно, что аргинин является электрически положительно заряженной аминокислотой и предпочитает находиться вне белков. Соответственно, анализ графика гидропатии предсказывает, что эта область LOX-PP находится на поверхности. Наконец, укороченная на карбокси-конце конструкция LOX-PP, по-видимому, демонстрирует более сильное связывание с Hsp70 и тубулином, чем полноразмерный LOX-PP. Это открытие предполагает, что аа 116–162 в карбоксиконцевой области могут содержать домен, который подавляет взаимодействие с Hsp70 и тубулином.Для рассмотрения этой возможности необходимы дальнейшие исследования.

Предыдущая работа показала участие карбоксиконцевой области LOX-PP в продуктивной секреции Pro – LOX. В частности, Kagan и соавторы (31) установили, что N-конец пропептидной области Pro-LOX содержит сигнальную последовательность, необходимую для нормальной секреции. Sommer и Mecham и их соавторы обнаружили, что мутанты Pro-LOX, у которых отсутствуют аа 23–157, не секретируются (62, 67). Эти данные свидетельствуют о том, что карбоксиконцевая область пропептида играет критическую роль в секреции Pro-LOX в дополнение к сигнальному пептиду.Чтобы проверить эту возможность, мы проанализировали локализацию WT и M1 LOX-PP в клетках рака молочной железы с помощью иммунофлуоресцентного анализа. В то время как WT LOX-PP локализован в аппарате Гольджи в клетках Hs578T, судя по совместной локализации с маркером Гольджи, в соответствии с предыдущей работой с использованием остеобластов (19), мутант LOX-PP M1 локализовался по всему цитозолю и не смог ассоциироваться с белком Гольджи. аппарат (данные не показаны). Взятые вместе, эти находки предполагают, что супрессорный домен c-Raf LOX-PP картируется в области от аа 26 до 100 и что карбоксиконцевая область необходима для правильной локализации и правильного процессинга.В связи с этим известно, что гликозилирование происходит внутри аппарата Гольджи во время секреции (50), и сообщалось, что LOX-PP посттрансляционно модифицируется N-гликозилированием и O-гликозилированием (68, 70).

Здесь тубулины были идентифицированы как дополнительные связывающие белки LOX-PP при раке груди и клетках HEK293T. Примечательно, что тубулин не был промежуточным белком для ассоциации Hsp70 с LOX-PP. Это открытие предполагает, что комплексы тубулин-LOX-PP и Hsp70-LOX-PP независимы друг от друга.Интересно, что совместная локализация и ассоциация LOX-PP с тубулином в микротрубочках дифференцированных остеобластов наблюдались ранее с использованием конфокальной микроскопии и анализа наложения связывания (19). Сеть микротрубочек играет важную роль в контроле развития клеточного цикла, движения клеток, транспорта пузырьков и передачи сигналов (34, 69, 71). Будет важно определить эффекты ассоциации LOX-PP на эти разнообразные функции.

Было обнаружено, что эктопическая экспрессия LOX-PP усиливает гибель клеток рака груди при тепловом шоке.Недавно мы сообщили, что LOX-PP сенсибилизирует клетки рака поджелудочной железы и груди к индуцированному доксорубицином апоптозу, который зависит от каспазы (46). Интересно, что мы наблюдали, что Apaf-1 также соосаждался с LOX-PP. Было показано, что Hsp70 блокирует опосредованную Apaf-1 / цитохромом c активацию каспаз (61), предполагая, что LOX-PP может способствовать апоптозу, преодолевая ингибирование активности протеазы Apaf-1, опосредованное его взаимодействием с белком Hsp70. Таким образом, было показано, что LOX-PP взаимодействует с Hsp70 и c-Raf и тем самым снижает функцию шаперона и передачу сигналов через Erk1 / 2, что способствует выживанию и более трансформированному фенотипу в клетках рака молочной железы.Будет важно проверить, можно ли распространить эту ассоциацию на другие виды рака, управляемые передачей сигналов Ras.

Ассоциация переработчиков пластмасс

ЭТИКЕТКИ И ЧЕРНИЛА

Следует тщательно продумать выбор этикетки, чтобы найти решение, наиболее совместимое с процессом переработки, которое также обеспечивает необходимые рабочие характеристики. Как минимум, этикетки должны быть спроектированы таким образом, чтобы оборудование для сортировки в ближнем инфракрасном диапазоне могло идентифицировать полимер для бутылок с прикрепленной этикеткой, а на этикетках должен использоваться клей, выделяющийся из бутылки.Удаление клея является важным компонентом затрат на переработку, поэтому упаковки с наименьшим количеством подходящего клея являются наиболее совместимыми.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЙ

Этикетки из полипропилена или полиэтилена

Этикетки из полипропилена

— это тот же полимер, что и конечный продукт, и полиэтилен в очень малых количествах, ожидаемых от остатков на этикетке, оказывает минимальное негативное воздействие. Таким образом, эти этикетки, которые остаются с полипропиленом на протяжении всего процесса переработки, независимо от того, отслаиваются они или нет, повышают выход продукции и оказывают минимальное негативное влияние на качество для переработчика.

Этикетки для литья под давлением из совместимого полимера

Этикетки, помещенные в форму, не удаляются в процессе переработки, так как они приклеиваются к стенке упаковки. Они будут проходить процесс переработки с полипропиленом и смешиваться с переработанным полипропиленом. Отсутствие клея благоприятно влияет на переработку, поскольку не влияет на цвет или другие механические свойства. Полимер и краска для этикеток должны быть совместимы с полипропиленом, чтобы не ухудшать его свойства.

Этикетки на рукавах для бутылок, предназначенные для сортировки

Положительным моментом рукавных этикеток является отсутствие клея, который необходимо удалить в процессе переработки.Однако этикетки на рукавах для полных бутылок покрывают большую часть поверхности бутылки полимером, который отличается от корпуса бутылки. Из-за этого рукавная этикетка, разработанная без учета сортировки, может привести к тому, что автоматический сортировщик направит бутылку из полипропилена в поток другого материала, где она будет потеряна в процессе. Кроме того, некоторые несовместимые материалы рукавов, которые невозможно отделить от полипропилена в резервуаре с плавающей запятой, могут загрязнять произведенный вторичный полипропилен. Этикетки на рукавах, которые предназначены для автоматической сортировки и погружения в воду, являются предпочтительными, за исключением ПВХ, где даже небольшие остаточные количества, которые проходят через процесс поплавкового погружения, разрушают переработанный полипропилен в процессе экструзии.Этикетки из полиолефиновых рукавов, предназначенные для автоматической сортировки, также являются предпочтительными, поскольку небольшие уровни полностью несовместимого материала, ожидаемые от остатков этикеток, имеют очень минимальное негативное воздействие.

ДЕТРИМЕНТАЛЬНАЯ

Этикетки бумажные

Процесс регенерации полипропилена включает воду и перемешивание. Бумага, которая отделяется от контейнера в этих условиях, становится целлюлозой, которая не оседает целиком, а остается взвешенной в жидкости, увеличивая нагрузку на системы фильтрации и очистки воды.Бумага, остающаяся налипшей на полипропилен, перемещается вместе с полипропиленом в экструдер, где материал обугливается и вызывает дефекты цвета. Даже после фильтрации расплава запах гари и обесцвечивание остаются у переработанного полипропилена, что отрицательно сказывается на его возможном повторном использовании. Этикетки из нецеллюлозной бумаги, используемые с невыделивающимся клеем, усугубляют проблему, поскольку этикетка целиком входит в экструдер. Этикетки без целлюлозы, достаточно тяжелые, чтобы утонуть, и достаточно прочные, чтобы выдерживать процесс стирки, которые используются с высвобождающимся клеем, могут облегчить эту проблему.

РЕНДЕР ДЛЯ НЕПЕРЕРАБОТКИ

Не указано

ТРЕБУЮТСЯ РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ

Чернила для этикеток

Некоторые краски для этикеток теряют цвет в процессе утилизации, обесцвечивая полипропилен при контакте с ними и, возможно, уменьшая его ценность для вторичной переработки. Поскольку большая часть переработанного полипропилена окрашена, влияние растекания чернил может быть незначительным; однако, поскольку конечное использование заранее неизвестно, следует выбирать краски для этикеток, которые не растекаются при переработке.Если краска повторно откладывается на натуральных хлопьях полипропилена, это обесцвечивание может снизить их ценность для вторичной переработки. Чернила должны оставаться на этикетке и не стекать в промывочную воду, чтобы избежать потенциального обесцвечивания.

Следует проконсультироваться с протоколом тестирования APR, чтобы определить, просачиваются ли чернила.

Компаниям, которые разработали новые инновационные ламинированные подложки для этикеток, также рекомендуется добиваться признания APR Design® для своих материалов. Компании, которые рассматривают возможность использования чернил для этикеток и не уверены в их совместимости с переработкой, должны попросить своих поставщиков предоставить результаты испытаний APR.

СКРИНИНГ-ТЕСТ

ОКОНЧАТЕЛЬНЫЙ ТЕСТ

Этикетки из металлической фольги, металлизированные и металлизированные с печатным рисунком

Сортировочное оборудование в процессе переработки предназначено для обнаружения и удаления металла из полипропилена. Даже очень тонкие металлизированные этикетки могут быть идентифицированы сортировочным оборудованием как металлические, и вся бутылка будет выбракована как отходы, что приведет к потере урожая. Если не обнаружить, металлы могут попасть в шлифовальное оборудование, что приведет к его повреждению и преждевременному износу.

Этикетки из металлической фольги, прошедшие сортировку и оставшиеся вместе с полипропиленом, являются вредными, а упаковка считается пригодной для вторичной переработки с вредными характеристиками. Очень тонкие металлические слои, нанесенные вакуумным напылением, могут проходить сортировку и считаться предпочтительными. Если бутылка теряется в процессе сортировки металла, она не подлежит вторичной переработке, поскольку не попадает в поток и выбрасывается как отходы.

СКРИНИНГ-ТЕСТ

ЭТАЛОННЫЙ ТЕСТ

Этикетки на рукавах для полных бутылок

Этикетки с полным рукавом для бутылок должны быть протестированы как на покрытие поверхности бутылки, так и на совместимость с полипропиленом.

Площадь поверхности:
Некоторые этикетки на рукавах покрывают большую часть поверхности бутылки полимером, который отличается от корпуса бутылки. Этикетка может затем вызвать ложное считывание на автоматическом сортировщике и направить бутылку из полипропилена в другой поток материала, где она будет потеряна в процессе.

СКРИНИНГ-ТЕСТ

ЭТАЛОННЫЙ ТЕСТ

Совместимость:
Некоторые материалы для этикеток на рукавах имеют плотность <1,0 и, таким образом, плавают в поплавковом резервуаре / сливном баке и остаются с полипропиленом.Этот материал не может быть удален в процессе переработки и может загрязнять переработанный полипропилен, если он несовместим с полипропиленом.

ОКОНЧАТЕЛЬНЫЙ ТЕСТ

Прямая печать без кодирования даты

Чернила, используемые для прямой печати, могут растекаться или иным образом обесцвечивать полипропилен во время процесса переработки или вносить несовместимые загрязнения, снижающие ценность переработанного полипропилена. Определенные чернила должны быть протестированы, чтобы определить их действие.

Технологии прямой печати для бутылок из полипропилена, получивших признание APR Design®, коммерчески доступны.Компаниям, которые разработали новые инновационные ламинированные подложки для этикеток, также рекомендуется добиваться признания APR Design® для своих материалов.

Компании, которые рассматривают технологии прямой печати и не уверены в их совместимости с переработкой, должны попросить своих поставщиков предоставить результаты испытаний APR.

ОКОНЧАТЕЛЬНЫЙ ТЕСТ


СОЧЕТАНИЕ ЭТИКЕТКИ / КЛЕЯ

Классификация и возможность вторичной переработки подложек для этикеток зависит от типа клея, который с ними используется.Как правило, субстрат этикетки, который тонет в воде и используется с клеем, выделяющимся в системе промывки регенераторов, является предпочтительным, поскольку субстрат будет удален в резервуаре с поплавком. Подложка для этикеток, совместимая с полипропиленом, также является предпочтительной, независимо от того, какой клей. Таким образом, возможность вторичной переработки определенных материалов этикеток зависит от типа используемого клея.

УСЛОВНО ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНО

Этикетки из металлической фольги, отвечающие требованиям сортировки, предпочтительны при использовании с клеем, выделяющимся при стирке, и вредны для вторичной переработки, когда используются с клеем, который не выделяется при стирке.

Даже очень тонкие металлизированные этикетки могут быть идентифицированы сортировочным оборудованием как металлические, и вся бутылка будет направлена ​​в поток металла, что приведет к потере выхода. Сортировочное оборудование в процессе регенерации предназначено для обнаружения и удаления металла из полипропилена. Если эти этикетки маленькие, не обнаруживаются или пропускаются, при использовании с клеем, который не выделяется при стирке, прикрепленный полипропилен опускается в воду там, где он теряется в резервуаре с поплавком, или проходит в экструдер, где они могут закрывать фильтры плавления.При использовании с клеем, который выделяется при стирке, эти этикетки быстро опускаются в резервуар с плавающей мойкой, откуда они удаляются.

Этикетки из полистирола предпочтительны при использовании с клеем, который выделяется при стирке, и вредны для вторичной переработки при использовании с клеем, который не выделяется при стирке.

PS, когда используется с клеем, который не выделяется при стирке, остается с полипропиленом и поступает в экструдер, где смешивается с полипропиленом. Полистирол не совместим с полипропиленом и может вызвать растекание или снизить ударную вязкость для пользователей переработанного полипропилена.Этикеточный материал PS, когда он используется с клеем, который выделяется при стирке, отделяется от полипропилена перед сливным резервуаром, где он тонет и удаляется.

Этикетки из PLA предпочтительнее, если они используются с клеем, который выделяется при стирке и делает упаковку непригодной для вторичной переработки в соответствии с APR при использовании с клеем, который не выделяется при стирке.

Этикеточный материал

PLA, когда он используется с клеем, который не выделяется при стирке, попадает в экструдер с полипропиленом, где они несовместимы.При использовании с адгезивом, который выделяется при стирке, PLA отделяется от полипропилена перед резервуаром для поплавка, где он тонет и удаляется. Даже несмотря на то, что процесс поплавкового опускания несовершенен, небольшие количества PLA, поступающие в процесс экструзии, не являются катастрофическими

УСЛОВНО ДЕТРИМЕНТАЛЬНО

Этикетки из ПВХ вредны для вторичной переработки, если они используются с клеем, который выделяется при стирке и делает упаковку непригодной для вторичной переработки в соответствии с APR при использовании с клеем, который не выделяется при стирке.

ПВХ, когда используется с клеем, который не выделяется при стирке, попадает в экструдер с полипропиленом, где они несовместимы. ПВХ разлагается при температурах экструзии полипропилена и делает непригодным для использования большое количество переработанного полипропилена. При использовании с клеем, который выделяется при стирке, эти этикетки тонут в резервуаре с плавающей мойкой, где они удаляются. Но поскольку резервуар с плавающей опорой несовершенен, и даже очень небольшое количество ПВХ, попадающее в экструдер, вызывает серьезные проблемы с качеством и выходом материала, этот материал является вредным.

РЕНДЕР ДЛЯ НЕПЕРЕРАБОТКИ

См. Раздел выше и раздел «Требуются результаты тестирования»

ТРЕБУЮТСЯ РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ

Комбинации этикеток / клея, для которых не известно отсоединение клея и поведение подложки в процессе плавания / погружения.

Испытания должны показать, что клеи будут либо чисто смываться с полипропилена в процессе переработки, либо быть совместимыми с полипропиленом. Поскольку типичные условия процесса переработки полипропилена недостаточно агрессивны для удаления всего адгезионного материала, в переработанном полипропилене следует ожидать наличия определенного количества остаточного клея.Такой остаток клея, который не удаляется с полипропилена во время стадии стирки, является источником загрязнения и изменения цвета при переработке полипропилена. По этим причинам рекомендуется минимальное использование клея.

APR разрабатывает скрининговый тест на адгезию PP / HDPE, чтобы классифицировать клей как удобный для стирки, непригодный для стирки и совместимый с PP, или как непригодный для стирки и несовместимый с PP.

Не допускающий стирку, несовместимый клей вреден для вторичной переработки.

Клеи для этикеток, получившие признание APR Design®, имеются в продаже.См. Список признанных инноваций APR. Компаниям, которые разработали новые инновационные ламинированные подложки для этикеток, также рекомендуется добиваться признания APR Design® для своих материалов. Компании, которые рассматривают возможность использования клеев для этикеток и не уверены в их совместимости с переработкой, должны попросить своих поставщиков предоставить результаты испытаний APR.

ОКОНЧАТЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ

Совместное сжижение ЛПЭНП и ПП в сверхкритической воде в нефть: свойства и синергизм

Основные пластиковые отходы всегда представляют собой смеси, которые трудно разделить и обработать на практике.Из-за некоторых возможных перекрестных реакций поведение пластиков при разложении не может быть математически представлено простым добавлением каждого полимера в соответствии с их пропорциями. В этой работе исследуется сверхкритическая вода (SCH 2 O) для разжижения смесей полиэтилена и полипропилена в масло с особым интересом к качеству масла и положительному эффекту. Линейный полиэтилен низкой плотности (ЛПЭНП) и полипропилен (ПП) были выбраны в качестве исходных материалов из-за их высокой доли в пластиковых отходах.Результаты показывают, что высокая степень превращения около 99,75% была достигнута с выходом масла 90,7 мас.% Без дополнительных катализаторов или водорода. Совместное сжижение scH 2 O смеси ЛПЭНП / ПП отличалось от такового для одиночного полимера, наряду с улучшением выхода масла. Циклическое образование углеводородов (, т.е. , циклическое) стимулировалось, в то время как производство парафинов затруднялось совместным ожижением scH 2 O с использованием смеси ЛПЭНП / ПП.ТГА показывает, что совместное сжижение смесей ЛПЭНП / ПП scH 2 O привело к образованию большего количества дизельного топлива и смазочных масел и меньшего количества бензина и масел (реактивное топливо + легкое дизельное топливо), что несколько снизило качество масла. В целом технология сверхкритических жидкостей была мощным и многообещающим средством превращения смешанных пластиковых отходов в нефть с высокой степенью конверсии без катализаторов или водорода.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Список наркотических анальгетиков + способы применения, типы и побочные эффекты

Наркотические анальгетики — это класс лекарств, которые используются для облегчения умеренной и сильной острой или хронической боли.Их также можно назвать опиатами, опиоидными анальгетиками или наркотиками. Анальгетик — это еще одно название лекарства, снимающего боль.

Наркотические анальгетики — одни из наиболее широко используемых анальгетиков для снятия боли; тем не менее, ими злоупотребляли, назначали и злоупотребляли ими, что привело к тому, что только в США более двух миллионов человек страдают расстройством, вызванным злоупотреблением психоактивными веществами, включая рецептурные наркотические анальгетики.

Наркотические анальгетики действуют путем связывания с опиоидными рецепторами, частью опиоидной системы, которая контролирует боль, приятное и вызывающее привыкание поведение.Опиоидные рецепторы более многочисленны в головном и спинном мозге, но они также расположены в других частях тела, таких как желудок и легкие. Основным опиоидным рецептором, с которым связываются наркотические анальгетики, является рецептор мю.

Для чего используются наркотические анальгетики?

В прошлом наркотические анальгетики использовались при всех типах боли, что может объяснить, почему сегодня так много людей пристрастились к ним.

Наркотические анальгетики наиболее целесообразно использовать для облегчения кратковременной сильной боли, например, возникающей сразу после операции или вызванной заболеванием.

Наркотические анальгетики также подходят для снятия боли, вызванной раком, или для паллиативной помощи или ухода в конце жизни. Однако их следует рассматривать для лечения других типов хронической боли только в строгих условиях и под тщательным наблюдением.

В чем разница между наркотическими анальгетиками?

Наркотические анальгетики различаются по своей структуре, эффективности и способу всасывания, распределения, метаболизма и вывода из организма.

Некоторые из них, например морфин и кодеин, были первоначально получены из растений.Другие, такие как героин, гидрокодон, гидроморфон, оксикодон и оксиморфон, были получены путем модификации морфина и называются полусинтетическими. Существует три основных класса опиоидов: те, которые структурно похожи на морфин (фенантрены), те, которые напоминают фентанил (фенилпиперидины), и те, которые похожи на метадон (фенилгептиламины).

Различные наркотические анальгетики имеют разную эффективность в зависимости от того, насколько сильно они связываются с опиоидными рецепторами (например, фентанил в 80–100 раз сильнее морфина).Это означает, что дозировки одного наркотика могут существенно отличаться от другого. Хотя существуют диаграммы преобразования (они показывают, какая доза наркотика сравнивается с эквивалентной анальгетической дозой морфина), они в лучшем случае являются лишь ориентиром, потому что другие переменные, такие как генетика человека, также играют роль в том, как человек реагирует на наркотик.

Если наркотический анальгетик считается подходящим, сначала следует попробовать кодеин или трамадол, если боль слабая или умеренная. Если боль не реагирует на эти анальгетики или при более сильной боли, следует рассмотреть возможность применения гидроморфона, морфина или оксикодона.Фентанил и метадон следует использовать только при сильной боли, не поддающейся лечению другими наркотическими анальгетиками.

Распространенные наркотические анальгетики, доступные в США, включают:

Имя Маршрут Начало действия Продолжительность эффекта
альфентанил Внутривенное (IV) 90 секунд 45-60 минут
кодеин Пероральный 15-60 минут 3-4 часа
фентанил IV Сразу 0.5–1 час
Внутримышечно (IM) 7-8 минут 1-2 часа
Буккальный (через десны)
Сублингвальный (SL)
5-15 минут 4-6 часов
Пластырь трансдермальный (через кожу) 72-96 часов
гидрокодон Пероральный 10-20 минут 4-8 часов
гидроморфон Пероральный 15-30 минут 3-4 часа
IV 5 минут 3-4 часа
метадон Подкожно (SC) (под кожу) 15 минут 3-4 часа
морфин Пероральный 30-60 минут 3-6 часов (немедленное высвобождение)
8-24 часа (расширенное высвобождение)
IV / SC 5-10 минут 4 часа
оксикодон Пероральный 10-15 минут 3-6 часов
оксиморфон Пероральный 30-60 минут (немедленное высвобождение)
1-2 часа (расширенное высвобождение)
4-6 часов (немедленное высвобождение)
12 часов (расширенное высвобождение)
IM / IV / SC 5-10 минут 3-6 часов
трамадол Пероральный 30-60 минут (немедленное высвобождение)
1-2 часа (расширенное высвобождение)
4-6 часов (немедленное высвобождение)
24 часа (расширенное высвобождение)

Безопасны ли наркотические анальгетики?

Существуют серьезные риски, связанные с наркотическими анальгетиками, включая угнетение дыхания (необычно медленное и поверхностное дыхание), расстройство, связанное с употреблением опиоидов, и потенциально смертельную передозировку.

Расстройство, связанное с употреблением опиоидов, определяется как повторяющееся возникновение по крайней мере двух из 11 конкретных проблем, связанных с опиоидами, включая употребление опиоидов в увеличенных количествах или в течение более длительного времени, чем предполагалось; продолжение использования, несмотря на вмешательство в повседневную деятельность; или все еще использую в опасных ситуациях. Тяжелое расстройство, связанное с употреблением опиоидов, определяется как совокупность из 6 или более проблем, и оно может затрагивать людей любого образования и социально-экономического происхождения.

Наркотические анальгетики потенциально вызывают привыкание, и риск эмоциональной и физической зависимости от них увеличивается, чем больше вы принимаете и чем дольше вы их принимаете.При назначении врачом и использовании в течение коротких периодов времени, например, менее пяти дней для снятия боли после операции, риск привыкания к наркотическим анальгетикам относительно невелик.

Число смертельных передозировок опиоидов продолжает расти, и это привело к тому, что правительственные чиновники приняли новое законодательство, чтобы еще больше ограничить назначение опиоидов. Более 42000 человек умерли в 2016 году из-за передозировки опиоидов; 40% этих смертей были вызваны приемом рецептурных наркотических анальгетиков.


Наркотические анальгетики считаются приемлемыми при приеме в точном соответствии с предписаниями врача, в течение коротких периодов времени для облегчения сильной боли и под строгим контролем. Тем не менее, несмотря на правильное использование, они могут быть связаны с некоторыми серьезными побочными эффектами.

Каковы побочные эффекты наркотических анальгетиков?

Наркотические анальгетики обладают множеством побочных эффектов, хотя люди с онкологическими или неизлечимыми заболеваниями, принимающие наркотики в течение длительных периодов времени, могут стать толерантными к некоторым из этих побочных эффектов.

Сонливость, сонливость или головокружение характерны для большинства наркотических анальгетиков. Это может повлиять на вождение или способность человека управлять механизмами и выполнять другие опасные работы. Алкоголь может усилить эти эффекты.

Другие часто сообщаемые побочные эффекты включают:

Абстинентный синдром может возникнуть, когда люди, принимавшие наркотические анальгетики, резко прекращают их прием. Симптомы похожи на грипп и могут включать ломоту в теле, озноб, депрессию, диарею, мурашки по коже, головные боли, высокое кровяное давление, бессонницу, раздражительность, насморк и пот.Симптомы отмены обычно длятся около недели.

Список литературы

  1. Опиоидная зависимость. Факты и цифры, 2016 г. Американское общество наркологической медицины. https://www.asam.org/docs/default-source/advocacy/opioid-adiction-disease-facts-figures.pdf
  2. Drewes AM, Jensen RD, Nielsen LM и др. Различия между опиоидами: фармакологические, экспериментальные, клинические и экономические перспективы. Британский журнал клинической фармакологии . 2013; 75 (1): 60-78.DOI: 10.1111 / j.1365-2125.2012.04317.x.
  3. Канадские рекомендации по безопасному и эффективному использованию опиоидов при хронической нераковой боли Майкл Дж. ДеГрут. Национальный центр боли. Университет Макмастера. http://nationalpaincentre.mcmaster.ca/opioid_2010/cgop_b02_r08.html
  4. Фентанил Эффентора 100 мкг Буккальные таблетки. ЭМС. TevaPharmaBC https://www.medicines.org.uk/emc/product/5400/smpc#PHARMACOKINETIC_PROPS
  5. Рациональное использование опиоидов. Stanford Education 2008. http: //ether.stanford.edu / ca1 / text08 / i.pdf.
  6. http://www.pharmacytimes.com/publications/issue/2011/june2011/an-overview-of-opioids

Всегда консультируйтесь со своим врачом, чтобы информация, отображаемая на этой странице, соответствовала вашим личным обстоятельствам.

Приостановление въезда иммигрантов, представляющих риск для рынка труда США во время экономического восстановления после вспышки нового коронавируса 2019 года

Прокламация 10014 от 22 апреля 2020 г. Прокламация

Новый коронавирус 2019 года (COVID-19) значительно подорвал средства к существованию американцев.В Прокламации 9994 от 13 марта 2020 г. (Объявление чрезвычайной ситуации в стране в связи со вспышкой новой коронавирусной болезни (COVID-19)) я объявил, что вспышка COVID-19 в США с 1 марта 2020 г. представляет собой чрезвычайную ситуацию в стране. затем американский народ объединился в рамках политики смягчения последствий, включая социальное дистанцирование, чтобы сгладить кривую инфекций и уменьшить распространение SARS-CoV-2, вируса, вызывающего COVID-19. Этот необходимый сдвиг в поведении серьезно сказался на экономике Соединенных Штатов, и количество обращений по безработице в стране достигло исторического уровня.За дни между объявлением чрезвычайного положения в стране и 11 апреля 2020 года более 22 миллионов американцев подали документы на пособие по безработице.

Управляя иммиграционной системой нашей страны, мы должны помнить о влиянии иностранных рабочих на рынок труда Соединенных Штатов, особенно в условиях высокой внутренней безработицы и низкого спроса на рабочую силу. Мы также должны сберечь критически важные ресурсы Государственного департамента, чтобы сотрудники консульства могли продолжать оказывать услуги гражданам США за рубежом.Даже несмотря на то, что их ряды сократились из-за перебоев с персоналом, вызванных пандемией, сотрудники консульства продолжают оказывать помощь гражданам Соединенных Штатов, в том числе посредством продолжающейся эвакуации многих американцев, оказавшихся за границей.

Я определил, что без вмешательства Соединенные Штаты столкнутся с потенциально длительным экономическим восстановлением с постоянно высоким уровнем безработицы, если предложение рабочей силы опережает спрос на рабочую силу. Избыточное предложение рабочей силы влияет на всех рабочих и потенциальных работников, но особенно вредно для работников, находящихся на границе между занятостью и безработицей, которые обычно «прибывают последними» во время экономического роста и «первыми ушли» во время экономического спада.В последние годы эти рабочие были непропорционально представлены группами, находящимися в исторически неблагоприятном положении, включая афроамериканцев и другие меньшинства, лиц без высшего образования и инвалидов. Это работники, которые, находясь на границе между занятостью и безработицей, могут несоразмерно несоразмерно нести бремя избыточного предложения рабочей силы.

Кроме того, законным постоянным жителям после их приема выдается разрешение на трудоустройство на «открытом рынке», что дает им немедленное право претендовать на практически любую работу в любом секторе экономики.Невозможно защитить и без того находящихся в неблагоприятном положении и безработных американцев от угрозы конкуренции за дефицитные рабочие места со стороны новых законных постоянных жителей, направляя этих новых жителей в определенные секторы экономики с продемонстрированной потребностью, не удовлетворяемой существующим предложением рабочей силы. Существующие меры защиты при оформлении иммиграционной визы недостаточны для восстановления после вспышки COVID-19. Подавляющее большинство категорий иммиграционных виз не требует, чтобы работодатели отчитывались о перемещении рабочих из Соединенных Штатов.Начать печатную страницу 23442 Хотя некоторые визы для трудоустройства содержат требование о трудовой сертификации, поскольку выдача визы происходит в основном после завершения сертификации, процесс трудовой сертификации не может адекватно отражать состояние рынка труда сегодня. Более того, введение дополнительных постоянных жителей, когда наши ресурсы здравоохранения ограничены, создает нагрузку на конечные пределы нашей системы здравоохранения в то время, когда нам необходимо уделять приоритетное внимание американцам и существующим иммигрантам.В свете вышеизложенного я определил, что въезд в течение следующих 60 дней некоторых иностранцев в качестве иммигрантов нанесет ущерб интересам Соединенных Штатов.

СЕЙЧАС, ПОЭТОМУ, я, ДОНАЛЬД ТРАМП, Президент Соединенных Штатов, властью, предоставленной мне Конституцией и законами Соединенных Штатов Америки, включая разделы 212 (f) и 215 (a) Закона США Закон об иммиграции и гражданстве, 8 USC 1182 (f) и 1185 (a), а также в разделе 301 раздела 3 Кодекса Соединенных Штатов Америки настоящим установлено, что въезд в Соединенные Штаты лиц, описанных в разделе 1 настоящей декларации, будет, за исключением случаев, предусмотренных в разделе 2 настоящего постановления. провозглашение, наносит ущерб интересам Соединенных Штатов, и что их въезд должен подлежать определенным ограничениям, ограничениям и исключениям.Поэтому настоящим заявляю следующее:

Раздел 1 . Приостановление и ограничение въезда. Въезд в Соединенные Штаты иностранцев в качестве иммигрантов настоящим приостанавливается и ограничивается в соответствии с разделом 2 этой декларации.

п. 2 . Объем приостановления и ограничения въезда. (a) Приостановление и ограничение въезда в соответствии с разделом 1 настоящей декларации применяется только к иностранцам, которые:

(i) находятся за пределами Соединенных Штатов на дату вступления в силу этой декларации;

(ii) не имеют иммиграционной визы, действующей на дату вступления в силу данного заявления; и

(iii) не имеют официального проездного документа, кроме визы (например, транспортного письма, соответствующего посадочного талона или документа о предварительном условно-досрочном освобождении), действительного на дату вступления в силу этого заявления или выданного в любую дату после этого разрешает ему или ей поехать в Соединенные Штаты и искать въезда или допуска.

(b) Приостановление и ограничение въезда в соответствии с разделом 1 настоящей декларации не распространяется на:

(i) любой законный постоянный житель США;

(ii) любой иностранец, желающий въехать в Соединенные Штаты по иммиграционной визе в качестве врача, медсестры или другого медицинского работника; для проведения медицинских исследований или других исследований, направленных на борьбу с распространением COVID-19; или выполнять работу, необходимую для борьбы, восстановления или иного смягчения последствий вспышки COVID-19, как это определено Государственным секретарем, министром внутренней безопасности или их соответствующими назначенными лицами; и любые супруги и не состоящие в браке дети в возрасте до 21 года любого такого иностранца, которые сопровождают или следуют за этим иностранцем;

(iii) любой иностранец, подающий заявку на визу для въезда в Соединенные Штаты в соответствии с Программой для иммигрантов-инвесторов EB-5;

(iv) любой иностранец, являющийся супругом гражданина США;

(v) любой иностранец, не достигший 21 года и являющийся ребенком гражданина США, или потенциальный усыновленный, желающий въехать в Соединенные Штаты в соответствии с классификациями виз IR-4 или IH-4;

(vi) любой иностранец, въезд которого будет способствовать достижению важных целей правоохранительных органов Соединенных Штатов, как это определено государственным секретарем, министром внутренней безопасности или их соответствующими назначенными лицами на основании рекомендации генерального прокурора или назначенного им представителя;

(vii) любой военнослужащий вооруженных сил Соединенных Штатов и любые супруги и дети военнослужащего вооруженных сил Соединенных Штатов; начало печатной страницы 23443

(viii) любой иностранец, желающий въехать в Соединенные Штаты в соответствии со специальной иммиграционной визой по классификации SI или SQ, при соблюдении таких условий, которые может установить Государственный секретарь, а также любой супруг (а) и дети любого такого лица; или

(ix) любой иностранец, въезд которого будет отвечать национальным интересам, как это определено государственным секретарем, министром внутренней безопасности или их соответствующими назначенными лицами.

п. 3 . Реализация и обеспечение соблюдения. (a) Консульское должностное лицо определяет по своему усмотрению, подтвердил ли иммигрант свое право на исключение в разделе 2 (b) этого заявления. Государственный секретарь должен выполнять это провозглашение применительно к визам в соответствии с процедурами, которые Государственный секретарь по согласованию с министром внутренней безопасности может установить по усмотрению Государственного секретаря.Министр внутренней безопасности должен выполнять это постановление, поскольку оно применяется к въезду иностранцев в соответствии с такими процедурами, которые министр внутренней безопасности по согласованию с государственным секретарем может установить по усмотрению министра внутренней безопасности.

(b) Иностранец, который обходит применение этого заявления посредством мошенничества, умышленного искажения существенных фактов или незаконного въезда, подлежит высылке Министерством внутренней безопасности в приоритетном порядке.

(c) Ничто в этом прокламации не должно толковаться как ограничение возможности лица искать убежища, статуса беженца, приостановления высылки или защиты в соответствии с Конвенцией против пыток и других жестоких, бесчеловечных или унижающих достоинство видов обращения и наказания в соответствии с законы США.

п. 4 . Прекращение действия. Срок действия этого заявления истекает через 60 дней с даты его вступления в силу и может быть продлен по мере необходимости.В случае необходимости, но не позднее, чем через 50 дней с даты вступления в силу этого заявления, министр внутренней безопасности должен, после консультации с государственным секретарем и министром труда, рекомендовать мне продолжить или изменить это заявление.

п. 5 . Дата вступления в силу. Это прокламация вступает в силу в 23:59. 23 апреля 2020 года по восточному поясному времени.

п. 6 . Дополнительные меры. В течение 30 дней с даты вступления в силу этого заявления министр труда и министр внутренней безопасности после консультации с государственным секретарем должны рассмотреть неиммиграционные программы и рекомендовать мне другие меры, необходимые для стимулирования экономики Соединенных Штатов и обеспечить расстановку приоритетов, найм и трудоустройство работников США.

п. 7 . Делимость. Политика Соединенных Штатов заключается в том, чтобы в максимальной степени обеспечить соблюдение этого провозглашения для продвижения интересов Соединенных Штатов.Соответственно:

(a) если какое-либо положение этого заявления или применение какого-либо положения к любому лицу или обстоятельству будет признано недействительным, оставшаяся часть этого заявления и применение его положений к любым другим лицам или обстоятельствам не будут затронуты. тем самым; и

(b) если какое-либо положение этого воззвания или применение любого положения к любому лицу или обстоятельству будет признано недействительным из-за отсутствия определенных процедурных требований, соответствующие должностные лица исполнительной власти должны выполнить эти процедурные требования, чтобы соответствовать действующим законодательством и любыми применимыми судебными постановлениями.

п. 8 . Общие положения. (a) Ничто в этом заявлении не должно толковаться как ухудшающее или иным образом влияющее на:

(i) полномочия, предоставленные законом исполнительному отделу или агентству, или их главе; или,

(ii) функции директора Управления по вопросам управления и бюджета, связанные с бюджетными, административными или законодательными предложениями. Начать печатную страницу 23444

(b) Это постановление должно выполняться в соответствии с действующим законодательством и при наличии ассигнований.

(c) Настоящее заявление не предназначено и не создает никаких прав или преимуществ, материальных или процессуальных, подлежащих принудительному исполнению по закону или по справедливости любой стороной против Соединенных Штатов, их департаментов, агентств или организаций, их должностных лиц, сотрудники, агенты или любое другое лицо.

В УДОСТОВЕРЕНИЕ ЧЕГО Я приложил руку к этому двадцать второго апреля, в год Господа нашего две тысячи двадцать и год независимости Соединенных Штатов Америки двести сорок четвертый.

Подается 4-24-20; 11:15] .

Ответить

Ваш адрес email не будет опубликован.