Гамк медиатор: Гамма-аминомасляная кислота — все самое интересное на ПостНауке

Содержание

Компоненты гамкергической системы и ее функция в эндокринных железах | Мишунина

В первые годы после открытия в мозге позво­ночных гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), которая позже была признана основным тормоз­ным медиатором ЦНС, считали, что она локализо­вана исключительно в клетках нервной системы. Повышение чувствительности методов определе­ния ГАМК позволило позже установить присутст­вие аминокислоты, ферментов ее обмена, систем транспорта, а также рецепторов и в клетках иных тканей и органов. Механизм действия ГАМК на периферии опосредован как мембранными рецеп­торами (в случае передачи нервного импульса или при трофическом действии), так и без их участия (при регуляции внутриклеточных процессов) [34, 35]. Кроме медиаторной функции, ГАМК в неней­рональных тканях может играть трофическую и па­ракринную роль в процессах секреции и транспор­та биологически активных соединений, подвижно­сти сперматозоидов и их способности к оплодотво­рению, сокращения матки и маточных труб, меха­низмах клеточной пролиферации. (по вели­чине молекулярной массы). Изоферменты разли­чаются по нуклеотидной последовательности, кле­точной и субклеточной локализации, иммунореак­тивности, факторам, контролирующим их актив­ность, и нейрохимическим функциям. При экстре­мальных условиях определенное значение могут приобретать альтернативные пути синтеза амино­кислоты, например образование ее из путресцина.

В дальнейшем метаболизме ГАМК принимает участие ГАМК-аминотрансфераза (ГАМК-Т). Фермент состоит из 2 идентичных субъединиц и локализуется в основном в постсинаптической зо­не и несинаптосомальных митохондриях. Следую­щий фермент обмена ГАМК — дегидрогеназа по­луальдегида янтарной кислоты (ДПЯК), которая катализирует реакцию окисления образовавшегося вследствие переаминирования полуальдегида ян­тарной кислоты. Анализ очищенной ДПЯК пока­зал наличие в составе фермента только 1 субъеди­ницы. На синаптических мембранах нейронов, а также мембранах глиальных клеток идентифици­ровано до 4 систем транспорта ГАМК и ряда ее аналогов. ГАМК-транспортеры (ГАМК-Тр) Na

+ и СГ -зависимы и играют важную роль в реализации ГАМКергической нейротрансмиссии, регулируя высвобождение медиатора в синаптическую щель и обратный захват его нейронами и глиальными клетками.

В ЦНС присутствует несколько типов ГАМК- рецепторов (ГАМК-Р). Медиатор действует в ос­новном через постсинаптический ГАМКЛ-Р, кото­рый является составной частью олигомерного ре­цепторного комплекса ГАМКа—бензодиазепин— СГ-канал (ГАКМ

а — БД —СГ -РК). Активность его модулируется рядом соединений, в том числе бензодиазепинами, барбитуратами, конвульсанта- ми, нейростероидами. Клонирование генов, кото­рые отвечают за синтез 5 классов субъединиц (а, р, у, ст, р), составляющих этот рецептор, выявило бо­лее чем 17 генов млекопитающих, кодирующих функциональное взаимодействие подклассов субъ­единиц ГАМКа-Р. Комбинация этих субъединиц обусловливает различные функциональные и фар­макологические свойства ГАМКа-Р. что, собствен­но, во многом и определяет многогранную роль ГАМК в регуляции разнообразных функций мозга. Установлено, что у-субъединица этого рецептора связана с тубулярными структурами синапса через так называемые ГАМК
А
-Р-ассоциированные белки.

ГАМКВ-Р в большинстве своем пресинаптиче- ские, они ассоциируются с Са2+— или К+-каналами через GTP-связывающие белки и модулируют вы­свобождение иных медиаторов. Известно, что ГАМКВ-Р является димером. Внеклеточный домен ГАМКВ|-Р играет роль в связывании лиганда, а аналогичная структура ГАМКВ2-Р способствует стабилизации рецептора на поверхности мембраны и отвечает за его активацию, повышая аффинность к агонистам. Трансмембранный домен ГАМКВ2-Р имеет место связывания G-белков, а ГАМКВ,-Р экспрессируется в виде ряда изоформ, которые различаются по молекулярной массе.

Не так давно описан еще один тип ГАМК-Р — С, функция которого близка к функции ГАМКД-Р.субъедини- цы ГАМКС-Р с меньшей интенсивностью, чем в сетчатке, происходит во всех регионах мозга, а экс­прессия р2-субъединины — только в сетчатке.

Присутствие всех или нескольких компонентов ГАМК-системы показано во многих ненейрональ­ных тканях. Установлено как определенное подо­бие, так и отличие в строении функциональных, иммунологических и иных характеристик метабо­лических и рецеторных составляющих ГАМК-сис­темы, которые были выделены из мозга и перифе­рических органов, в частности из эндокринных же­лез.

Поджелудочная железа

Присутствие достаточно высокой, имеющей ви­довые отличия, концетрации ГАМК в поджелудоч­ной железе установлено уже более, чем 2 десятиле­тия тому назад [34]. Последующие иммунологиче­ские исследования по изучению взаимосвязи меж­ду ГДК поджелудочной железы и развитием инсу­линзависимого диабета вызвали повышенный ин­терес к физиологической роли ГАМК в железе. В настоящее время считают, что ГДК является одной из важнейших мишеней для антигена в развитии аутоиммунных процессов в поджелудочной железе, возможно, в связи с идентичностью аминокислот­ных последовательностей ГДК и вируса Коксаки [76], который эпидемиологически связывают с раз­витием инсулинзависимого диабета.

В железе присутствует как ненейрональная, так и нейрональная ГАМК. Последняя в парасимпати­ческом ганглии железы находится исключительно в глиальных клетках; на мембранах нейронов, одна­ко, присутствуют ГАМК

Д-Р. Остается неизвестным источник аминокислоты в глиальных клетках, так как они не содержат ГДК [72]. ГАМК локализуется на периферии островков вместе с нервными окон­чаниями, которые простираются в покров первых [71, 76]. Нервные элементы в островках вместе с ГАМК содержат нейропептид У, что показано и для мозга [71]. В р-клетках островков Лангерганса аминокислота ассоциируется с везикулярным ком- партментом, который отделен от гранул, содержа­щих инсулин [52, 71, 76].

В р-клетках присутствуют обе формы ГДК [34], которые по своим иммунологическим и биохими­ческим характеристикам подобны таковым мозга [47]. В большинстве р-клеток ГДК определяется в уникальных тубулоцистернальных комплексах, от­крытых в сторону комплекса Гольджи [76]. Суще­ствует определенная видовая специфика присутст­вия разных форм фермента: в поджелудочной же­лезе человека, овцы и крысы превалирующей фор­мой является ГДК

65 [69, 76], тогда как у мышей в основном экспрессируется ГДКб7 [73]. локализовано на мембра­нах малых везикул р-клеток и только 5% фермента находится в глюкагон- и соматостатинсекретирую- щих клетках островков овцы [69]. Экспрессия ГДК65 в поджелудочной железе нормальных мышей и мышей с диабетом снижается
с
возрастом, у мо­лодых она также имеет половые различия; экспрес­сия ГДК67 при этом не зависит от возраста [65].

ГАМК-Т-иммунореактивный материал локали­зуется в р-, но не в а- или 5-клетках островков под­желудочной железы [76]; о ферментах дальнейшего метаболизма ГАМК в железе данных нет.

В опытах на культуре клеток поджелудочной же­лезы млекопитающих и опухолях железы человека установлено присутствие на мембранах р-клеток системы транспорта ГАМК низкой аффинности, чувствительной к АТФ. Высвобождение ГАМК из малых везикул увеличивалось при стимуляции эк- зоцитоза [7], повышении уровня глюкозы [36, 74], но не было связано с секрецией инсулина [74]. В то же время известны данные о снижении высвобож­дения ГАМК из р-клеток при повышении концент­рации или метаболизма глюкозы, что связывают с АТФ-зависимой активацией активности клетки в этих условиях [78].

Существование ГАМКа-Р в поджелудочной же­лезе показано в условиях использования монокло­нальных антител [70]. По одним данным ГАМКа-Р поджелудочной железы крыс состоит преимущест­венно из СС|-, р3— и у3-субъединиц [13], по другим — в ней, а также в клетках инсуломы определяются мРНК, кодирующие синтез а,-, а2-, а3-, р,-, Р2-, рз-, 5- и у2-субъединиц ГАМКа-Р, а ткань поджелудоч­ной железы человека содержит только мРНК а

2-, Р3— и у-субъединиц [76]. В поджелудочной железе имеет место также экспрессия ГАМКА-Р-ассоции- рованных белков [79], а в р-клетках поджелудочной железы человека, крысы и в культуре р-клеток MIN6 установлено присутствие ГАМКВ1а— и ГАМКВ2-Р [16].

Содержание ГАМК в поджелудочной железе крыс с аллоксановым диабетом составило только 15%, а активность ГДК — 50% от уровня у интакт­ных животных [55], что связано со значительной деструкцией р-клеток вследствие действия аллок­сана. у мышей с диабетом в 5 раз выше, чем у контрольных живот­ных [65].

На первых этапах изучения функции ГАМК в поджелудочной железе предполагали, что ГАМК- шунт может быть альтернативным источником энергии для процесса синтеза инсулина [34]. О воз­можной роли ГАМК в механизмах секреции сви­детельствуют данные о присутствии аминокислоты в малых везикулах, субклеточная локализация ко­торых, спектр белков, содержащихся в них, и со­став их мембран указывают на участие этих органел в экзоцитозе [52, 57]. Роль везикулярных белков в механизмах высвобождения ГАМК и инсулина различна [59].

В условиях ингибирования ГАМ К-Т поджелу­дочной железы гамма-винил-ГАМК внутриклеточ­ное содержание аминокислоты повышалось на 77%, а интенсивность синтеза инсулина — на 69%. В то же время перфузия ГАМК изолированной же­лезы собаки приводила к угнетению секреции ин­сулина [34], а в случае перфузии другим ингибито­ром ГАМК-Т — гамма-ацетилен-ГАМК стимуля­ции глюкозой секреции инсулина не происходило, хотя высвобождение гормона, стимулированное вследствие перфузии 3-фенилпируватом, было сниженным. Авторы предположили, что ГАМК может влиять на секрецию инсулина только при низких концентрациях глюкозы [76]. Внесение в среду культивирования ГАМК или агонистов ГАМК

а-Р или ГАМКВ-Р мусцимола и баклофена соответственно не влияло на содержание и секре­цию инсулина в клетках островков поджелудочной железы [76]. По другим данным, активация ГАМКВ-Р вследствие действия баклофена угнетала секрецию инсулина, однако эффект этот наблю­дался лишь в присутствии глюкозы. Считают, что возможный механизм участия ГАМК в регуляции секреции инсулина включает в себя прямое влия­ние аминокислоты на Са2+— и К+-каналы, на по­следние посредством модуляции активности G- белков [16]. Во время секреции инсулина в подже­лудочной железе крыс повышалась экспрессия ГДКИ [63]. Кроме того, на трансгенных мышах, экспрессирующих ГДК65 человека, было показано, что у животных с нормальной толерантностью к глюкозе интенсивность экспрессии ферментного белка была наименьшей по сравнению с таковой у животных со сниженным уровнем секреции инсу­лина или с нарушением толерантности к глюкозе. Результаты этих исследований позволили выска­зать предположение о том, что ГАМК может функ­ционировать как отрицательный регулятор первой фазы секреции инсулина в ответ на увеличение уровня глюкозы [73].

Секреция соматостатина вследствие перфузии поджелудочной железы ГАМК снижалась, однако внесение аминокислоты в среду инкубации остров­ков поджелудочной железы повышало высвобож­дение гормона. Последний эффект снимался анта­гонистом ГАМК.а-Р бикукуллином [34]. В случае культивирования изолированных островков с ГАМК или мусцимолом установлено, что содержа­ние соматостатина в них было выше, а высвобож­дение гормона ниже, чем в контрольной культуре. В то же время* повышение уровня ГАМК в среде культивирования вследствие действия гамма-ви- нил-ГАМК или аминоуксусной кислоты не влияло на высвобождение соматостатина. В других иссле­дованиях было показано, что ГАМК, мусцимол и баклофен не влияли на базальное или стимулиро­ванное высвобождение соматостатина и электри­ческую активность р-клеток, хотя экзогенная ГАМК и мусцимол снижали секрецию глюкагона, стимулированную низким уровнем глюкозы или аргинином [76]. Кроме того, бикукуллин не пре­дотвращал угнетение секреции глюкагона под влиянием низких концентраций глюкозы. Прини­мая во внимание эти данные, авторы сделали вы­вод о том, что нет серьезных подтверждений гипо­тезы об участии ГАМК в торможении глюкозой вы­свобождения глюкагона. Это мнение не поддержи­вают другие исследователи, установившие угнетение секреции глюкагона при инкубации линии р-клеток в присутствии ГАМК, которое предотвращалось внесением в среду инкубации бикукуллина [36].

При исследовании возможных механизмов уча­стия ГАМК в регуляции секреции гормонов под­желудочной железы были получены данные, позво­ляющие предположить, что аминокислота гипер- поляризует мембраны клеток и предупреждает об­разование потенциала действия, что совпадает по времени с развитием потока ионов С1_ наружу и снижением активности Са2+-каналов. Последнее приводит к снижению концентрации внутрикле­точного Са2+ и ингибированию секреции глюкаго­на. Все эти эффекты предупреждались бикукулли­ном и пикротоксином [70]. В то же время, по дан­ным других исследователей, ГАМК продуцировала повышение секреции глюкагона в изолированной ткани поджелудочной железы интактных крыс и крыс с диабетом [6].

В литературе есть сведения об изменении уров­ня инсулина, глюкагона, соматостатина и С-пеп- тида в крови людей и животных после введения ГАМК, агонистов и антагонистов ее рецепторов [34, 35]. Считают, что влияние этих веществ in vivo на секрецию гормонов поджелудочной железы мо­жет быть опосредовано через ЦНС. Доказательст­вом этого, в частности, являются данные о стиму­ляции секреции гормонов в условиях инфузии моз­га средой, содержащей бикукуллин. Однако у боль­ных инсулинзависимым диабетом прием баклофе­на или ингибитора ферментов метаболизма ГАМК вальпроата натрия не изменял в крови уровень ин­сулина, С-пептида, глюкагона, соматостатина, а также толерантность к глюкозе [68].

Ряд работ посвящен изучению возможности те­рапевтического применения ГАМК и препаратов, изменяющих активность ее системы, в механизмах коррекции функции поджелудочной железы. Так, культивирование изолированных островков в при­сутствии различных концентраций глюкозы приво­дило к 4—5-кратному повышению экспрессии ГДК65; уровень ГАМК при этом оставался неиз­менным. Считают, что нормализация гликемии может снижать интенсивность экспрессии аутоан­тигена в островках, что будет предотвращать их де­струкцию [48]. Это мнение поддерживается други­ми исследователями: инкубация островков в среде, содержащей высокую концентрацию глюкозы, приводила к повышению активности ГДК и уровня ферментативных белков ГДК65 и ГДК67. Этот эф­фект глюкозы тормозился гамма-винил-ГАМ К. Учитывая эти данные, для уменьшения интенсив­ности экспрессии аутоантигена, приводящей к тор­можению аутоиммунного ответа (3-клеток при ин­сулинзависимом диабете, теоретически предложе­но применение ингибиторов ГАМК-Т [64].

С целью разработки превентивной терапии ин­сулинзависимого диабета уже проведены экспери­ментальные исследования по применению ГАМ- Кергических препаратов для нормализации уровня инсулина и гликемии. Показано, что введение ме­таболита ГАМК — гамма-оксимасляной кислоты одновременно с никотинамидом в период действия стрептозотоцина предотвращало развитие экспери­ментального диабета у мышей. При инкубации изолированных островков поджелудочной железы в среде, содержащей стрептозотоцин, гамма-окси- масляную кислоту и никотинамид, секреция инсу­лина в ответ на внесение в среду глюкозы не нару­шалась, что обычно наблюдали при действии од­ного стрептозотоцина [14]. Следует, однако, под­черкнуть, что в опытах in vivo и in vitro сама гамма- оксимасляная кислота, как и сам никотинамид та­кого превентивного эффекта не давали. При изу­чении влияния баклофена было установлено, что прием препарата мышами, у которых развитие диа­бета запрограммировано генетически, приводило к задержке времени начала заболевания, хотя сте­пень выраженности инсулитов и активность ГДК в поджелудочной железе не изменялись. Авторы счи­тают баклофен перспективным препаратом, дейст­вие которого направлено на активацию ГАМКер- гической системы, локализованной в островках поджелудочной железы, с которой ассоциируются как экспрессия аутоантигена, так и модуляция сек­реции инсулина [10].

Следовательно, несмотря на многочисленность исследований, роль ГАМК в регуляции секреции гормонов поджелудочной железы остается еще в значительной степени неясной [69].

Надпочечники

Концентрация аминокислоты в надпочечниках невелика, активность ГДК и ГАМК-Т также нахо­дится на низком, как для периферических тканей, уровне [34]. Однако пересадка ткани мозгового слоя надпочечников в стриатум крыс, у которых эта структура мозга была разрушена вследствие введения каиновой кислоты, вполне компенсиро­вала дефицит ГАМКергических нейронов, что спо­собствовало нормализации нарушенного поведе­ния крыс [46].

ГАМК в мозговом слое надпочечников локали­зуется в клетках вместе с адреналином и норадре-

налином [31]. В 1-ю неделю после рождения ни в одной из хромаффинных клеток мышат, как и у плодов, ГАМК-иммунореактивный материал не определялся; до 2-ю неделю жизни количество его повышалось до величины, характерной для надпо­чечников взрослых животных [44]. в надпочечниках человека и крыс [76]. Дан­ные последних лет свидетельствуют о том, что в надпочечниках человека, мыши и крысы экспрес­сируются все 3 формы ГДК — 65, 67 и 25 [25]. При определении активности ГДК биохимическими методами показано ее присутствие в ткани надпо­чечников крыс, кроликов, человека, коры надпо­чечников человека, морских свинок, мозговом слое надпочечников коров [1,2, 34]. Часть ГАМК в над­почечниках синтезируется из путресцина [75].

Что касается ГАМК-Т, то хотя она иммуноло­гически и выявляется в культуре хромаффинных клеток быка [76], однако основной катаболизм ГАМК в надпочечниках, похоже, происходит при участии других механизмов. Биофизические и ки­нетические показатели ГАМК-Т мозгового слоя надпочечников быка близки к таковым для фер­мента мозга [60], но блокатор ГАМК-Т 2-аминоук- сусная кислота не способна повысить уровень ГАМК в органе, как это происходит в мозге или, например, в поджелудочной железе [76].

‘Из мозгового слоя надпочечников быка была частично очищена ДПЯК, фермент подобен ней­рональному в отношении pH-оптимума, локализа­ции (в митохондриях), чуствительности к АТФ, аф­финности к субстрату и кофактору. Клетки мозго­вого слоя надпочечников содержат также систему транспорта ГАМК и ее специфические рецепторы, что, как считают, вместе с данными, характеризую­щими функционирование ферментов обмена ГАМК, может свидетельствовать о регуляторной роли аминокислоты в хромаффинных клетках [76]. ГАМКа-Р здесь связаны с бензодиазепиновыми, и функциональные характеристики этого комплекса очень близки таковым в мозге. В составе ГАМКа-Р определяют а,-, а4-, р,-, р2-, р2— и у2-субъединицы [61], а длинная субъединица ГАМКВ-Р экспресси­руется в надпочечниках в виде 2 изоформ — ГАМКВ1аи ГАМКВ|Ь [11, 21].

Выяснено, что высвобождение ГАМК и норад­реналина происходит параллельно, хотя ГАМК вы­свобождается всегда в меньшем количестве. Сти­мулированное никотином и К+ высвобождение ГАМК зависит от Са2+, а при действии вератридина наблюдали Са2+-независимый, но зависящий от 1Ча+-компонент, который блокировался ингибито­рами захвата ГАМК. Считают, что оба эти механиз­ма могут принимать участие в ГАМКергическом контроле секреции катехоламинов [60].

Представление об этой функции ГАМК сфор­мировалось на основании данных о влиянии ами­нокислоты и ее миметиков на высвобождение ка­техоламинов и состояние тех процессов, которые непосредственно задействованы в регуляции сек­реции. ГАМК вызывала Са2+-зависимое повыше­ние высвобождения катехоламинов, что имело до­зозависимый характер и составляло 2/3 от уровня никотинстимулированного [76]. Предполагают су­ществование двойной регуляции секреции катехо­ламинов: активация ее опосредована ГАМКа-Р, а торможение — ГАМКВ-Р. Этот вывод базировался на результатах, свидетельствующих об имитации мусцимолом действия ГАМК, которая в свою оче­редь снималась бикукуллином и баклофеном. По­следний подавлял как никотин- и КС1-стимулиро- ванное, так и базальное высвобождение катехола­минов [49]. Мусцимол одновременно с влиянием на секрецию катехоламинов вызывал также вход Са2+ в клетки; считают, что этот процесс важен именно для инициации высвобождения гормонов [39]. Поскольку повышение уровня внутриклеточ­ного Са2+ зависит от внеклеточной его концентра­ции, влияние ГАМК на вход Са2+ в клетки может быть опосредовано хотя бы частично потенциал- чувствительными Са2+-каналами [49]. Кроме этого, показано, что ГАМК ингибирует спонтанные ко­лебания концентрации и высвобождения Са2+ в хромаффинных клетках надпочечников крыс. Та­кое же действие оказывает и мусцимол, но не бак­лофен. Эффект аминокислоты и агониста ГАМКа— Р снимался бикукуллином [17, 58]. Принимая во внимание эти данные, а также способность ГАМК деполяризировать мембраны хромаффинных кле­ток, авторы считают значительной ее роль в физио­логической регуляции функции мозгового слоя надпочечников [17].

В опытах in vivo баклофен, введенный перед на­чалом плавания, предотвращал стрессовое повы­шение секреции адреналина и значительно снижал в крови крыс концентрацию дофамина. В то же время введение баклофена животным, находящим­ся в состоянии покоя, вызывало повышение секре­ции катехоламинов [4], как и внесение этого аго­ниста ГАМКВ-Р в среду инкубации хромаффинных клеток in vitro [62]. Следовательно, эффект актива­ции ГАМКВ-Р на процессы секреции катехолами­нов, а также роль первых в регуляции функции клеток мозгового слоя надпочечников остаются до конца не ясными.

Интересными представляются результаты ис­следований влияния вальпроата натрия: ингибитор ферментов обмена ГАМК, внесенный в среду куль­тивирования хромаффинных клеток быка, вызывал повышение синтеза белка, экспрессии одной из субъединиц К’ат-каналов, спонтанной и стимули­рованной активности последних, а также Са2+-ка- налов и секреции катехоламинов. Выводом из этих

данных явилось предположение о том, что вальп- роат натрия (или повышенный уровень ГАМК ?) регулирует экспрессию или активность ионных ка­налов плазматических мембран хромаффинных клеток, вследствие чего повышается секреция ка­техоламинов [80].

Модулирующее влияние метаболитов прогесте­рона на активность ГАМКа—БД—СГ-РК было по­казано при изучении субмаксимального потока ио­нов в целых клетках культуры хромаффинной тка­ни надпочечников быка. Интенсивность этого про­цесса повышалась в условиях внесения в среду культивирования прегнандиона или 5[3-прегнан- За-ол-20-она, но не прогестерона [18]. Все указан­ные вещества вызывали в клетке, находящейся под напряжением, внутренний ток, который, как и в случае индукции ГАМК, обратимо блокировался бикукуллином и усиливался фенобарбиталом. Пре- гнанолон также повышал мусцимолстимулирован- ную секрецию катехоламинов в изолированных хромаффинных клетках [61].

Данных о локализации и функции компонентов ГАМК-системы в коре надпочечников значительно меньше. Здесь определяются активность фермента синтеза ГАМК и специфическое связывание ами­нокислоты плазматическими мембранами, кото­рые, как и в мозге, подвержены сезонным измене­ниям [1]. Кроме того, активность ГДК и интенсив­ность связывания аминокислоты изменяются в надпочечниках в условиях физиологической или гормональной модификации интенсивности сте­роидогенеза, а также при патологии коры надпо­чечников человека [1—3].

Половые железы

В яичниках животных концентрация ГАМК на­ходится на среднем, как для периферических орга­нов, уровне, в гранулярных клетках она отсутству­ет. Активность ГДК и ГАМК-Т низка [34]. Счита­ют, что последнее, а также неспособность ингиби­торов ГАМК-Т повысить уровень ГАМК в яични­ках могут свидетельствовать о наличии в ткани это­го органа альтернативных путей метаболизма ГАМК. Аминокислота тут может образовываться из путресцина, однако неизвестно, происходит ли катаболизм ГАМК до спермидина, как неизвестно и присутствие в яичниках ДПЯК.

На мембранах яичников человека и крыс опре­делены специфические высокоаффинные места связывания ГАМК, плотность которых очень вы­сока и может быть сравнима с плотностью мест связывания ГАМК в мозге [8, 34]. С помощью спе­цифических фармакологических препаратов эти места были идентифицированы как ГАМКД-Р, вхо­дящие в ГАМКа—БД—СГ-РК и ГАМКВ-Р, причем характеристики их оказались очень близкими к та­ковым для ГАМК-Р мозга [34]. Интересно, что в яичниках экспрессируются мРНК pi-субъединицы ГАМКа-Р, которые встречаются в некоторых пери­ферических органах и отсутствуют в мозге [41], а также ГАМКд-Р-ассоциированные белки, экспрес­сия одного из них существенна [79]. мРНК ГАМК- В1-Р экспрессируется в яичниках в виде 2 изоформ [21 ], а интенсивность экспрессии и функция в яич­никах ГАМК-Тр, характеристики которого близки к таковым для мозгового, контролируются многи­ми внутриклеточными сигнальными системами, в частности тирозинкиназой и протеинкиназой С [51].

Результаты немногочисленных экспериментов указывают на зависимость концентрации ГАМК и активности ферментов ее обмена в яичниках от уровня половых гормонов. Установлено, что содер­жание ГАМК в яичниках изменяется в течение эс- трального цикла [35]; гипофизэктомия или овари- эктомия вызывали существенное уменьшение ак­тивности ГДК и уровня ГАМК, а беременность со­провождалась прогрессивным увеличением ее со­держания [34].

Концентрация ГАМК в семенниках составляет около 2% от таковой в мозге. Среди изоферментов ГДК в сперматоцитах и сперматозоидах, но не в клетках Лейдига или Сертоли присутствует лишь ГДК67, которая по данным гибридизации, иммуно­логических исследований и определения амино­кислотной последовательности очень близка к ферменту мозга [34, 76]. Следует отметить, что в яичках человека экспрессируется и короткая фор­ма ГДК67 — ГДК25 [25]. Как и ГДК, ГАМК-Т из яичка человека подобна ферменту из мозга [34].

Существование ГАМКД-Р на мембранах семен­ников показано в опытах in vitro при определении влияния ГАМК, агонистов и антагонистов ГАМКД— и ГАМКВ-Р на функцию этого органа [21], а также в серии молекулярно-биологических исследований по клонированию разных форм ГАМК-Р [21, 40, 79]. Так, было установлено, что в семенниках взрослых крыс экспрессируется только мРНК длинной субъединицы ГАМКВ-Р, которая выявля­ется в 2 [11] или 3 [40] изоформах. В семенниках крыс имеет место экспрессия у,- (но не у2— или у3-) субъединицы ГАМКа-Р. Присутствие исключи­тельно у,-субъединицы ГАМКЛ-Р в семенниках мо­жет свидетельствовать об ее специфической функ­циональной роли [42]. В яичках человека установ­лена экспрессия всех ГАМКд-Р-ассоциированных белков, связанных с у-субъединицей ГАМКД-Р; ин­тенсивность экспрессии одного из них существен­на [79].

В семенниках мышей процесс транскрипции ГАМК-Тр имеет ряд особенностей, которые отли­чаются от характера его транскрипции в мозге [45, 54]. Этот транспортер также локализован на мем­бранах сперматидов и сперматозоидов [42]. Транс­порт ГАМК Na+— и СГ-зависим, интенсивность его имеет значительные индивидуальные отличия [5].

В опытах на хомяках было показано, что уро­вень ГАМК в семенниках значительно повышался в препубертатном периоде. Это происходило до на­чала повышения концентрации тестостерона и од­новременно с увеличением концентрации предше­ственника ГАМК глутаминовой кислоты [32]. При содержании хомяков на протяжении 9—22 нед в ус­ловиях короткого светового периода на фоне про­грессирующей инволюции семенников, а также снижения концентрации тестостерона уровень ГАМК и глутаминовой кислоты между 12-й и 18-й неделями наблюдения был резко сниженным. Поз-

же, в период максимальной инволюции репродук­тивных органов хомяков, концентрация ГАМК значительно повышалась, тогда как уровень глута­миновой кислоты оставался сниженным. Актив­ность ГДК в семенниках начинала возрастать, на­чиная с 14-й недели содержания животных в по­добных экспериментальных условиях. Авторы счи­тают, что изменение содержания ГАМК в семен­никах животных, репродуктивная функция кото­рых зависит от длительности фотопериода, может быть важным ауто- или паракринным модулятор­ным сигналом для регуляции процессов стероидо­генеза в семенниках [33].

Щитовидная железа

Исследование компонентов ГАМК-системы и ее роли в функционировании щитовидной железы проводили в очень ограниченном объеме и только на первых этапах изучения ненейрональной ГАМК (последние работы датированы 1981 г.). Показано, что в щитовидной железе ГАМК может синтезиро­ваться с помощью ГДК и метаболизироваться с по­мощью ГАМК-Т. Концетрания аминокислоты, как и величина активности ферментов в железе, низка [34].Специфическая система высокоаффинного транспорта ГАМК по своим характеристикам по­добна таковой в мозге, локализуется в основном на мембранах фолликулярных и отсутствует на мем­бранах С-клеток и тучных клеток. In vivo ГАМК не влияла на синтез тиреоидных гормонов и содержа­ние йодида в железе. В то же время при гипотире­озе активность ГАМК-Т повышалась за счет уве­личения скорости реакции, тогда как при гиперти­реозе она была сниженной, одновременно с этим имела место интенсификация высокоаффинного захвата аминокислоты. Существование активной системы транспорта ГАМК, модуляция ее активно­сти, как и активности ферментов обмена амино­кислоты, позволили авторам предположить, что ГАМК может играть определенную роль в функ­ционировании щитовидной железы [37, 38]. Сведе­ния о ГАМК-Р щитовидной железы в литературе отсутствуют.

Тимус

О присутствии ГАМК в тимусе известно давно [34], но первые сведения о ферментах ее обмена в железе появились лишь в последние годы. Синтез ГДК происходит в специализированных клетках железы человека [67], а в тимусе 7-дневных мышат со спонтанным диабетом установлена экспрессия только одного из изоферментов — ГДК67, который считают потенциальным аутоантигеном [66]. При­менение биохимических и гистоэнзиматических методов позволило выяснить, что большая часть активности ГАМК-Т в тимусе крыс локализована в стенках кровеносных и лимфатических сосудов, а меньшая ассоциируется с субкапсулярной и медул­лярной частью паренхимы. В условиях стимуляции интерлейкином иммунного ответа активность ГАМК-Т повышалась в различных структурах ти­муса [23]. В тимусе человека показана низкая экс­прессия ГАМКА-Р-ассоциированных белков [79].

Среди возможных функций ГАМК в тимусе одно­временно с нейромедиаторной [22] рассматривают и значение молекулы в осуществлении связи между функциями нервной и иммунной систем [24]. Роль ГАМК в эндокринной функции тимуса неизвестна.

Гипофиз

Известно, что ГАМК играет важную роль в ре­гуляции секреции гормонов гипофиза, однако ха­рактерные детали функционирования собственно медиаторной системы в гипофизе исследованы не­достаточно. Количественно ГАМК определяется в передней, промежуточной и задней долях, но син­тезируется, по данным ранних исследований, ис­ключительно в двух последних [9, 77]. Величина активности ГДК составляет лишь около 10% от ак­тивности фермента в мозге [56]. В то же время ак­тивность ГАМК-Т в передней доле превышает та­ковую как в иных долях гипофиза, так и в гипота­ламусе. Эти биохимические различия содержания ГАМК и активности ферментов ее обмена в разных долях гипофиза связаны с существованием неоди­наковых морфофункциональных связей между ни­ми и гипоталамусом, а отсутствие в передней доле ГДК позволило сделать вывод о том, что аденоги­пофиз секвестирует ГАМК из крови.

Результаты исследований последних лет, одна­ко, свидетельствуют о том, что в клетках аденоги­пофиза, секретирующих гормон роста, как и во всех эндокринных клетках промежуточной доли гипофиза, экспрессируется ГДК67. С помощью им- муноэлектронной микроскопии установлено, что экспрессия этих белков в соматотропах происходит во внутриклеточных органеллах, запасающих гор­мон. В клеточной культуре Gh4, продуцирующей гормон роста, были идентифицированы гены, ко­дирующие синтез ГДК^ [56].

Следовательно, существуют 3 источника ГАМК в гипофизе: транспорт из гипоталамуса по системе портальных сосудов в переднюю долю, прямая ги­поталамическая иннервация задней и промежуточ­ной долей и синтез из глутамата, который наблю­дается не только в двух последних, но и в некото­рых клетках передней доли [56]. Следует также от­метить, что гипофиз интенсивно накапливает и аминокислоту из периферической крови, в случае когда уровень ее в циркуляции повышен [50]. При изучении процесса интернализации меченой ГАМК в гипофизе крыс было показано, что лакто­тропы и соматотропы являются единственными клетками аденогипофиза, в которых накапливается меченая аминокислота. При этом метка локализу­ется в различных внутриклеточных органеллах: плазматических мембранах, комплексе Гольджи, митохондриях и секреторных гранулах [29].

В гипофизе присутствуют все 3 типа ГАМК-Р, локализующиеся (по крайней мере ГАМКа— и ГАМКВ-Р) на всех типах клеток гипофиза и играю­щие важную роль в регуляции секреции всех гипо­физарных гормонов. Выяснение тонких деталей локализации субтипов ГАМК-Р, их структуры и механизмов регуляции — задача дальнейших ис­следований. В настоящее время известно, что фос-

формирование р2— и р3-субъединиц ГАМКа-Р яв­ляется важнейшим моментом в проявлении тор­мозного действия протеинкиназы G на функцию ГАМКа-Р в культуре меланотропов промежуточ­ной доли гипофиза [19]. Протеинкиназа G вовле­чена и в механизм влияния оксида азота на функ­цию ГАМКД-Р’в железе [20].

Фармакологические и функциональные харак­теристики ГАМКВ-Р гипофиза крыс подобны тако­вым в мозге [53]. По одним данным, в гипофизе экспрессируется только длинная субъединица ГАМКВ-Р [11], по другим — обе [12]. Активация ГАМКВ-Р гипофиза ингибирует секрецию гормо­нов in vitro. В основе такого действия лежит отри­цательное взаимодействие между ГАМКВ-Р и Са2+— каналами, опосредованное G-белками [53]. Суще­ствуют возрастные, а также зависящие от пола мо­дуляции уровня ГАМКВ-Р в передней доле гипо­физа. Так, количество связывающих мест у 4-днев­ных самок существенно выше, чем у самцов этого же возраста, тогда как аффинность их одинакова в гипофизе крыс разного пола. Экспрессия ГАМКв,а-Р и ГАМКВ1в-Р уменьшается в гипофизе самок, начиная с 4-го дня после рождения и до взрослого возраста, при этом экспрессия ГАМКВ1а— Р на ранних стадиях развития значительно превы­шала таковую ГАМКВ|в-Р. Экспрессия ГАМКВ2-Р незначительна. У самцов характер изменений экс­прессии ГАМКВ1а-Р был аналогичен таковому у са­мок, хотя интенсивность ее была ниже, чем у самок на ранних стадиях развития. Экспрессия ГАМКВ]Ь— Р и ГАМКВ2-Р в гипофизе самцов очень низка [12].

В гипофизе морских свинок и крыс экспресси­руются обе р-субъединицы ГАМКС-Р, мРНК рг субъединицы в гипофизе крыс превалирует. При использовании антител, специфичных к субъеди­нице ГАМКС-Р, показана совместная клеточная локализация р,-субъединицы и ТТГ. Предполага­ют, что ГАМКС-Р принимают активное участие в регуляции секреции ТТГ и что структура и биохи­мическая регуляция этих рецепторов в гипофизе отличаются от таковых в сетчатке, где они были впервые идентифицированы [15].

С помощью современных методов исследования было показано, что во всех эндокринных клетках промежуточной доли гипофиза, а также соматотро- пах передней доли локализуется везикулярный ГАМК-Тр [56]. Изучение процессов регуляции транспорта ГАМК показало, что интерлейкин-6 не влиял на высвобождение ГАМК из задней доли ги­пофиза, однако повышал интенсивность этого про­цесса в условиях предварительной деполяризации мембран клеток. Эффект интерлейкина-6 снижал­ся при инкубации ткани с ингибитором циклоок­сигеназы, что свидетельствует в пользу медиатор­ной роли простагландинов в процессе высвобож­дения ГАМК [28].

По последним данным, по крайней мере 2 типа клеток, а именно клетки промежуточной доли, сек­ретирующие пропиомеланокортин, и соматотропы передней доли гипофиза, способны синтезировать, запасать и секретировать ГАМК. Данные о совме­стной локализации ГАМК, фермента ее синтеза, ГАМК-Тр, а также гормона роста в одних и тех же субклеточных органеллах позволили предполо­жить, что ГАМК, образовавшаяся в соматотропах, может контролировать высвобождение гормона по паракринному типу регуляции, а присутствие ГАМК-Р на мембранах этих клеток свидетельству­ет и о возможном аутокринном характере контроля [56]. Сформулирована концепция многоуровневой ГАМКергической регуляции секреции гормонов гипофиза: 1) гипоталамический непрямой меха­низм, опосредованный ГАМКергическим контро­лем секреции гипоталамических рилизинг-факто- ров; 2) гипоталамический прямой с вовлечением ГАМК, выделившейся из аксонов нейронов гипо­таламуса непосредственно в задней и промежуточ­ной долях; 3) гипоталамический нейрогумораль- ный при участии ГАМК, которая поступает в аде­ногипофиз по системе портальных сосудов; 4) па- ра/аутокринный с участием ГАМК, которая синте­зируется и высвобождается собственно в эндок­ринной клетке гипофиза. Для решения вопроса о возможном существовании последнего механизма и в других клетках гипофиза необходимы дальней­шие исследования.

Следовательно, метаболизм и транспорт ГАМК, как и структура ее рецепторов в эндокринных же­лезах значительно отличаются от аналогичных по­казателей в мозге. Возможно, это является особен­но важным для реализации тех функций, которые осуществляет ГАМК в указанных органах. Наряду с нейромедиаторной следует отметить роль амино­кислоты в регуляции ряда внутриклеточных и мем­бранных процессов, участвующих в синтезе и сек­реции гормонов. Выяснение всех аспектов этой проблемы приблизит решение вопроса о возмож­ной коррекции нарушений функции эндокринных желез препаратами, влияющими на активность ГАМКергической системы

1. MuutyHina Т. М., Кононенко В. Я., MiKoiua О. С., Тронь- ко М. Д. И Ф1зюл. журн. — 1994. — N 3. — С. 9-15.

2. Muiuynina Т. М., Кононенко В. Я., Рибаков С. Й. // Ендок- ринолопя. — 2000. — Т. 5, N 1. — С. 16-21.

3. Muiuynina Т. М., Кононенко В. Я. // Пробл. эндокринол. —2001- N 3. — С. 33-36.

4. Muiuynina Т. М., Калииченко О. В. // Ф1зюл. журн. — 2001.Т. 47, N 5. — С. 47-53.

5. Aanesen A., Fried G., Anderson Е., Gottlieb С. // Biol. Reprod.1996. — Vol. 54, N 4. — P. 841-846.

6. Adeghate E., Ponery A., Pallet D., Singh J. // Tissue Cell. —2000- Vol. 32, N 3. — P. 266-274.

7. Ahnerthilger G., Stadtbaumer A., Strubing C. et al. // Gastroen¬terology. — 1996. — Vol. 110, N 5. — P. 1595-1604.

8. Akinci M., Schofield P. // Neurosci. Res. — 1999. — Vol. 35, N 2. — P. 145-153.

9. Apud J., Cocchi D., Locatelli Y. et al. // Psychoneuroendo- crinology. — 1989. — Vol. 14, N 1—2. — P. 3-17.

10. Beales P., Hawa M., Williams A. et al. // Acta Diabetol. — 1995. — Vol. 32, N 1. — P. 53-56.

11. Belley M., Sullivan R., Reeves A. et al. // Bioorg. Med. Chem.1999. — Vol. 7, N 12. — P. 2697-2704.

12. Bianchi M., Rey-Roldan E., Better B. et al. // Neuropharma¬cology. — 2001. — Vol. 40, N 2. — P. 185-192.

13. Borboni P.. De Steforpus P., Fusco A. et al. // Diabetes. — 1992. — Vol. 41. — Suppl. 1. — P. 46.

14. Bouix O., Reynier M., Guintrandhugret R., Orsetti A. // Horm. Metab. Res. -1995. — Vol. 27, N 5. — P. 216-220.

15. Boue-Grabot E., Taupignon A., Tramu G., Garret M. // Endo¬crinology. — 2000. — Vol. 141. — P. 1627-1632.

16. Brice N., Varadi A., Ashcroft S., Molnar E. // Diabetologia. —2002- Vol. 45, N 2. — P. 242-252.

17. Busik J., Nakamura M., Abe Y. et al. // Brain Res. — 1996. — Vol. 739, N 1-2. — P. 97-103.

18. Callahan H., Cottrell G., Hather N. et al. // J. Physiol. — 1986. — Vol. 281. — P. 117.

19. Castel H., Louiset E., Anouar Y. et al. // J. Neuroendocrinol.2000. — Vol. 12, N 1. — P. 41-52.

20. Castel H., Jegou S., Tonon M., Vandry H. // Endocrinology. — 2000. — Vol. 141, N 9. — P. 3451-3460.

21. Castelli V., Ingianni A., Stefanini E., Gessa G. // Life Sci. —1999- Vol. 64, N 15. — P. 1321-1328.

22. Cavallotti D., Artico M., De Sand S., Cavallotti C. // Hum. Im¬munol. — 1999. — Vol. 60, N 11. — P. 1072-1079.

23. Cavallotti D., Artico M., Cavallotti C. // Int. J. Immunophar- macol. — 2000. — Vol. 22, N 9. — P. 719-728.

24. Cavallotti D., Artico M., D’Andrea V, Cavallotti C. // Hum. Immunol. — 2000. — Vol. 61, N 7. — P. 697-704.

25. Chessler S., Lernmark A. // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275, N 7. — P. 5188-5192.

26. Cram D., Faulner-Jones B., Kun J., Harrison L. // Endocrinol¬ogy. — 1995. — Vol. 136, N 3. — P. 1111-1119.

27. Delasheras M., Valcarcel A., Peres L. // Biol. Reprod. — 1997.Vol. 56, N 4. — P. 964-968.

28. De Laurentiis A., Pisera D., Lasaga M. et al. // Neuroimmu- nomodulation. — 2000. — Vol. 7, N 2. — P. 77-83.

29. Duvilanski D., Perez R, Seilicovich A. et al. // Tissue Cell. —2000- Vol. 32, N 4. — P. 284-292.

30. Eaton M., Martinez M., Normally S. et al. // Cell. Transplant.2000. — Vol. 9, N 5. — P. 637-656.

31. Eranzoni M., Sapei M., Beltramo M., Calas A. // Neuroendo¬crinology. — 1990. — Vol. 52. — Suppl. 1. — P. 51.

32. Frungieri M., Gonzalezcalvar S., Chabdrashekar V. et al. // Int. J. Androl. — 1996. — Vol. 19, N 3. — P. 164-170.

33. Frungieri M., Gonzalezcalvar S., Calandra R. // Int. J. Androl.1996. — Vol. 19, N 3. — P. 171-178.

34. GABA-Ergic Mechanisms in Mammalian Periphery / (Eds S. Erdo, N. Bowery. — New York, 1986.

35. GABA Outside the CNS / Ed. S. Erdo — New York, 1992.

36. Gaskins H., Baldeon M., Selassie L., Beverly J. // J. Biol. Chem. — 1995. — Vol. 270, N 51. — P. 30286-30289.

37. Gebauer H, Crailsheim K. // Acta Endocrinol. — 1981. — Vol. 97. — Suppl. 243. — P. 58.

38. Gebauer H, Pabst A. // Cell Tissue Res. — 1981. — Vol. 220, N 4. — P. 873-879.

39. Gonzalez M., Oset-Gasque M., Castro E. et al. // Neuro¬science. — 1992. — Vol. 47, N 2. — P. 487-494.

40. He X., Hu J., Wu Q. et al. // Biochem. Biophys. Res. Com¬mun. — 2001. — Vol. 283, N 1. — P. 243-247.

41. Hedblom E., Kirkness E. // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272, N 24. — P. 15246-15350.

42. Hu J., He X, Yan Y. Ц Cell Res. — 2000. — Vol. 10, N 1. — VP. 51-58.

43. Hu J., Yan Y. // Cell Res. — 2002. — Vol. 12, N 1. — P. 33- 37.

44. Iwasa K, Oomori Y., Tanaka H. // Arch. Histol. Cytol. —1998- Vol. 61, N 4. — P. 373-382.

45. Jin X., Huang F., Yang N. et al. // Cell Res. — 2001. — Vol. 11, N 2. — P. 161-163.

46. Jousselin-Hosaja M., Venault P., Tobin C. et al. // Behav. Brain Res. — 2001. — Vol. 121, N 1-2. — P. 29-37.

47. Katoh J., Taniguchi H., Ogura M. et al. // Experientia. — 1995. — Vol. 51, N 3. — P. 217-219.

48. Katoh J., Taniguchi H.. Kasuga M. // Life Sci. — 1995. — Vol. 56, N 21. — P. 1799-1805.

49. Kitayama S., Morita K, Dohi T., Tsujimoto A. // Biochim. Bio¬phys. Acta. — 1990. — Vol. 1053, N 2-3. — P. 189-194.

50. Kuroda E., Watanabe V., Tamayama T., Shimada M. 11 Mi- crosc. Res. Tech. — 2000. — Vol. 48, N 2. — P. 116-126.

51. Law R., Stafford A., Quick M. // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275, N 31. — P. 23986-23991.

52. Llona I. // Neurochem. Int. — 1995. — Vol. 27, N 3. — P. 219-226.

53. Lux-Lantos V., Becu-Villalobos D., Bianchi M. et al. // Neu¬roendocrinology. — 2001. — Vol. 73, N 5. — P. 334-343.

54. Ma Y„ Hu J., Zhou X. et al. // Cell Res. — 2000. — Vol. 10, N 1. — P. 59-69.

55. Malaisse-Lagae E, Giroix M., Malaisse W. // Med. Sci. Res.1992. — Vol. 20, N 13. — P. 489-490.

56. Mayerhofer A., Hohne-Zell B., Gamel-Didelon K. et al. // FASEB. J. — 2001. — Vol. 15, N 6. — P. 1089-1091.

57. Nagamatsu S., Nakamichi Y, Watanabe T. et al. // J. Cell Sci.2001. — Vol. 114. N 1. — P. 219-227.

58. Nakamura M. // Jpn. J. Vet. Res. — 1995. — Vol. 43, N 1. — P. 43.

59. Ohara-Imaizumi M., Nakamichi Y., Ozawa S. et al. // Bio¬chem. Biophys. Res. Commun. — 2001. — Vol. 283, N 5. — P. 1025-1030.

60. Oset-Gasque M., Castro E., Gonzalez M. // J. Neurosci. Res.1990. — Vol. 26, N 2. — P. 181-187.

61. Parramon M., Gonzalez M., Oset-Gasgue M. // Br. J. Pharma¬col. — 1995. — Vol. 116, N 2. — P. 1875-1881.

62. Parramon M., Gonzales M., Herrero M., Oset-Gasque M. // J. Neurosci. Res. — 1995. — Vol. 41, N 1. — P. 65-72.

63. Petersen J., Russel S., Marshall M. // Diabetes. — 1993. — Vol. 42, N 3. — P. 484-495.

64. Petersen J., Rimvall K., Jorgensen P. et al. // Diabetologia. —1998- Vol. 41, N 5. — P. 530-535.

65. Pleau J., Esling A., Van Acker C., Dardenne M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1996. — Vol. 254, N 3. — P. 747-753.

66. Pleau J., Esling A., Geutkens S. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2001. — Vol. 283, N 4. — P. 843-848.

67. Pugliese A., Brown D., Garza D. et al. // J. Clin. Invest. —1999- Vol. 107, N 5. — P. 555-564.

68. Quatraro A., Consoli G., Stante A. et al. // Acta Diabetol. — 1986. — Vol. 23, N 1. — P. 23-28.

69. Reddy S., Elliott R., Poole C., Ross J. // Gen. Compar. Endo¬crinol. — 1997. — Vol. 106, N 3. — P. 301-309.

70. Rorsman P., Ashrroft F., Berggren P. // Biochem. Pharmacol.1991. — Vol. 41, N 12. — P. 1783-1790.

71. Saraviafemandez E, Faveeuw C., Blasquezbulant C. et al. // Endocrinology. — 1996. — Vol. 137, N 8. — P. 3497-3506.

72. Sha L., Miller S., Szurzewski J. // Am. J. Physiol. — 2001. — Vol. 280, N 3. — P. G324-G331.

73. Shi Y, Kanaani J., Menard-Rose V. et al. // Am. J. Physiol. — 2000. — Vol. 279, N 3. — P. E684-E694.

74. Smismans A., Schuit E, Pipeleer D. // Diabetologia. — 1997.Vol. 40, N 12. — P. 1411-1415.

75. Testore G., Cravanzola C., Bedino S. // Int. J. Biochem. —2000- Vol. 31, N 7. — P. 777-786.

76. Tillakaratne N., Medina-Kauwe L., Gibson R. // Comp. Bio¬chem. Physiol. — 1995. — Vol. 112, N 2. — P. 247-263.

77. Trabucchi M., Chartrel N., Pelletier G. et al. // J. Comp. Neu¬rol. — 2000. — Vol. 419, N 2. — P. 223-232.

78. Winnock E, Ling Z., De Proft R. et al. // Am. J. Physiol. —1999- Vol. 282, N 4. — P. E937-E942.

79. Xin Y., Yu L., Chen Z. et al. // Genomics. — 2001. — Vol. 74, N 3. — P. 408-413.

80. Yamamoto R., Yanagita T., Kobayashi H. et al. // J. Neuro¬chem. — 1997. — Vol. 68, N 4. — P. 1655-1662.


Один и тот же нейромедиатор тормозит образование нервных клеток и у млекопитающих, и у актиний

Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) — одно из веществ, участвующих в передаче сигналов между нервными клетками. Помимо этого, ГАМК влияет на развитие нервной системы. У взрослых млекопитающих это соединение тормозит образование нейронов, воздействуя, в частности, на ГАМКB-рецепторы. Эксперименты на актинии Nematostella vectensis, животном с гораздо более простой нервной системой, показали, что в случае стрекающих это тоже верно. У актинии обнаружили аналоги ГАМКB-рецепторов млекопитающих. Действуя на них, гамма-аминомасляная кислота замедляет переход N. vectensis от стадии свободноплавающей личинки к стадии полипа и сопутствующее ему формирование нервных клеток.

Многообразие форм животных поражает. Казалось бы, что общего может быть у морского анемона, больше похожего на цветок на толстой ножке, и у какой-нибудь понятной и простой мыши с туловищем, головой, четырьмя конечностями и хвостом? Тем не менее от жизни им, по большому счету, нужно одно и то же, — и поэтому многие принципы строения этих двух организмов действительно близки: обоим необходимо питаться, дышать, размножаться, а для этого обязательно нужно реагировать на сигналы из окружающей среды и координировать действия структур внутри одного организма так, чтобы одни «слышали» потребности других и по мере возможности их удовлетворяли.

Достигать этих целей животным помогает нервная система. Хотя ее сложность у разных животных существенно отличается, ее клетки, как правило, выделяют похожие сигнальные вещества (нейромедиаторы) даже у организмов очень отдаленного родства. Исключение — гребневики: у них набор нейромедиаторов весьма своеобразный, но велика вероятность, что и нервная система их появилась независимо от тех, что характерны для остальных животных (см. Геном гребневиков говорит в пользу двукратного возникновения нервной системы у животных, «Элементы», 19.12.2013; Гипотеза о двукратном появлении нервной системы получила новые подтверждения, «Элементы», 26.05.2014).

То, на какие клетки будет действовать конкретный нейромедиатор и какое влияние это на них окажет, определяется рецепторами к нему — белковыми молекулами, чаще всего встроенными в клеточную мембрану. Играют роль и взаимодействия различных веществ и сигнальных путей. Рецепторы — это белки, они кодируются генами, а гены даже близких по своему предназначению белков отличаются у разных видов. Поэтому клетки животных разных видов имеют неодинаковые наборы рецепторов, а значит, и влияние одного и того же нейромедиатора на организмы разных видов может давать разные эффекты. Кстати, внутри одного вида может наблюдаться довольно большой разброс по силе влияния (например, на кого-то кофеин действует сильно, а кого-то вообще не бодрит; кофеин воздействует на рецепторы к аденозину, и сила эффекта зависит от количества таких рецепторов у конкретного человека). Более того, даже в одном организме клетки одного типа, расположенные в разных местах, могут по-разному реагировать на один и тот же нейромедиатор (у людей клетки, выстилающие стенки кровеносных сосудов, могут по-разному реагировать на адреналин в зависимости от того, где расположен сосуд: одни сосуды будут сужаться, другие — либо не отреагируют, либо расширятся; тип реакции, опять же, зависит от того, какие рецепторы есть у клеток).

Кроме быстрой передачи сигналов от нейрона к нейрону, при которой временно меняются свойства поверхности клетки-реципиента (то есть меняется ее электрическая активность), нейромедиаторы способны оказывать влияние и на форму клетки (побуждать ее создавать новые отростки для принятия сигналов от большего числа «партнеров» или, наоборот, сокращать их число), и на время ее жизни (при эксайтотоксичности нейроны повреждаются и гибнут из-за скопления больших количеств ряда нейромедиаторов), и даже на способность делиться. Конечно, в последнем случае речь идет не о зрелых нейронах: они, как и большинство специализированных клеток, делиться не умеют. Но предшественники нейронов и других типов клеток вполне подвержены подобным влияниям со стороны нейромедиаторов.

Одна из наиболее интересных в этом плане молекул — гамма-аминомасляная кислота (ГАМК). В зрелом мозге млекопитающих она обычно играет роль тормозного нейромедиатора, то есть затрудняет передачу сигналов между нейронами. Тормозные нейромедиаторы ограничивают передачу «неважных» или избыточных сигналов, которые могут вызвать излишнее возбуждение в нервной системе и ненужные изменения в органах, контролируемых этой системой. Если тормозных нейромедиаторов не хватает или клетки не способны их воспринять, то, например, у людей может развиться эпилепсия — спонтанные сокращения мышц, нарушающие работоспособность организма. Они возникают, поскольку в головном мозге есть группа (очаг) клеток, посылающих слишком много сигналов.

В развивающемся мозге ГАМК, напротив, служит возбуждающим медиатором (см. X. Leinekugel et al., 1999. GABA is the principal fast-acting excitatory transmitter in the neonatal brain). Также ГАМК останавливает у взрослых организмов образование новых клеток (уже по всему телу), притом, что интересно, не только нервных (см. C. Giachino et al., 2014. GABA suppresses neurogenesis in the adult hippocampus through GABAB receptors, S. Z. Young, A. Bordey, 2009. GABA’s Control of Stem and Cancer Cell Proliferation in Adult Neural and Peripheral Niches). И в этом случае действие гамма-аминомасляной кислоты на клетки зависит от возраста: в мозге эмбриона мыши она ускоряет появление новых нейронов (см. M. Fukui et al., 2008. Modulation of cellular proliferation and differentiation through GABAB receptors expressed by undifferentiated neural progenitor cells isolated from fetal mouse brain), а «переключение» происходит судя по всему, в течение нескольких дней после рождения (R. Tyzio et al., 2008. Postnatal changes in somatic gamma-aminobutyric acid signalling in the rat hippocampus).

ГАМК меняет скорость образования новых нейронов, воздействуя на рецепторы разного строения: например, рецепторы ГАМКA и ГАМКB. Рецепторы ГАМКА представляют собой ионные каналы — «составные» белки, части которых образуют в клеточной мембране открывающиеся и закрывающиеся отверстия. Через эти отверстия внутрь клетки проходят отрицательно заряженные ионы хлора (Cl), в результате чего сгенерировать возбуждающий сигнал, потенциал действия, клетке становится сложнее. Рецепторы ГАМКB связаны с G-белками, лежащими под клеточной мембраной. G-белки стимулируют открытие одного из типов калиевых каналов, и это в конечном счете приводит к похожим эффектам, что наблюдаются в случае ГАМКA-рецепторов. Вероятно, в случае нейрогенеза решающую роль играет не то, как ГАМКA и ГАМКB меняют возбудимость клеток, а какие-то другие молекулярные последствия активации этих рецепторов.

Если влияние гамма-аминомасляной кислоты на нейрогенез у млекопитающих неплохо изучено, то его действие на сходные процессы у беспозвоночных пока почти не исследовано. Меж тем существует удобный организм, на примере которого это можно было бы изучить, — актиния Nematostella vectensis. В природе она обитает в слабосоленых водах у берегов Великобритании и стран Северной Америки. Это неприхотливое животное из типа стрекающих, родственник коралловых полипов и разнообразных медуз. Несмотря на свою кажущуюся простоту, нематостелла умеет синтезировать многие нейромедиаторы, в том числе гамма-аминомасляную кислоту.

Наличие ГАМК в клетках нематостеллы изначально выявили антителами к этому веществу (клетки, содержащие ГАМК, после обработки флуоресцентными антителами начинали «светиться») и при поиске генов, отвечающих за синтез этого вещества. Функции этой кислоты у актиний пока не вполне ясны. Известно, что ГАМК у нематостеллы участвует в передаче нервных сигналов, но, видимо, не только в этом. Экспрессия генов рецепторов к ГАМК, ферментов, позволяющих ее создать, и белков, способных ее транспортировать, у нематостеллы идет и в нейронах (I. Kelava et al., 2015. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians), и за пределами нервной системы (M. Oren et al., 2014. Fast Neurotransmission Related Genes Are Expressed in Non Nervous Endoderm in the Sea Anemone Nematostella vectensis).

Как модельный объект нематостелла удобна, в частности, своим простым жизненным циклом: у нее отсутствует плавающая стадия медузы, а есть только стадии сидячего полипа (впрочем, он умеет «шагать» и зарываться в субстрат), двухслойной свободноплавающей личинки планулы (на одном ее конце расположен рот, на другом — орган чувств, содержащий пучок длинных ресничек, см. рис. 1 и 2) и яйца. Они сменяют друг друга в порядке, обратном этому перечислению. Скорость метаморфоза зависит от температуры, и если она достигает, скажем, 21 °C, то на седьмой — двенадцатый день после оплодотворения планула N. vectensis трансформируется в молодой полип. Во время этой трансформации у нее исчезает личиночный орган чувств и формируется нервная система диффузного типа — сеть из нервных клеток и их отростков, практически лишенная плотных скоплений нейронов.

Понять молекулярные закономерности развития нематостеллы помогает то, что ее геном уже полностью прочитан. Сделали это еще в 2007 году. Зная последовательности нуклеотидов в генах и типичные взаимодействия между аминокислотами в белках, можно по строению конкретного гена смоделировать структуру белка, кодируемого этим геном.

При прочтении генома нематостеллы выяснилось, что он весьма похож на человеческий (см. Геном актинии оказался почти таким же сложным, как у человека, «Элементы», 11.07.2007). Это очень интересно, если учесть, какими дальними родственниками мы друг другу приходимся. Этим фундаментальные сходства актинии с людьми не заканчиваются: у нематостеллы обнаружили организатор — группу клеток эмбриона, запускающую образование осей тела (см. Обнаружено фундаментальное сходство между развитием актинии и развитием позвоночных, «Элементы», 02.06.2016). Есть даже предположения, что N. vectensis имеет не два, а три зародышевых листка (см. Актиния нематостелла поставила под сомнение классические представления о гомологии зародышевых листков, «Элементы», 28.11.2017). В какой степени «схожесть» с нами распространена среди стрекающих, ученым еще предстоит выяснить.

Этим воспользовались ученые из Университета Хайфы и их испанские коллеги. Они выращивали нематостелл из яиц в темноте при температуре 21 °C и отмечали, когда у актиний происходят основные события: появление планулы и превращение планулы в полип, и процент перешедших с одной стадии на другую на определенный день жизни. Усиление и снижение активности генов во время метаморфоза выявляли раз в сутки с помощью секвенирования РНК. Нервные клетки выявляли благодаря флуоресцентным антителам к FMRF-амиду (FMRFamide) — молекуле, которую у нематостеллы выделяют только нейроны. Эксперименты проводили в трех повторностях.

Личинок разделили на несколько групп по сотне особей в каждой. На развитие особей в контрольной группе никак не влияли (или добавляли в воду диметилсульфоксид — растворитель для некоторых веществ, указанных ниже), а в воду, в которой плавали остальные планулы, на третий-четвертый день после оплодотворения (разница в сутки в данном случае не влияла на результат) добавляли одно из трех веществ: саму гамма-аминомасляную кислоту в концентрации 10−3 или 10−4 моль/л, баклофен в концентрации 10−4 моль/л или CGP-7930 в концентрации 10−5 моль/л. У млекопитающих баклофен подобно ГАМК активирует ГАМКB-рецепторы, а CGP-7930 связывается с этим рецептором в другой точке, но оказывает сходное воздействие.

Кроме активаторов ГАМКB-рецепторов ученые протестировали влияние веществ, блокирующих их работу, — саклофена (saclofen), факлофена (phaclofen) и CGP-35348. Влияние ГАМКA-рецепторов на ход развития нематостелл тоже проверяли — с помощью мусцимола. В половине групп на седьмой день после оплодотворения актиниям пять раз меняли воду. Это позволяло «отмыть» их от веществ, воздействующих на рецепторы к гамма-аминомасляной кислоте.

То, что структуры, на которые воздействовали ГАМК, баклофен и прочие, близки по строению к ГАМКA— и ГАМКB-рецепторам млекопитающих, подтвердили моделированием молекул. Для этого сначала геном нематостеллы проверили на наличие генов, похожих на гены «звериных» рецепторов, затем клонировали эти гены и, зная последовательности нуклеотидов в них, подобрали кристаллические структуры белков, которые с высокой вероятностью кодируются этими генами. Так нашли четыре потенциальных гомолога ГАМКB-рецепторов у актинии и подтвердили, что их форма подходит для связывания гамма-аминомасляной кислоты. В наибольшей степени они походят на ГАМКB1-рецепторы.

Саклофен и другие молекулы, нарушающие работу ГАМКB-рецепторов, не оказали значимого влияния на развитие нематостелл. Не поменяла ход развития и активация предполагаемых ГАМКA-рецепторов мусцимолом. Однако гамма-аминомасляная кислота (особенно в концентрации 10−3 моль/л), CGP-7930 и баклофен замедляли превращение планул в полипы и формирование нервной системы (рис. 3). Это значит, что у нематостелл ГАМК воздействует на метаморфоз через гомологи ГАМКB-рецепторов млекопитающих, и гомологи эти устроены таким образом, что инактиваторы, характерные для позвоночных, на них не действуют. После отмыва от ГАМК, баклофена или CGP-7930 метаморфоз актиний ускорялся.

ГАМК и прочие вещества в целом не снижали скорость деления и роста клеток, которые не давали начало нейронам. Это выявили при анализе совокупности РНК (транскриптома) всех клеток планул и полипов (рис. 4). Баклофен уменьшал активность генов, действующих в предшественниках нервных клеток: NeuroD1, FoxL2 и AshA. Кодируемые ими белки, в свою очередь, руководят работой генов в этих клетках-предшественниках. Поэтому авторы предполагают (впрочем, довольно осторожно: „it is tempting to speculate“), что действие баклофена, ГАМК и CGP-7930 на формирование полипа из планулы специфическое и в основном затрагивает клетки-предшественники нейронов: не дает им «получить профессию», то есть дифференцироваться в зрелые нервные клетки. Еще один аргумент в пользу этой точки зрения заключается в том, что на развитие планул до момента, когда должен начинаться метаморфоз, активаторы ГАМКB-рецепторов не действовали.

Один из способов доказать предложение о том, что ГАМК влияет на формирование нервных клеток, действуя на ГАМК-B рецепторы и тормозя трансформацию их предшественников в нейроны, — лишить клетки планул нематостеллы ГАМКB-рецепторов, а для этого надо снизить работоспособность гена, кодирующий этот рецептор. Здесь возникает трудность: предшественники нейронов образуются довольно поздно, когда у личинки уже сформированы зародышевые листки. На такой стадии развития существующие методики нокдауна генов не слишком эффективны. Если же «выключить» ген ГАМКB-рецептора на стадии, когда зародыш нематостеллы имеет всего несколько клеток, эффекты от процедуры могут оказаться неспецифическими и не будут связаны с предшественниками нейронов, которых на этом этапе просто нет.

Примеры влияния гамма-аминомасляной кислоты и рецепторов к ней на развитие беспозвоночных уже известны — и они бывают неожиданными и сложными. У дрозофил, например, ГАМК, выделяемая нейронами обонятельной системы, контролирует формирование клеток гемолимфы из предшественников (см. J. Shim et al., 2013. Olfactory control of blood progenitor maintenance). У морского моллюска тритии, в отличие от нематостеллы, ГАМК дает сигнал к развитию нервной системы (см. D. Bisocho et al., 2018. GABA is an inhibitory neurotransmitter in the neural circuit regulating metamorphosis in a marine snail). Для морских ежей и двустворчатых моллюсков это, видимо, тоже верно. Однако во всех этих случаях рецепторы, за счет которых гамма-аминомасляная кислота меняет поведение и судьбу клеток, неизвестны. Дальнейшая работа с нематостеллой поможет разобраться в том, как такие рецепторы выглядят и что происходит в клетках-участницах соответствующих процессов после того, как с рецепторами на их поверхности связывается ГАМК.

Источник: Shani Levy, Vera Brekhman, Anna Bakhman, Assaf Malik, Arnau Sebé-Pedrós, Mickey Kosloff & Tamar Lotan. Ectopic activation of GABAB receptors inhibits neurogenesis and metamorphosis in the cnidarian Nematostella vectensis // Nature Ecology & Evolution. 2020. DOI: 10.1038/s41559-020-01338-3.

Светлана Ястребова

Микроглия разрушила тормозные синапсы развивающегося мозга мышей

Favuzzi et. al./ Cell, 2021

Иммунные клетки мозга — микроглия — способны выборочно разрушать тормозные синапсы коры мозга новорожденных мышей, выяснили ученые из США и ОАЭ. Во время экспериментов тормозный медиатор ГАМК, поступающий в синапсы, вызывал изменения в активности генов клеток микроглии и активировал программу изменения синапсов. При этом отключение рецепторов к ГАМК в клетках микроглии привело к нарушениям в поведении мышей. Исследование опубликовано в журнале Cell.

Не смотря на то, что из-за гематоэнцефалического барьера в мозг крайне редко попадают патогены, там тоже есть иммунные клетки — микроглия. Они не только участвуют в воспалительном ответе, но и утилизируют погибшие нейроны, а также могут подавлять активность нейронов и разрушать межнейронные контакты — синапсы. Последний процесс необходим для работы мозга, поскольку чрезмерная активность нейронов может привести к припадкам. Кроме того, процесс разрушения синапсов важен для запоминания — чтобы сохранять новые нейронные контуры воспоминаний, необходимо удалять старые или незначимые связи в памяти. Однако до сих пор непонятно, по какому принципу клетки микроглии «выбирают» синапсы для разрушения.

Биологи под руководством Эмилии Фавуцци (Emilia Favuzzi) из медицинской школы Гарварда исследовали влияние микроглии на возбуждающие и тормозные синапсы. Сначала они отключили в мозге все миелоидные клетки (к которым относится микроглия) на две недели после рождения мышей и проверили, как это повлияло на нейронные связи. Эти связи исследовали в участках соматосенсорной коры мышей. Оказалось, что отключение миелоидных клеток действительно влияет на количество и тормозных, и возбуждающих синапсов в коре: их становится больше без миелоидных клеток (p<0,05).

Синапсы коры мозга мышей (красный сигнал) в контрольной группе с нормальной микроглией (слева) и в группе без миелоидных клеток (справа).

Favuzzi et. al./ Cell, 2021

Чтобы проверить, взаимодействуют ли клетки микроглии с синапсами нейронов напрямую, биологи создали мышей, у которых в обоих типах клеток синтезировались флуоресцентные белки. Эти белки позволяли увидеть взаимодействие при помощи микроскопии. Клетки микроглии собирались в основном вокруг тормозных синапсов, а также экспрессировали рецептор к ГАМК — основному тормозному медиатору.

Биологи предположили, что ГАМК в синапсах может взаимодействовать не только с нейронами, но и с клетками микроглии, чтобы регулировать их влияние на синапсы. Исследователи удалили рецептор к ГАМК из клеток микроглии, чтобы проверить, как изменятся нейронные связи. После удаления в коре мозга мышей увеличилось количество тормозных синапсов, но не изменилось количество возбуждающих. Кроме того, отключение рецепторов к ГАМК вызвало изменения в работе генов клеток микроглии. Большинство генов, которые снизили свою активность после удаления по сравнению с генами клеток дикого типа, относились к кластеру, регулирующему «подрезку» (pruning) синапсов.

Исследователи также провели на мышах без рецепторов к ГАМК поведенческие тесты. Оказалось, что на 30 день после рождения развития такие мыши не так активны, как животные дикого типа: меньше бегают, прыгают и исследуют пространство. А вот на 60 день активное поведение наоборот усилилось. Так биологам удалось показать, что микроглия не просто способна изменять синапсы, но и делать это избирательно — отличать тормозные синапсы от возбуждающих через ГАМК.

Микроглия способна поедать не только межнейронные связи, но и мертвые нейроны. Недавнее исследование показало, что этим микроглия занимается совместно с астроцитами — звездчатыми клетками глии. Нейробиологи выяснили, что клетки разделяют обязанности: первые утилизируют тело нейронов и близлежайшие отростки, а вторые — отдаленные ветви дендритного дерева.

Анна Муравьева

Габа чай что такое полезные свойства и эффект статья Art of Tea

ГАБА или ГАМК — гамма-аминомасляная кислота. Она является медиатором, то есть биологически активным химическим веществом ЦНС человека. ГАБА тормозит нервные импульсы нашего мозга. Ее функция заключается в блокировке лишних информационных потоков. Если бы не ГАБА, мы не смогли бы начать думать мысль и окончить ее логическим заключением. Мысль бы стерлась во множестве других информационных потоков, которые протекают в мозге одновременно.

Принято считать, что ГАБА чай расслабляет. Так и есть.

Чай Габа — не отдельный сорт чая, а любой чай, который имеет повышенное содержание гамма-аминомасляной кислоты. Чтобы получился такой чай, он должен проходить ферментацию без доступа кислорода. Для этого сырье помещают в специальные анаэробные камеры. При обычном способе производства в листьях уже есть небольшое содержание ГАБА. В камере под воздействием высокой температуры и давления ее количество значительно повышается.

Теоретически любой чай можно изготовить таким способом и получить Габа чай. Но повелось так, что его производство приходится преимущественно на остров Тайвань, который славится улунами. Поэтому наиболее широкое распространение получил чай Габа улун, а конкретно сорт Габа Алишань. Однако часто можно встретить и красный Габа чай.

Маслянистый настой Габа-чая, что указывает на богатство микроэлементами и, скорее всего, насыщенный вкус.

ГАБА — очень важный медиатор. Он связан со вниманием, двигательный контролем, эмоциональной регуляцией. Оптимальное его количество способствует балансу реакций возбуждения и торможения. Если в организме недостаточно данной кислоты, то баланс нарушается и дает неприятные эффекты. Человек быстро утомляется, испытывает трудности с концентрацией внимания, ощущает тревожность и постоянный стресс, ведет себя излишне импульсивно, страдает бессонницей.

Дефицит ГАМК может быть вызван генетической предрасположенностью, несбалансированным питанием, нарушенным режимом сна. Польза Габа чая заключается в том, что он способствует повышению уровня ГАМК в организме. Ежедневное питье Габа чая дает планомерный эффект в виде снятия излишнего напряжения, стимуляции работы мозга, улучшения концентрации, повышения работоспособности, нормализации сна и настроения.

Звучит неплохо, правда? Хотя, возможно, у вас назрел вопрос: как проверить, действительно ли у меня дефицит ГАМК и можно ли мне пить такой чай? Спешим успокоить: его благотворное влияние на организм не зависит от того, наблюдается или нет дефицит гамма-аминомасляной кислоты. Спокойно наслаждайтесь сдобными, пропеченными нотами этого чая, а также получайте сладкие плюшки не только в виде вкуса, но и в виде приподнятого состояния духа.

На первом месте — вкус. Потом уже терруар (горные районы острова Тайвань), мастерство изготовителя и технология обработки, ГАБА.

В заваривании Габа чай неприхотлив. Его можно заливать крутым кипятком, и тогда выйдет густо и маслянисто, а можно водой 70-80 градусов, и вкус будет напоминать свежую выпечку. Обычно Габа чай туго скручен, поэтому заваривайте его 20-30 секунд.

Подойдет любая посуда: типот, чайник (фарфоровый, глиняный, стеклянный), гайвань, заварочная кружка.

Универсальность в способе заваривания — выгодное преимущество Габа чая.

При выборе этого чая правильно будет ориентироваться на качество того сырья, которое приготовили методом Габа. Узнайте, какой фермер или завод являются изготовителями, сезон сбора. Далее можно довериться своему вкусу и покупать Габа чай, исходя из понравившегося аромата сухого сырья или вкуса настоя при дегустации.

Сложность в том, что на итоговый вкус Габа чая влияет много факторов: высота сбора, прогрев, степень ферментации листа, мастерство чайного фермера и технолога. Эти переменные образуют восхитительное гастрономическое уравнение. Его можно решать пару лет, без спешки открывать новые вкусы и ароматы. Или сразу приобрести подборку популярных видов Габа чая. О ней в видео:

Набор подойдет тем, кто хочет попробовать сразу все.

Друзья, надеемся, эта статья ответила на ваши вопросы. Теперь вы можете выбрать полезный и вкусный Габа чай, опираясь на свои знания, а не на чье-то мнение. Если хотите попробовать Габа чай, который мы напрямую поставляем от тайваньских фермеских чайных хозяйств, просто вбейте в поисковике Art of Tea и разыщите Габа чай на нашем сайте.

Пейте хороший чай и оставайтесь хорошими людьми!

ЦЕНТРАЛЬНЫЕ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭРЕКЦИИ

Бойко Н.И., Нуриманов К.Р.
Институт урологии и нефрологии АМН Украины (директор – акад. АМН и НАН Украины Возианов А.Ф.)
Отдел сексопатологии и андрологии (руководитель – проф. Горпинченко И.И.)

Источник: журнал АНДРОЛОГИЯ И ГЕНИТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ / №1-2001.

Содержание: Фазы эрекции. Центральная нервная система и половые функции. Адренергические механизмы регуляции эрекции. Холинергические механизмы регуляции эрекции. Нехолинергические неадренергические механизмы. Фосфорилирование миозина и тонус ГМК. Кальций-независимая регуляция тонуса ГМК. Электромеханическое сопряжение в регуляции тонуса ГМК. Фармакомеханическое сопряжение в регуляции тонуса ГМК. Фосфодиэстеразы. Выводы.

Список обозначений:

  • a1-адренорецептор = альфа1-адренорецептор
  • a2-адренорецептор = альфа2-адренорецептор
  • В-адренорецептор = бета-адренорецептор
  • m-адренорецептор = мю-адренорецептор

Эрекция – это увеличение полового члена в объеме по сравнению с состоянием покоя и приобретение им механической твердости, необходимой для проведения полового акта.

Известно, что в зависимости от тонуса гладкомышечных структур полового члена изменяется кровенаполнение кавернозных синусов, на основании чего выделяют следующие фазы эрекции [1,2.3].

Фаза 0 – фаза расслабленного состояния. В этой фазе преобладает симпатический тонус, терминальные артериолы и кавернозные мышечные структуры сокращены. Минимальный кровоток через кавернозные артерии выполняет только трофическую функцию. Наблюдается свободный венозный отток крови.

Фаза 1 – латентная фаза (наполнения). После сексуальной стимуляции парасимпатический тонус начинает преобладать, и отмечается повышение кровотока через внутреннюю пудендальную и кавернозные артерии без каких-либо изменений системного кровяного давления. Периферическое сопротивление снижается в связи с расширением кавернозных и гелициновых артерий. Половой член удлиняется, но внутрикавернозное давление остается прежним.

Фаза 2 – фаза тумесценции. У здоровых молодых мужчин повышение кровяного притока было выявлено по сравнению с фазой 1 в 25-60 раз. Отмечается быстрое повышение внутрикавернозного давления. Однако оно может незначительно снижаться в случае преобладания увеличения объема кавернозных пространств над ростом артериального притока. Обусловленная релаксацией трабекулярных гладких мышц, податливость каверн усиливается, вызывая наполнение кровью полового члена и эрекцию. В конце этой фазы происходит снижение притока крови.

Фаза 3 – фаза полной эрекции. Кавернозные тела наполняются кровью и прижимают сплетения субтуникальных венул к белочной оболочке. Снижается отток крови (венокклюзивный механизм) и повышается внутрикавернозное давление. Оно достигает уровня меньшего систолического давления на 10-20 mm Hg. В эксперименте на кроликах было установлено повышение сопротивления оттоку в 100 раз. Венозный кровоток несколько выше, чем в фазе расслабленного состояния. Артериальный приток по внутренней пудендальной артерии ниже, чем в фазе наполнения, но выше, чем в фазе 1. Но фаза 1 – латентная фаза (наполнения) (см. выше).

Фаза 4 – скелетная или ригидная фаза эрекции. Внутрикавернозное давление повышается выше систолического как следствие произвольного или рефлекторного сокращения ишиокавернозных и бульбокавернозных мышц, что приводит к ригидной эрекции. В этой стадии кровоток по кавернозной артерии отсутствует.

Фаза 5 – переходная фаза. Повышение симпатической активности ведет к восстановлению тонуса гелициновых артерий и трабекулярных гладких мышц. Артериальный кровоток снижается до низкого уровня. Венокклюзивный механизм все еще активный.

Фаза 6 – фаза начальной детумесценции. Отмечается умеренное падение внутрикавернозного давления, свидетельствующее об открытии каналов венозного оттока и снижении артериального притока.

Фаза 7 – фаза детумесценции. Внутрикавернозное давление падает быстро, венокклюзивный механизм инактивируется, и половой член возвращается к расслабленному состоянию.

Далее в обзоре подробно описаны современные представления о механизмах развития описанных фаз эрекции.

Центральная нервная система и половые функции

Центральная нервная система (ЦНС), обеспечивая приспособление функций организма к условиям окружающей среды, выполняет интегрирующую роль в сексуальном поведении человека. Посредством коры головного мозга зрительные, слуховые и обонятельные раздражители создают в подкорковых центрах процессы проэректильной направленности. Тормозное влияние имеют височные доли коры, удаление которых приводит к гиперсексуальности и развитию частых эрекций [4,5]. Описанные процессы реализуются с помощью центральных медиаторов эрекции. Среди наиболее важных необходимо назвать серотонин, дофамин, окситоцин, вазопрессин, адренокортикотропный гормон, пролактин, норадреналин, опиаты и 7-аминомасляная кислота (ГАМК).

На роль центра эрекции претендует медиальная преоптическая область (МПО) гипоталамуса. Так, низкие концентрации дофамина, возбуждая Д1-рецепторы МПО, стимулируют эффекты парасимпатической нервной системы и вызывают эрекцию. Длительная стимуляция дофамином нейронов МПО или высокая его концентрация через Д2-рецепторы переключают центральную регуляцию. Активируется симпатическая нервная система (СНС) и происходит эякуляция с последующей детумесценцией [б].

Влияние МПО на нижележащие центры опосредовано через паравентрикулярное ядро (ПВЯ) гипоталамуса. Дофаминергические нейроны МПО стимулируют секрецию окситоцина клетками ПВЯ [7,8,9-11]. Низкая концентрация Д2-агонистов в ПВЯ вызывала эрекцию, высокая препятствовала ей и облегчала эмиссию спермы. Д1-агонисты имели меньшее значение [12]. Доказано также существование окситоцинового механизма аутоактивации клеток ПВЯ [13,14].

Кроме того, в процесс вовлекаются серотонинергические и холинергические структуры головного мозга [15,16].

Центральное влияние на ядра поясничного отдела спинного мозга опосредовано дофамин- [17,18], окситоцин- [19], серотонин- [20] ГАМК-эргическими волокнами [21,22].

Половое поведение основано на системе взаимоотношений нейрогуморальной регуляции и половых органов. Сексуальный стимул нарушает ее равновесие, передавая ей некоторый «квант энергии». Последний, многократно умножаясь, в процессе работы системы вначале обеспечивает развитие эрекции, в дальнейшем, достигнув порога выполнения функции (эякуляция), стимулирует процессы, направленные на его погашение (развитие детумесценции). Значение каждого медиатора определяется рецепторным аппаратом воспринимающей клетки. Так, один и тот же медиатор может вызвать различные эффекты. Но последовательная смена противоположных состояний обеспечивает нормальное функционирование половой системы.

На всех уровнях ЦНС присутствуют как про-, так и антиэректильные рецепторы серотонина [23]. Так, возбуждение серотониновых рецепторов 1C типа вызывает эрекцию, а рецепторов 1А и 2-го типа ее угнетает и способствует эякуляции [24]. Аналогичные взаимоотношения существуют между a1- и а2-адренорецепторами [25], m- и к-рецепторами опиоидов [26,27]. Так, возбуждение a1- и к-рецепторов стимулирует половое поведение, тогда как активация а2- и m-рецепторов имеет противоположное действие. Интересно не столько их значение в отдельности, сколько взаимоотношение норадренергической и опиатной систем. Комбинация налоксона (антагониста морфина) с йохимбином (a2-адреноблокатором) вызвала полную эрекцию. В то время как введенные по одиночке они не имели никакого влияния на здоровых добровольцев [28] и на мужчин с импотенцией [29]. Опиоиды (через т-рецепторы) угнетают центральные NO-опосредованные механизмы эрекции [30], в том числе эффект дофамина, окситоцина [31], возбуждающих аминокислот [32]. Эндогенный антагонист опиатов адренокортикотропин способствовал развитию эрекции, кроме того, есть данные, что он опосредует проэректильный эффект окситоцина [33] и дофамина [34].

Антиэректильные процессы координируются медиаторами ГАМК и пролактином. Высокие концентрации ГАМК были обнаружены в МПО у самцов крыс [35], ГАМК-эргические волокна и рецепторы к ней найдены в парасимпатических и сакральных моторных ядрах спинного мозга [36,37]. Возбуждение обоих типов (А и В) рецепторов ГАМК демонстрирует прямой угнетающий эффект на сакральные преганглионарные нейроны, что позволяет рассматривать ее как ингибиторный модулятор автономных и соматических механизмов эрекции [38].

О значении пролактина говорит тот факт, что у мужчин с гиперпролактинемией снижена потенция и либидо [39]. Его эффекты связаны как с ингибицией дофаминергической активности МПО [40], так и антигонадотропным действием пролактина [41].

Далее рассмотрены периферические механизмы эрекции, под которыми мы понимаем процессы, связанные непосредственно с ее развитием и происходящие вне ЦНС. Последние принято подразделять в зависимости от типа их медиаторов на адренергические, холинергические и неадренергические нехолинергические (NANC – nonadrenergic noncholinergic). Именно с их помощью выполняется программа, созданная центральной нервной системой.

Адренергические механизмы регуляции эрекции

Как было сказано выше, симпатическая система контролирует состояние покоя и процесс детумесценции. Экспериментально показано, что число а-адренорецепторов на порядок превышает количество В-адренорецепторов [42] и в 15 раз – количество холинорецепторов гладкомышечных клеток (ГМК) [43]. Считается, что сокращение ГМК кавернозных артерий опосредовано преимущественно а2-рецепторами, в то время как в трабекулярной ГМК преобладают a1-рецепторы [44,45]. Для обеспечения эрекции необходима релаксация обеих структур.-адренорецепторами [46]. И хотя преобладают а-адренорецепторы, имеются сообщения о достаточной эффективности тербуталина (В-адреноблокатор в лечении персистирующей эрекции в случае приапизма) [47].

Холинергические механизмы регуляции эрекции

Известно, что холинергическая стимуляция направлена на развитие эрекции [48,49]. Наибольшее значение придается модулирующему влиянию парасимпатической системы [50]. В связи с этим предполагаются три возможных механизма ее действия:

1) выброс норадреналина (NE – norepinephrine) может быть нарушен возбуждением мускариновых рецепторов на адренергических нервных терминалах;

2) эффект NE блокируется действием NО, выпущенного эндотелием или NANC, при возбуждении последних через мускариновые рецепторы;

3) эффекту NE противодействуют релаксирующие факторы холинергических нервов (NO, VIP-Vasoactive intestinal polypepride) [51].

Нехолинергические неадренергические механизмы

В последнее время стало известно, что нервная регуляция эрекции не сводится к классическому взаимодействию симпатической и парасимпатической систем. Из тканей полового члена выделена группа веществ, которые не относятся к известным медиаторам – ни к адренергическим, ни к холинергическим [52]. В связи с этим возникло понятие NANC-системы.

Ведущая роль среди медиаторов эрекции отводится оксиду азота. Источником NО являются эндотелий и нервные окончания NANC. Механизм дилатирующего влияния NО на гладкомышечные клетки связан с активацией гуанилатциклазы и образованием циклического гуанозинмонофосфата (см. ниже). Кроме того, считается, что NО непосредственно влияет на сократительный аппарат ГМК, а также модулирует его чувствительность к Са++ [53].

Синтез NО производится NO-синтетазами (NOS – NO synthase), влияющими на аминокислоту аргинин с использованием молекулярного кислорода. В результате образуется аминокислота цитрулин и N0 [54, 55, 56]. Различают NO-синтетазу эндотелия (eNOS) и нервной ткани (nNOS). Их активность зависит от парциального давления молекулярного кислорода (рО2). В процессе эрекции рО2 повышается с уровня, соответствующего венозной крови (35 мм.рт.ст.), до 100 мм.рт.ст. (то есть происходит артериализация крови) [57]. В спокойном состоянии (при низком рO2) синтез NO резко угнетен, что блокирует релаксацию ГМК Высокий уровень рО2 восстанавливает активность NO-синтетаз.

Однако известны трансгенные линии мышей, у которых отсутствуют eNOS и nNOS, тем не менее, они способны к размножению [58]. Последнее объясняется сложной адаптацией рода. В данном случае необходимо обратить внимание на то, что генетический дефицит NО проявляется еще внутриутробно, а при эректильных дисфункциях имеются постнатальные повреждения.

Следующей составляющей NANC-медиаторов являются нейропептиды. Направленность их действия связана как с развитием эрекции, так и с обратным процессом. Рассмотрим их значение и основные свойства.

Семейство эндотелинов (ЕТ) состоит из вазоконстрикторных пептидов, наиболее активный из которых – эндотелин-1 [59]. ЕТ наряду с норадреналином считается основным медиатором процесса детумесценции. ЕТ синтезируется эндотелием и, в меньшей степени, ГМК пещеристых тел [60,61]. Сокращения ГМК кавернозных тел и одноименных артерий под действием ЕТ происходят после эякуляции, вследствие чего эрекция прекращается. Внутриклеточные эффекты ЕТ опосредованы двумя типами рецепторов ЕТ-А и ЕТ-В, связанными с инозитол 3-фосфатным каскадом (см. ниже). Кроме того, ЕТ потенцирует эффекты катехоламинов (например, NE) [62,63]. Выделяют также ЕТ-С рецепторы, активация которых приводит к секреции NO [64].

В кавернозной ткани синтезируется другой известный пептид – ангиотензин II [65]. Интерес к нему связан с его вазоконстрикторной активностью [66]. Возбуждая АТ1-рецептор на мембране ГМК, ангиотензин II стимулировал детумесценцию в эксперименте [67]. Кроме того, его селективный ингибитор (лазартан) вызывал эрекцию полового члена [68].

Вазоактивный интестинальный пептид (VIP) привлек внимание многих исследователей как возможный медиатор эрекции. Имеется множество работ, обнаруживших его в сосудистых и нервных структурах полового члена [69,70,71]. Было даже обнаружено количественное преобладание нервных волокон, содержащих VIP, над адренергическими волокнами [72]. Сообщается об одновременном обнаружении VIP и nNO-синтетазы в тканях corpus cavernosum [73,74,75,76], а также VIP и ацетилхолина в парасимпатических волокнах [77,78,79]. На полосках человеческого corpus cavernosum [80], на препаратах огибающих вен, сокращенных под действием NE [81], а также на препарате глубокой дорзальной вены, сокращенной PGF2oc [82], и препарате кавернозной артерии [83] VIP обнаружил релаксирующий эффект. Воздействие VIP на ГМК преимущественно опосредовано через аденилатциклазный механизм [84,85]. VIP в комбинации с фентоламином потенцировал эффект последнего [86,87]. Однако работы других авторов [88,89] свидетельствуют о вспомогательной роли VIP как NANC-медиатора.

Кальцитонин – мощный вазодилататор кавернозных сосудов человека [90] – был обнаружен в различных структурах полового члена [91] и при внутрикавернозном введении вызывал достаточный эректильный ответ.

Предполагается, что в детумесценции участвует нейропептид Y (NPY) [92]. Нервы, содержащие NPY, были обнаружены в тканях полового члена человека. Наибольшее их количество наблюдалось в адвентиции артериальных и венозных сосудов, а также среди кавернозной ГМК [93]. Однако сообщения о сократительном эффекте NPY противоречивы. Kirkeby et al. [94] находят контракцию на полосках пенильных вен и кавернозных тел, a Yajima et al. [95] не обнаружили эффектов NPY.

В человеческой кавернозной ткани был обнаружен вазопрессин в концентрации, которая в 10 раз превышает его уровень в плазме крови. Его эффекты состоят в контракционном влиянии на ГМК. Однако антагонисты вазопрессина не препятствовали электрически вызванным сокращениям corpus cavernosum [96].

Изучается также значение обнаруженных в структурах полового члена и субстанции Р и соматостатина.

Широкое использование простагландина PGEi для лечения эректильной дисфункции стало возможным благодаря изучению физиологической роли эйказаноидов в механизме эрекции. В человеческом corpus cavernosum обнаружены различные эйказаноиды и содержится инактивирующий их фермент [97]. Их синтез угнетается гипоксией тканей полового члена [98,99]. Простагландин Е обладает релаксирующим эффектом [100], а также препятствует выбросу NE из адренергических окончаний. Его внутриклеточным посредником выступает аденилатциклазная система. PGD имеет противоположный модулирующий эффект на адренергические волокна [101], a PGF и тромбоксан ТхА.2 являются констрикторами ГМК [102].

Среди известных биологически активных веществ обращают на себя внимание гистамин и серотонин. Тучные клетки, которые синтезируют гистамин, были обнаружены в кавернозной ткани человека [103]. Возможен также его синтез эндотелием [104]. Посредством Hi-рецепторов гистамин вызывает контракцию ГМК, а через Н2-рецепторы – релаксацию [105]. Кроме того, гистамин, возможно, стимулирует выброс NО [106] эндотелием и способен препятствовать выбросу NE [107]. Обладая этими свойствами, гистамин вызывал эрекцию у волонтеров [108,109]. Серотонин вызвал дозозависимое сокращение миоцитов члена быка [110], а также препятствовал увеличению внутрикавернозного давления, вызываемого раздражением центров спинного мозга [111].

АТФ и аденозин являются важными медиаторами NANC-системы в кавернозной ткани. Их механизм действия не зависит от эндотелия [112, 113]. АТФ [114] и аденозин [115] вызывали у собак повышение внутрикавернозного давления и эрекцию при интракавернозном введении.

Итак, система регуляции обеспечивает согласование всех фаз эрекции. Факторы, направленные на релаксацию гладкомышечных структур полового члена, вызывают повышение внутрикавернозного давления и эрекцию. Контрактильные вещества, наоборот, обеспечивают детумесценцию и поддержание состояния покоя. Мишенью их действия выступают гладкомышечные структуры полового члена, которые функционируют как единый синцитий. Особые межклеточные контакты (нексусы) обеспечивают межклеточный обмен ионов и вторичных мессенджеров, чем регулируют состояние сократительного аппарата соседних клеток. В связи с этим нексусы интенсивно изучаются в последнее время, и особенно для лечения эректильной дисфункции в рамках генной терапии [118,119,120].

Возможность вмешательства с лечебной целью во внутриклеточные структуры возникла в процессе детального изучения работы ГМК. Что касается механизма эрекции, то наряду с общими моментами ее функционирования имеют значение особенности тканей полового члена.

Ниже изложены современные представления о внутриклеточных механизмах эрекции.

Фосфорилирование миозина и тонус ГМК

Как и в поперечно-полосатой мышце, содержание внутриклеточного свободного кальция является ключом к регуляции тонуса гладкой мускулатуры. В спокойном состоянии уровень саркоплазматического кальция составляет 120-270 ммоль/л, тогда как во внеклеточной жидкости его концентрация колеблется в пределах 1,5-2 ммоль/л. Этот градиент поддерживается мембранным Са++ насосом и Na+/Ca++ переносчиком. Нервная и гуморальная стимуляция способна открывать Са++ каналы, вследствие чего Са++ поступит в саркоплазму, что снизит его градиент. Повышение уровня саркоплазматического кальция (с 2-3 до 550-700 ммоль/л) запускает фосфорилирование миозина и последующее гладкомышечное сокращение. В противоположность поперечно-полосатой мускулатуре, где Са++ связывается белком, ассоциированным с тонкими филаментами (тропонином), в гладкомышечной ткани он связывается с кальмодулином. Этот Са++ кальмодулиновый комплекс активирует киназу светлых цепей миозина (MLCK – myosin light-chain kinase), соединяясь с каталитической субединицей фермента.

Активированная MLCK катализирует фосфорилирование регуляторной светлой цепи субъединицы миозина (MLC – light-chain subunits of myosin). Фосфорилированная MLC активизирует АТФазу, запускающую обращение головок миозина (поперечные мостики) вдоль актиновых филаментов, вызывая сокращение гладкомышечной клетки.

Падение уровня Са++ вызывает диссоциацию комплекса Са»1″»1″ – кальмодулин – MLCK, в результате чего происходит дефосфорилирование MLC посредством фосфатазы светлых цепей миозина (MLCP – myosin light-chain phosphatase) и расслабление клетки [121,122,123,124,125].

Кальций-независимая регуляция тонуса ГМК

Последние эксперименты показали, что в гладкой мышце отношение силы сокращения к концентрации свободного саркоплазматического Са++ является изменчивым и зависит от специфических механизмов активации. Например, а-адреномиметики демонстрируют C2++ сенсибилизирущий эффект. Показано, что при постоянной Са++ может наблюдаться изменение силы сокращения. Са++ сенсибилизирущие агонисты были опосредованы гуанозинтрифосфат(ТТФ)-связывающим протеином, который активирует протеинкиназу С или арахидоновую кислоту как вторичные месседжеры [126,127,128]. Последние ингибируют фосфатазу светлых цепей миозина, тем самым увеличивая концентрацию фосфорилированных MLC. Таким образом, фосфорилирование миозина и последующее мышечное сокращение происходит без изменения Са++.

Са++ десенситизация происходит in vivo в присутствии Са++ в концентрации, превышающей необходимую для активизации MLCK-азы. При этом активируется Са++ кальмодулинзависимая протеинкиназа II, которая в свою очередь препятствует связи MLCK с Са++ кальмодулиновым комплексом [129,130].

В результате инактивация MLCK-азы приводит к преобладанию дефосфорилирования миозина MLCP-азой и последующему расслаблению гладкой мышцы.

Кроме того, MLCP-аза активируется непосредственно и оксидом азота [131].

Электромеханическое сопряжение в регуляции тонуса ГМК

Трансформация энергии электрического импульса в механическое сокращение ГМК рассматривается как понятие электромеханического сопряжения. При этом изменение Са++ обусловлено изменением мембранного потенциала. Потенциал действия или длительное и постепенное изменение мембранного потенциала относительно внеклеточного пространства открывает потенциал зависимые Са++ каналы L-типа [152,153]. В результате Са++ входит в саркоплазму согласно градиенту концентрации. Изменение мембранного потенциала может также влиять на другие мембранные каналы. Так, В-адренергетические средства или натрийуретический фактор активизируют К+ каналы посредством внутриклеточных циклических мононуклеотидов. Последние активируют протеинкиназы G и А, которые фосфорилируют К+ каналы, с последующей гиперполяризацией клеточной мембраны. Гиперполяризация инактивирует Са++ каналы L-типа, что ведет к снижению входа Ca++ и последующему расслаблению гладкой мускулатуры [134,135,136].

Фармакомеханическое сопряжение в регуляции тонуса ГМК

Фармакомеханическое сопряжение описывает регуляцию концентрации саркоплазматического Са++ без изменения мембранного потенциала. Главным механизмом в данном случае является освобождение инозитол 1,4,5-трифосфата (IP3 – inositol triphos-phatc) и регуляция кальциевой чувствительности (см. выше). Кроме того, специфические средства могут активировать Са++ каналы L-типа при постоянном мембранном потенциале, а также неспецифические ионные каналы. В результате повышается концентрация свободного внутриклеточного Са++ и происходит сокращение. Многие агонисты (а-адреномиметики, ацетилхолин, ангиотензин, вазопрессин) связываются со специфическими мембранными рецепторами, которые сопряжены через G-протеин с фосфолипазой С. Последняя гидролизирует фосфотидинозитол 4,5-дифосфат в 1,2-диацилглицерол и IP3. Водорастворимый IP3 связывается со своим специфическим рецептором [137] на мембране саркоплазматического ретикулума (внутриклеточное депо Са). Так как концентрация Са++ ретикулума составляет около 1 ммоль/л, то Са++ входит в саркоплазму согласно градиенту концентрации и запускает сокращение. Это повышение Са++ активирует особые кальций-зависимые Са++ каналы, что дополнительно облегчает вход в саркоплазму Са++ [138].

Фармакомеханическое расслабление опосредуется внутриклеточными циклическими нуклеотидами и системой протеинкиназ. NО действует через цитозольную гуанилатциклазу, тогда как предсердный натрийуретический фактор (ANF) активирует мембранную ее форму. Гуанилатциклаза генерирует цГМФ, который активирует протеинкиназу G (PKG) и, в меньшей степени, протеинкиназу А (РКА). Этот механизм имеет приоритетное значение, кроме того, описаны дополнительные пути. Через специфический рецептор VIP [139], PGE1 и В-адреномиметики активируют мембранную аденилатциклазу, которая генерирует цАМФ. Последний активирует РКА и, в меньшей степени, PKG. Те, в свою очередь, фосфолируют белок-ингибитор Са-помпы на мембране саркоплазматического ретикулума. В результате помпа освобождается от действия ингибитора и уровень Са»1″1″ уменьшается. Через специфический рецептор, тогда как предсердный натрийуретический фактор (ANF) активирует мембранную ее форму, гуанилатциклаза освобождается от действия ингибитора и уровень Са++ уменьшается, происходит расслабление [140,141,142].

Одновременно протеинкиназы имеют еще несколько эффектов. Они активируют цитолемную Са++ помпу, снижающую концентрацию внутриклеточного Са++. Угнетают активность фосфолипазы С, катализирующей образование инозитол-трифосфата, чем препятствуют освобождению Са++ из саркоплазматического ретикулума [143].

Фосфодиэстеразы

Внутриклеточные посредники регуляции тонуса ГМК – цАМФ и цАМФ – инактивируются фосфодиэстеразами (PDE – phosphodiesterases) в процессе гидролиза. Эта важная роль в регуляции гладкомышечного тонуса и специфичность для отдельных видов и тканей сделали фосфодиэстеразы привлекательной мишенью для фармакологического вмешательства. Выделены пять семейств фосфодиэстераз гладких клеток [144]: Са++ каль-модулинстимулируемая (PDE-1), цГМФ-стимулируемая (PDE-2), цГМФ-ингибируемая (PDE-3), цАМФ-специфическая (PDE-4), цАМФ-специфическая (PDE-5). В кавернозной ткани функционируют PDE -2, -3, -4, -5 [145]. Наиболее важными называют PDE-3 и PDE-5 [146,147]. В клинике широко используется Sildenafil («Viagra») ингибитор фосфодиэстеразы-5, кроме того, уже синтезированы новые средства, например IC351 [148].

Выводы

В статье рассмотрены механизмы эрекции и регуляторный контроль за ними. Эротические стимулы посредством коры головного мозга создают в базальных ганглиях процессы проэректильной направленности. Программа, созданная центральной нервной системой, реализуется благодаря периферическим механизмам эрекции. Основным из них является расслабление гладкомышечных элементов пещеристых тел и кавернозных артерий. Ключом к возникновению последней является концентрация свободного саркоплазматического кальция. Медиаторы эрекции действуют через ее снижение, а их антагонисты, напротив, вызывают повышение последней. Основным проэректильным медиатором является оксид азота (NО), эффект которого опосредован системой гуанилатциклаза – цГМФ. Вазоактивный интестинальный пептид и простагландин Е1 играют дополнительную роль посредством аденилатциклазной системы. Среди их антагонистов необходимо назвать эндотелин, вазопрессин, кальцитонин и нейропептид Y. В развитии детумесценции принимают участие также фосфодиэстеразы – ферменты, разрушающие циклические мононуклеотиды (цГМФ и цАМФ). Наибольшее значение в гладкомышечных структурах полового члена имеет фосфодиэстераза-5. Интерес представляют механизмы регуляции кальциевой чувствительности, а также функционирование особых межклеточных контактов – нексусов. Фазные изменения в деятельности системы регуляции и соответственные колебания гладкомышечного тонуса обеспечивают согласованное течение эрекции.

Надеемся, что понимание механизмов эрекции обеспечит новые успехи и перспективы в лечении эректильной дисфункции.

Гормональный секрет трудного возраста

Период полового взросления это время хаоса, когда бешеным темпом меняются внешность, эмоциональное проявления и «внутренняя» химия организма. Так что нечего удивляться, что именно на этот период развития приходится высокая тревожность, которая приводит к столь распространенным подростковым страхам, вызывающим панические реакции и склонность к суициду.

В настоящее время исследователи из Медицинского центра при Нью-йоркском университете обнаружили тот переключатель, который превращает малоподвижного ребенка в эмоционального подростка. Ученые опубликовали в Nature Neuroscience сообщение о том, что открытый ими аллопрегнанолон (allopregnanolone, или THP) помогает снижать активность нейронов у взрослых и детей, связывая рецепторы, функция которых усиливать мозговую активность. У подростков это соединение оказывает противоположное действие.

«Половое созревание это время, когда происходит коренная перестройка гормональной системы, – говорит Шерил Смит, старший исследователь. – Когда наступает половая зрелость, стероид THP начинает оказывать на организм противоположное действие».

Стероидный гормон THP организм сам создает из прогестерона, женского полового гормона. Обычно он выбрасывается в головной мозг в ответ на стресс в течении 30 минут, чтобы успокоить организм. THP связывает так называемые ГАМК-рецепторы на поверхности нейронов. Смит замечает, что ГАМК является основным ингибитором активности мозга и что любое «седативное средство, такое как транквилизатор или алкоголь, воздействует на ГАМК-рецепторы».

Чтобы выяснить, почему гормональная система подростка сходит с ума, исследователи изучили область CA1 гиппокампа, своеобразного центра контроля эмоций. Оказалось, что эта область мозга отвечает и за контроль тревожности. Ученые искали специфические типы ГАМК-рецепторов под названием alpha4-beta2-delta, особенно чувствительные к стероидам.

Для экспериментов была выбрана именно самка мыши, поскольку исследователи полагают, что в период созревания девушки в два раза более подвержены депрессиям и расстройствам. Изначально целью экспериментов было определить количество ГАМК-рецепторов в области CA1 у взрослых и молодых животных.

Исследователи показали, что у молодого животного количество рецепторов alpha4-beta2-delta в три раза выше и эти рецепторы распределены на дендритах нейронов – окончаниях, с помощью которых нейроны передают сообщения другим нервным клеткам. «До наступления половой зрелости этих рецепторов в области CA1 практически нет», – комментирует Смит.

Чтобы определить, действительно ли эти особые рецепторы связаны с изменением поведения, исследователи подвергали стрессу совсем маленьких, подрастающих и взрослых мышей, закрывая их в пластиковую трубку на 45 минут. Затем им давали 20 минут отдыха и помещали в лабиринт – новое испытание. Для совсем маленьких и взрослых мышей 20 минут было достаточно, чтобы успокоиться, а вот для подрастающих – нет.

Позже уже в пробирке исследователи установили, что рецепторы alpha4-beta2-delta в области CA1 иначе чем ГАМК-рецепторы реагируют на медиатор, поглощая хлоридные ионы, а не отталкивая их. «В норме THP расширяет способность ГАМК-рецепторов тормозить активность клеток мозга». Смит утверждают, что «им известно, что человеческий alpha4-beta2-delta рецептор также способен контролировать активность нейрона во время полового созревания. Это закладывает биологическую основу для изменений в реакции на стресс».

Дж. Р. Минкел

Источник: В мире науки

рецептор — это… Что такое ГАМК-рецептор?

ГАМК-рецептор

ГАМК-рецепторы — группа клеточных рецепторов гамма-аминомасляной кислоты, основного тормозного медиатора в нервной системе позвоночных. Различают три класса ГАМК-рецепторов: ионотропные ГАМКA и ГАМКC, и метаботропные ГАМКB.

ГАМКА и ГАМКС принадлежат к cys-loop суперсемейству, включающему также рецепторы никотина, глицина и серотониновый 5-HT3 рецептор.

Ссылки

Категория:
  • Рецепторы гамма-аминомасляной кислоты

Wikimedia Foundation. 2010.

  • ГАИС (футбольный клуб)
  • ГАК (футбольный клуб)

Смотреть что такое «ГАМК-рецептор» в других словарях:

  • ГАМК рецептор — …   Википедия

  • Рецептор ГАМК-B — Образование гетеродимера из субъединиц ГАМКB1 и ГАМК …   Википедия

  • Рецептор ГАМК-C — Правильный заголовок этой статьи  ГАМКC рецептор. Он показан некорректно из за технических ограничений. Эту статью следует викифицировать …   Википедия

  • Рецептор ГАМК-A — Схематичное изображение: слева одна субъединица ГАМК А рецептора, справа пять субъединиц, симметрично окружающих канал, по которому в клетку поступает анион хлора. ГАМКА …   Википедия

  • Рецептор серотонина — Серотонин. Серотониновые рецепторы (5 HT рецепторы) мембранные рецепторы 5 гидрокситриптамина (5 HT), нейромедиатора и гормона, известного под названием серотонин, взаимодействующие также с множеством медицинских препаратов и психоактивных… …   Википедия

  • ГАМКВ-рецептор — Образование гетеродимера из субъединиц ГАМКB1 и ГАМКB2 ГАМКB рецептор (GABABR) метаботропный трансмембранный ГАМК рецептор, воздействующий через G белки на калиевые каналы клетки. Рецептор был открыт в 1981 году благодаря детальному… …   Википедия

  • ГАМКB-рецептор — Образование гетеродимера из субъединиц ГАМКB1 и ГАМКB2 ГАМКB рецептор (GABABR) метаботропный трансмембранный ГАМК рецептор, воздействующий через G белки на калиевые каналы клетки. Структурно GABABR входит в одно су …   Википедия

  • ГАМКС-рецептор — Правильный заголовок этой статьи  ГАМКC рецептор. Он показан некорректно из за технических ограничений. ГАМКC рецептор ионотропный рецептор γ аминомасляной кислоты, связанный с хлоридным каналом. При активации рецептора молекулами ГАМК… …   Википедия

  • Рецепторы ГАМК — Рецепторы ГАМК  группа клеточных рецепторов, эндогенным агонистом которых является γ аминомасляная кислота (ГАМК), основной тормозной медиатор в нервной системе позвоночных. Обычно выделяют три класса рецепторов ГАМК: ионотропные ГАМКA и… …   Википедия

  • Клеточный рецептор — У этого термина существуют и другие значения, см. Рецептор (значения). Клеточный рецептор  молекула (обычно белок или гликопротеид) на поверхности клетки, клеточных органелл или растворенная в цитоплазме. Специфично реагирует изменением… …   Википедия

Гамма-интерферон, медиатор летальных индуцированных липополисахаридами шоковых реакций типа Шварцмана у мышей

J Exp Med. 1 июня 1990 г .; 171 (6): 1853–1869.

Эта статья распространяется на условиях лицензии Attribution-Noncommercial-Share Alike-No Mirror Sites в течение первых шести месяцев после даты публикации (см. http://www.rupress.org/terms). Через шесть месяцев он доступен по лицензии Creative Commons (лицензия Attribution–Noncommercial–Share Alike 4.0 Unported, как описано на http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/).Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.

Abstract

Участие цитокинов в патогенезе генерализованной летальной воспалительной реакции по типу Шварцмана на бактериальные липополисахариды (ЛПС) изучали путем тестирования способности цитокинов или нейтрализующих антицитокиновых антител модифицировать течение синдрома. Реакция была вызвана у мышей NMRI без SPF двумя последовательными инъекциями LPS S. marcescens: первая инъекция в подушечку лапы, а затем через 24 часа внутривенная доза; размер и путь введения подготовительной дозы ЛПС оказались критическими.Обнаружено, что лечение мАТ против IFN-gamma полностью предотвращает реакцию. С другой стороны, обработка IFN-gamma сделала мышей более чувствительными к возникновению реакции. Напротив, системное введение IFN-альфа/бета оказывало десенсибилизирующее действие. Роль эндогенных цитокинов в патогенезе этой генерализованной реакции Шварцмана также была подтверждена исследованием уровней цитокинов в сыворотке мышей. При сравнении мышей, получавших летальные и нелетальные схемы индукции, была обнаружена хорошая корреляция между показателями смертности и высотой уровней IFN или TNF, но не было обнаружено никакой корреляции с уровнями IL-6.Кроме того, у мышей, которые были защищены антителом против IFN-гамма, сывороточные IFN и TNF не определялись, тогда как уровни IL-6 были такими же высокими, как и у незащищенных мышей. Эти данные свидетельствуют о том, что среди цитокинов, регулирующих воспалительный ответ на ЛПС, эндогенный ИФН-гамма занимает ключевое положение. Таким образом, эти данные открывают перспективы для клинического применения антагонистов IFN-gamma.

Полный текст

Полный текст этой статьи доступен в формате PDF (1.0M).

Избранные ссылки

Эти ссылки находятся в PubMed.Возможно, это не полный список литературы из этой статьи.

  • ТОМАС Л., ХОРОШИЙ РА. Исследования обобщенной реакции Шварцмана: I. Общие наблюдения относительно явления. J Эксперт Мед. 1952 г., декабрь; 96 (6): 605–624. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Billiau A, Heremans H, Vandekerckhove F, Dillen C. Антитела против интерферона-гамма защищают мышей от генерализованной реакции Шварцмана. Евр Дж Иммунол. 1987 декабрь; 17 (12): 1851–1854. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hesse DG, Tracey KJ, Fong Y, Manogue KR, Palladino MA, Jr, Cerami A, Shires GT, Lowry SF.Появление цитокинов при эндотоксемии человека и бактериемии приматов. Хирургический гинекологический акушер. 1988 г., февраль; 166 (2): 147–153. [PubMed] [Google Scholar]
  • Michie HR, Manogue KR, Spriggs DR, Revhaug A, O’Dwyer S, Dinarello CA, Cerami A, Wolff SM, Wilmore DW. Обнаружение циркулирующего фактора некроза опухоли после введения эндотоксина. N Engl J Med. 1988 г., 9 июня; 318 (23): 1481–1486. [PubMed] [Google Scholar]
  • Beutler BA, Milsark IW, Cerami A. Кахектин/фактор некроза опухоли: производство, распределение и метаболическая судьба in vivo.Дж Иммунол. 1985 г., декабрь; 135 (6): 3972–3977. [PubMed] [Google Scholar]
  • Girardin E, Grau GE, Dayer JM, Roux-Lombard P, Lambert PH. Фактор некроза опухоли и интерлейкин-1 в сыворотке крови детей с тяжелой инфекционной пурпурой. N Engl J Med. 1988 г., 18 августа; 319 (7): 397–400. [PubMed] [Google Scholar]
  • Waage A, Halstensen A, Espevik T. Связь между фактором некроза опухоли в сыворотке и летальным исходом у пациентов с менингококковой инфекцией. Ланцет. 1987 г., 14 февраля; 1 (8529): 355–357. [PubMed] [Google Scholar]
  • Waage A, Brandtzaeg P, Halstensen A, Kierulf P, Espevik T.Сложная картина цитокинов в сыворотке крови больных менингококковым септическим шоком. Связь между интерлейкином 6, интерлейкином 1 и летальным исходом. J Эксперт Мед. 1989 г., 1 января; 169 (1): 333–338. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Beutler B, Milsark IW, Cerami AC. Пассивная иммунизация против кахектина/фактора некроза опухоли защищает мышей от летального действия эндотоксина. Наука. 1985 г., 30 августа; 229 (4716): 869–871. [PubMed] [Google Scholar]
  • Tracey KJ, Beutler B, Lowry SF, Merryweather J, Wolpe S, Milsark IW, Hariri RJ, Fahey TJ, 3rd, Zentella A, Albert JD, et al.Шок и повреждение тканей, вызванное рекомбинантным кахектином человека. Наука. 1986 г., 24 октября; 234 (4775): 470–474. [PubMed] [Google Scholar]
  • Tracey KJ, Lowry SF, Fahey TJ, 3rd, Albert JD, Fong Y, Hesse D, Beutler B, Manogue KR, Calvano S, Wei H, et al. Кахектин/фактор некроза опухоли вызывает летальный шок и реакцию гормона стресса у собак. Хирургический гинекологический акушер. 1987 г., май; 164 (5): 415–422. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ремик Д.Г., Кункель Р.Г., Ларрик Дж.В., Кункель С.Л. Острые эффекты рекомбинантного фактора некроза опухоли человека in vivo.Лаборатория Инвест. 1987 г., июнь; 56 (6): 583–590. [PubMed] [Google Scholar]
  • Kettelhut IC, Fiers W, Goldberg AL. Токсические эффекты фактора некроза опухоли in vivo и их профилактика ингибиторами циклооксигеназы. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Jun; 84 (12): 4273–4277. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Rothstein JL, Schreiber H. Синергизм между фактором некроза опухоли и бактериальными продуктами вызывает геморрагический некроз и летальный шок у нормальных мышей. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 Jan; 85(2):607–611.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Neilson IR, Neilson KA, Yunis EJ, Rowe MI. Неспособность фактора некроза опухоли вызвать гипотензивный шок в отсутствие эндотоксина. Операция. 1989 г., август; 106 (2): 439–443. [PubMed] [Google Scholar]
  • Tracey KJ, Fong Y, Hesse DG, Manogue KR, Lee AT, Kuo GC, Lowry SF, Cerami A. Моноклональные антитела против кахектина/ФНО предотвращают септический шок во время летальной бактериемии. Природа. 1987 г., 17 декабря; 330 (6149): 662–664. [PubMed] [Google Scholar]
  • Mathison JC, Wolfson E, Ulevitch RJ.Участие фактора некроза опухоли в опосредовании липополисахарид-индуцированного повреждения грамотрицательными бактериями у кроликов. Джей Клин Инвест. 1988 г., июнь; 81 (6): 1925–1937. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Waage A, Espevik T. Интерлейкин 1 потенцирует летальный эффект фактора некроза опухоли альфа/кахектина у мышей. J Эксперт Мед. 1988 г., 1 июня; 167 (6): 1987–1992. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Everaerdt B, Brouckaert P, Shaw A, Fiers W. Четыре различных вида интерлейкина-1 чувствительны к летальному действию фактора некроза опухоли.Biochem Biophys Res Commun. 1989 г., 30 августа; 163 (1): 378–385. [PubMed] [Google Scholar]
  • Nathan CF, Murray HW, Wiebe ME, Rubin BY. Идентификация интерферона-гамма как лимфокина, активирующего окислительный метаболизм макрофагов человека и антимикробную активность. J Эксперт Мед. 1983 г., 1 сентября; 158 (3): 670–689. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Schreiber RD, Pace JL, Russell SW, Altman A, Katz DH. Фактор активации макрофагов, продуцируемый Т-клеточной гибридомой: физико-химическое и биосинтетическое сходство с гамма-интерфероном.Дж Иммунол. 1983 г., август; 131 (2): 826–832. [PubMed] [Google Scholar]
  • Хереманс Х., Дийкманс Р., Собис Х., Вандекеркхове Ф., Биллиау А. Регулирование интерферонами местного воспалительного ответа на бактериальный липополисахарид. Дж Иммунол. 1987 г., 15 июня; 138 (12): 4175–4179. [PubMed] [Google Scholar]
  • Heremans H, Billiau A, Colombatti A, Hilgers J, de Somer P. Лечение интерфероном мышей NZB: ускоренное прогрессирование аутоиммунного заболевания. Заразить иммун. 1978 г., сен; 21 (3): 925–930. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Zwarthoff EC, Bosveld IJ, Vonk WP, Trapman J.Конститутивная экспрессия гена мышиного интерферона альфа в клетках хомяка и характеристика его белкового продукта. Джей Ген Вирол. 1985 г., апрель; 66 (часть 4): 685–691. [PubMed] [Google Scholar]
  • Bosveld IJ, Vonk WP, Hekman RA, van Vliet PW, de Jonge P, van Ewijk W, Trapman J. Получение и свойства моноклональных антител против мышиного интерферона-бета. Вирусология. 1982 г., 15 июля; 120 (1): 235–239. [PubMed] [Google Scholar]
  • Дийкманс Р., Волкерт Г., Ван Дамм Дж., Де Лей М., Биллио А., Де Сомер П.Молекулярное клонирование кДНК мышиного интерферона гамма (MuIFN-gamma) и ее экспрессия в гетерологичных клетках млекопитающих. J Интерферон рез. Лето 1985 г .; 5 (3): 511–520. [PubMed] [Google Scholar]
  • Bazin H, Xhurdebise LM, Burtonboy G, Lebacq AM, De Clercq L, Cormont F. Крысиные моноклональные антитела. I. Быстрая очистка супернатантов культуры in vitro. Дж Иммунол Методы. 1984 г., 10 февраля; 66 (2): 261–269. [PubMed] [Google Scholar]
  • van der Meide PH, Dubbeld M, Vijverberg K, Kos T, Schellekens H.Очистка и характеристика крысиного гамма-интерферона с использованием двух моноклональных антител. Джей Ген Вирол. 1986 г., июнь; 67 (часть 6): 1059–1071. [PubMed] [Google Scholar]
  • Van Snick J, Cayphas S, Vink A, Uyttenhove C, Coulie PG, Rubira MR, Simpson RJ. Очистка и Nh3-концевая аминокислотная последовательность лимфокина Т-клеточного происхождения с активностью фактора роста для гибридом В-клеток. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Dec; 83 (24): 9679–9683. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Billiau A, Heremans H, Vandekerckhove F, Dijkmans R, Sobis H, Meulepas E, Carton H.Усиление экспериментального аллергического энцефаломиелита у мышей антителами против IFN-gamma. Дж Иммунол. 1988 г., 1 марта; 140 (5): 1506–1510. [PubMed] [Google Scholar]
  • Галанос С., Фройденберг М.А., Мацуура М., Кумбос А. Гиперчувствительность к эндотоксину и механизмы ответа хозяина. Прог Клин Биол Рез. 1988; 272: 295–308. [PubMed] [Google Scholar]
  • Galanos C, Freudenberg MA, Reutter W. Сенсибилизация, вызванная галактозамином, к смертельным эффектам эндотоксина. Proc Natl Acad Sci U S A.1979 ноябрь; 76 (11): 5939–5943. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Fong Y, Moldawer LL, Marano M, Wei H, Tatter SB, Clarick RH, Santhanam U, Sherris D, May LT, Sehgal PB и др. Эндотоксемия вызывает увеличение циркулирующего бета-2-ИФН/ИЛ-6 у человека. Дж Иммунол. 1 апреля 1989 г .; 142 (7): 2321–2324. [PubMed] [Google Scholar]
  • Houssiau FA, Bukasa K, Sindic CJ, Van Damme J, Van Snick J. Повышенные уровни фактора роста гибридом человека 26K (интерлейкин 6) в спинномозговой жидкости пациентов с острой инфекцией центральной нервная система.Клин Эксп Иммунол. 1988 г., февраль; 71 (2): 320–323. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Natanson C, Eichenholz PW, Danner RL, Eichacker PQ, Hoffman WD, Kuo GC, Banks SM, MacVittie TJ, Parrillo JE. Эндотоксин и фактор некроза опухоли у собак имитируют сердечно-сосудистый профиль септического шока у человека. J Эксперт Мед. 1989 г., 1 марта; 169 (3): 823–832. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Bauss F, Dröge W, Männel DN. Фактор некроза опухоли опосредует эндотоксические эффекты у мышей.Заразить иммун. 1987 г., июль; 55 (7): 1622–1625. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Гейгер Т., Андус Т., Клаппрот Дж., Хирано Т., Кисимото Т., Генрих П.С. Индукция белков острой фазы крыс интерлейкином 6 in vivo. Евр Дж Иммунол. 1988 г., май; 18 (5): 717–721. [PubMed] [Google Scholar]
  • Hogan MM, Vogel SN. Продукция фактора некроза опухоли макрофагами C3H/HeJ (Lpsd), примированными к rIFN-гамма, требует присутствия белков, связанных с липидом А. Дж Иммунол. 1988 г., 15 декабря; 141 (12): 4196–4202.[PubMed] [Google Scholar]
  • Nathan CF, Murray HW, Wiebe ME, Rubin BY. Идентификация интерферона-гамма как лимфокина, активирующего окислительный метаболизм макрофагов человека и антимикробную активность. J Эксперт Мед. 1983 г., 1 сентября; 158 (3): 670–689. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Miossec P, Ziff M. Иммунный интерферон усиливает выработку интерлейкина 1 эндотелиальными клетками человека, стимулированными липополисахаридом. Дж Иммунол. 1986 г., 1 ноября; 137 (9): 2848–2852. [PubMed] [Google Scholar]
  • Cerami A, Beutler B.Роль кахектина/ФНО в развитии эндотоксического шока и кахексии. Иммунол сегодня. 1988 г., январь; 9 (1): 28–31. [PubMed] [Google Scholar]
  • Tracey KJ, Lowry SF, Cerami A. Качектин: гормон, вызывающий острый шок и хроническую кахексию. J заразить дис. 1988 г., март; 157 (3): 413–420. [PubMed] [Google Scholar]
  • Brouckaert PG, Leroux-Roels GG, Guisez Y, Tavernier J, Fiers W. Противоопухолевая активность in vivo рекомбинантного человеческого и мышиного TNF, отдельно и в комбинации с мышиным IFN-gamma, на Сингенная мышиная меланома.Инт Джей Рак. 1986 г., 15 ноября; 38 (5): 763–769. [PubMed] [Google Scholar]
  • Williamson BD, Carswell EA, Rubin BY, Prendergast JS, Old LJ. Фактор некроза опухоли человека, продуцируемый линиями В-клеток человека: синергическое цитотоксическое взаимодействие с человеческим интерфероном. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Sep; 80 (17): 5397–5401. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Grau GE, Heremans H, Piguet PF, Pointaire P, Lambert PH, Billiau A, Vassalli P. Моноклональные антитела против гамма-интерферона могут предотвратить экспериментальную церебральную малярию и связанное с ней перепроизводство фактор некроза опухоли.Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Jul; 86 (14): 5572–5574. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Wolff SM, Bennett JV. От редакции: Бактериемия грамотрицательных палочек. N Engl J Med. 1974 г., 3 октября; 291 (14): 733–734. [PubMed] [Google Scholar]

Статьи из Журнала экспериментальной медицины предоставлены здесь с разрешения The Rockefeller University Press


Мыши /NL-GF

Антитела и реагенты

Используемые первичные и вторичные антитела перечислены в таблице 1.ЖМ были приобретены у Cayman Chemicals (США).

Таблица 1 Первичные и вторичные антитела и реагенты.

Животные

Мыши C57BL/6 J дикого типа (WT) были приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, Мэн, США). Мыши App NL-G-F/NL-G-F 32 были разработаны в Центре исследований мозга RIKEN (Токио, Япония) и выведены в виварии Каролинского института. Мыши App NL-GF/NL-GF представляют собой модель болезни Альцгеймера, в которой последовательность Aβ в белке-предшественнике мышиного Aβ (APP) была гуманизирована путем замены 3 аминокислот и шведского, арктического и Мутации Beyreuther familial AD (FAD) были введены с использованием стратегии нокаута, что привело к высоким уровням Aβ, ассоциированного с AD 42 32 .Все эксперименты проводились на мышах-самцах, содержащихся в условиях, свободных от патогенов, в среде с контролируемой температурой, со стандартным циклом 12-часовой свет/12-часовой темноты и свободным доступом к пище и воде. Все манипуляционные и экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями по сравнительной медицине (KM-B, Каролинский институт, Швеция). Работа с животными в этом исследовании была одобрена Стокгольмским этическим комитетом для экспериментов на животных (6-14, 1433-2018, 12370–2019).

Лечение

Всего было случайным образом отобрано 45 мышей в возрасте 22–24 недель, которые поровну были разделены на три группы.За две недели до эксперимента мышей обрабатывали через день. Мышей анестезировали 2% изофлураном посредством ингаляции в пластиковой индукционной камере, чтобы вызвать бессознательное состояние на минимальное время, достаточное для завершения введения проразрешающих LM. Интраназальную доставку осуществляли, удерживая мышь в положении лежа на спине, после чего ее удерживали в том же положении еще в течение 10–15 с, чтобы обеспечить вдыхание жидкости. В общей сложности 10 мкл раствора, содержащего неэтерифицированные формы LM RvD1 (CAS No.872993-05-0), RvD2 (CAS № 810668-37-2), RvE1 (CAS № 552830-51-0), MaR1 (CAS № 1268720-28-0) и NPD1 (CAS № 660430- 03-5) в дозе 40 нг на 1 мкл (Cayman Chemicals, США) вводили в ноздри пипеткой на 10 мкл мышам App NL-GF ( App NL-GF 8 — 8 — ЛМ) ( n  = 13). Носитель (0,9% солевой раствор) вводили мышам App NL-GF ( App NL-GF -Veh) ( n  = T15) и мышам n  = 15).Двум мышам App NL-GF вводили смесь меченных дейтерием LM (RvD1-d 5 , RvD2-d 5 , RvE1-d 4 и MaR14-). Cayman Chemicals, США)) (приложение NL-GF -LM-H). Лечение длилось 9 недель при приеме 3 раза в неделю (рис. 1а). Этот протокол был основан на коротком периоде полураспада про-разрешающих LM, , например . около 5 часов в плазме для RvD1 72 .

Поведенческие тесты были проведены на всех мышах ( n  = 45). Пять (5) мышей на экспериментальную группу использовали для биохимического и иммуногистохимического анализа, 5 мышей на группу использовали для MALDI-визуализации и масс-спектрометрического анализа и 5 мышей на группу для анализа колебательной активности гамма-диапазона.

Через 7 недель лечения мышей подвергли поведенческим тестам. На 9 неделе лечения мышей анестезировали и интракардиально перфузировали физиологическим раствором, после чего органы вырезали (рис.1а). Мозг был разделен на два полушария. Левое полушарие далее разрезали на обонятельную луковицу, гиппокамп, кору головного мозга и мозжечок, замораживали в сухом льду и хранили при температуре -80 °C для анализа биохимии и жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС). Правые полушария фиксировали в 4% параформальдегиде (ПФ) в 0,1 М фосфатном буфере и хранили при +4 °С для иммуногистохимических исследований или замораживали в сухом льду и хранили при –80 °С для MALDI-визуализации.

Поведение

Открытое поле

Исследовательское и тревожное поведение анализировали с помощью теста открытого поля (ОП).Испытательная арена была изготовлена ​​из прозрачного пластика (45 см × 45 см, высота 40 см) (система Actimot, TSE Systems GmbH, Бад-Хомбург, Германия) с видеокамерой, размещенной над камерой для наблюдения за процессом выращивания, пройденным расстоянием. , и время, проведенное в центральной и периферийной зоне арены. Каждую мышь аккуратно помещали в центр арены при тусклом свете и оставляли для исследования на 20 минут. До и после каждого испытания камеру очищали 70%-ным этанолом и дистиллированной водой.

Приподнятый крестообразный лабиринт

Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) использовался для оценки различных исследовательских тенденций и тревожного поведения в открытых и закрытых ответвлениях.Лабиринт состоял из четырех ответвлений длиной 35 см и шириной 8 см, возвышавшихся над полом на 50 см. Два закрытых рукава имели стенки высотой 15 см, а два рукава были открытыми. В начале 5-минутного сеанса мышей осторожно помещали в центр лабиринта и позволяли им свободно исследовать его. С помощью программного обеспечения Ethovision XT (Noldus) регистрировали количество входов и время, проведенное в открытых и закрытых рукавах соответственно. Время нахождения в открытых и закрытых рукавах рассчитывали как процент от общего времени нахождения в рукавах без учета времени в центральной области.Между испытаниями лабиринт очищали 70% этанолом и дистиллированной водой.

Распознавание новых объектов

Тест на распознавание новых объектов (NOR) основан на спонтанной склонности к изучению нового объекта, отражающей память обучения и узнавания. Тест NOR проводился с камерой открытого поля (45 см × 45 см, высота 40 см). Задание состояло из трех этапов: привыкание, ознакомление и проверка. В фазе привыкания (день 1) мышам давали возможность свободно исследовать в течение 10 минут открытую арену в отсутствие объектов.Во время фазы ознакомления (день 2) мышей помещали на 10 минут в одну и ту же арену открытого поля, содержащую два идентичных объекта, а затем возвращали в их домашнюю клетку на 24 часа. На следующий (тестовый) день (3-й день) мышей помещали на 10 мин в арену открытого поля, содержащую два объекта, один из которых был тем же самым объектом, что и во время ознакомления (знакомый объект), а другой был новым объектом. (новый объект). Используя программное обеспечение Ethovision XT (Noldus), индекс дискриминации (DI) рассчитывали как: (время, затраченное на изучение нового объекта — время, затраченное на изучение знакомого объекта) / (время, затраченное на изучение нового объекта + время, затраченное на изучение знакомого объекта).DI варьировался от -1 до +1, представляя исследование знакомого объекта с -1, исследование нового объекта с +1 и отсутствие предпочтения объектов с 0. Объекты в этом задании были разными по форме и цвету, но похожи по внешнему виду. размер. Их прикрепляли ко дну камеры, чтобы предотвратить движение, и всю установку тщательно очищали 70% этанолом и дистиллированной водой для удаления обонятельных сигналов.

Обусловливание страха

Контекстный тест и тест обусловливания страха (FC) использовался для оценки обучения и памяти с помощью сигналов окружающей среды и аверсивных переживаний.Мышей помещали в кондиционирующую камеру (черный ящик, 20 см × 20 см) для свободного исследования в течение 2 мин, а затем подвергали 30-секундному звуковому раздражителю (55 дБ, 5000 Гц) с последующим 2-секундным ударом электрическим током ( 0,3 мА). Звук и удар повторяли 3 раза для усиления ассоциации (день 1). Через 24 часа мышей возвращали в ту же камеру кондиционирования для контекстного теста (день 2). Замирающее поведение было записано на 180 с для анализа контекстуально обусловленного страха. Между сеансами камеру очищали 70% этанолом и дистиллированной водой как в 1-й, так и во 2-й день.Еще через 24 часа был проведен тестовый тест (день 3). Это было выполнено в другой камере (круглой, прозрачной, диаметром 20 см), чтобы создать новый контекст, не связанный с камерой кондиционирования. Мышам давали возможность свободно исследовать новую камеру в течение 2 минут, а затем еще 2 минуты с непрерывным звуковым стимулом (55 дБ, 5000 Гц). После каждой мыши круглую камеру протирали хлорноватистой водой (разбавленной на 50%), чтобы создать другую среду с другим запахом. Тесты записывались с помощью камеры и инфракрасных датчиков для определения местоположения животного в трех измерениях с использованием системы мультикондиционирования (TSE Systems GmbH, Бад-Хомбург, Германия).

Электрофизиологические записи и анализ

Электрофизиологические записи были выполнены на 10 животных (4 WT-Veh, 3 App NL-GF -Veh и 3 App 8-190 Ns) 31LGM после завершения поведенческих экспериментов. Все химические соединения, используемые для внутриклеточных и внеклеточных растворов, были получены от Sigma-Aldrich Sweden AB (Стокгольм, Швеция). Каиновая кислота (КА) была получена от Tocris Bioscience (Бристоль, Великобритания).

Подготовка срезов гиппокампа

Двух животных в день глубоко анестезировали изофлураном перед умерщвлением путем декапитации. Мозг вырезали и помещали в охлажденную льдом искусственную спинномозговую жидкость (ИАСЖ), модифицированную для вскрытия, содержащую (в мМ): 80 NaCl, 24 NaHCO 3 , 25 глюкозу, 1,25 NaH 2 PO 4 , 1 аскорбиновую кислоту. , 3 Na-пируват, 2,5 KCl, 4 MgCl 2 , 0,5 CaCl 2 и 75 сахарозы. Раствор барботировали карбогеном (95% O 2 и 5% CO 2 ).Горизонтальные срезы (толщиной 350 мкм) вентрального гиппокампа обоих полушарий готовили с помощью вибратома Leica VT1200S (Leica Microsystems). Сразу после разрезания срезы переносили в камеру хранения с увлажненным интерфейсом, содержащую стандартный ACSF (в мМ): 124 NaCl, 30 NaHCO 3 , 10 глюкоза, 1,25 NaH 2 PO 4 , 3,5 KCl, 1,5 MgCl 2 и 1,5 CaCl 2 , постоянно снабжаемые увлажненным карбогеном. Камера выдерживалась при +34 °C во время нарезки, а затем ей давали остыть до комнатной температуры (RT) (~+22 °C) в течение минимум 1  часа.

Электрофизиология

Регистрацию проводили в области гиппокампа cornu Ammonis (CA) 3 микроэлектродами из боросиликатного стекла, натянутыми до сопротивления 3-7 МОм. Потенциалы локального поля (LFP) регистрировали с помощью микроэлектродов, заполненных ACSF, помещенных в пирамидальный слой CA3 . Осцилляции LFP вызывали путем нанесения 100 нМ KA на внеклеточную ванну. Записи LFP и записи пэтч-кламп выполнялись с использованием Multiclamp 700B (Molecular Devices, Калифорния, США).Для поддержания стабильных колебаний ЛФП все записи проводились при температуре +34 °С со скоростью перфузии 3–5 мл/мин аэрируемого АЦСЖ, содержащего 100 нМ КА. Колебаниям давали стабилизироваться в течение не менее 20 минут перед записью.

Запись пэтч-кламп (целая клетка) проводилась в FSN на основе их местоположения и их уникальных электрофизиологических характеристик 25 . Измерения потенциала действия (AP) и EPSC (Vh = -70 мВ) проводили с использованием внутриклеточного раствора на основе калия (в мМ): 122.5 K-глюконат, 8 KCl, 4 Na 2 -АТФ, 0,3 Na 2 -GTP, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 2 MgCl 2 , 10 Na 2 -фосфокреатин, рН 7,2-7,3 с КОН, осмолярность 270-280 мОсм. Сигналы были оцифрованы на частоте 10 кГц, обработаны с помощью шумоподавителя Hum Bug 50 Гц (Quest Scientific, Северный Ванкувер, Британская Колумбия, Канада), программно отфильтрованы с частотой 1 кГц, оцифрованы и сохранены с использованием программного обеспечения Digidata 1440 A и pCLAMP 10.4. (Molecular Devices, Калифорния, США).

Анализ данных

Графики плотности спектров мощности (из 60-секундных записей LFP) были рассчитаны в усредненных сегментах Фурье по 8192 точкам с использованием Axograph X (Kagi, Беркли, Калифорния, США).Мощность гамма-колебаний вычислялась путем интегрирования спектральной плотности мощности в диапазоне от 20 до 80 Гц. EPSC были обнаружены в автономном режиме с использованием программного обеспечения MiniAnalysis (Synaptosoft, Decatur, GA, USA). Перенос заряда, амплитуда событий и интервал между событиями анализировались с использованием Microsoft Excel (Microsoft Office) и GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, США), при этом результат представлял собой средние значения, полученные за 1-минутные периоды.

Анализ фазовой связи всплесков был выполнен на сопутствующих записях LFP и отдельных записях с использованием специально написанных подпрограмм MATLAB, чтобы связать активность всплесков FSN с текущими гамма-колебаниями 25 .Для этого записи LFP были предварительно обработаны с помощью полосового фильтра, настроенного на 20-60 Гц (RC-однополюсный) с использованием Clampfit 10.7. AP были обнаружены с использованием порога амплитуды, а мгновенная фаза гамма-колебаний была рассчитана с использованием преобразования Гильберта для определения фазового угла, при котором каждый AP возникал во время продолжающихся колебаний. Фазовые углы и гамма-фазы колебаний были представлены на полярных графиках и выражены в радианах с пиком цикла колебаний, соответствующим 0, и впадиной, соответствующей ± π на полярных графиках.Для проверки уровня синхронизации срабатывания ПД по полученному среднему вектору вычислялся фазовый угол ПД. Этот средний вектор представляет собой уровень синхронизации срабатывания AP и находится в диапазоне от 0 до 1, где 0 представляет равномерное распределение срабатывания в течение всего цикла колебаний, а 1 представляет постоянное срабатывание в определенном фазовом угле 73 . Когда все векторы были назначены, был рассчитан усредненный результирующий вектор фазовой плотности, чтобы описать предпочтительную фазу срабатывания (фазовый угол) и насколько повторяющимся было срабатывание под этим углом (длина вектора).Более длинная длина вектора означает более синхронизированное срабатывание AP. Длина вектора показана нормализованной по общему количеству точек доступа для каждого условия на ячейку. Предпочтительный фазовый угол определялся ячейка за ячейкой и рассчитывался путем усреднения фазовых углов AP, при которых срабатывала каждая ячейка для каждого условия. Чтобы проверить, активируются ли нейроны фазовым образом, все сопутствующие записи были проверены на круговую однородность с использованием теста Рэлея. Для анализа учитывались только записи со значениями p ниже 0,05.

Иммуногистохимия

Ткани, помещенные в 4% PF после рассечения (см. Лечение выше), выдерживали при +4 °C в течение ночи, а затем замачивали в 30% сахарозе на 24 ч, после чего их переносили в раствор криопротектора и хранили при – 20 °С. Ткани разрезали в коронарной плоскости на криостате Leica для получения срезов толщиной 20 мкм. Срезы собирали в 24-луночные планшеты, содержащие 0,01 М фосфатно-солевой буфер (PBS), и после трех промывок свободно плавающие срезы инкубировали в течение 20 мин с PBS, содержащим 0.3% Triton X-100 в течение 15 мин при комнатной температуре. После очередной промывки в PBS срезы блокировали в растворе, содержащем 5 % нормальной ослиной или козьей сыворотки и 0,1 % Triton X-100 в PBS, в течение 30 мин. Затем срезы инкубировали в течение ночи с первичными антителами при 4 °C. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную ослиную или козью сыворотку при отсутствии первичных антител. Срезы промывали в PBS и инкубировали со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела BLT1 и ChemR23 были проверены путем предварительной адсорбции с иммуногеном и последующим обнаружением отсутствия сигнала, а антитела GPR18 были проверены компанией (https://www.sigmaaldrich.com/SE/en/product/sigma/sab4501253). Все антитела давали полосы с соответствующей молекулярной массой, и их использовали для анализа.

Для окрашивания тиофлавином-S некоторые срезы инкубировали в растворе 1 % тиофлавина-S в течение 8 мин, а затем замачивали по 3 мин каждый в 80 % и 90 % EtOH и MiliQ с последующим нанесением на предметные стекла и обезвоживанием. .

Все предметные стекла были смонтированы с помощью заливочной среды Fluoro-Shield (Sigma). Флуоресцентные изображения получали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Leica.

Анализ изображений

Иммунореактивность ионизированного кальцийсвязывающего адапторного белка 1 (Iba1) и глиального кислого фибриллярного белка (GFAP) исследовали под микроскопом Nikon Eclipse E800 (Bergman-Labora, Стокгольм, Швеция). Изображения коры (2 поля/срез) и гиппокампа (1 поле/срез) были получены с объективом 4X в камере Nikon DS-Qi2 с программным обеспечением NIS-D 4.3 (Bergman Labora, Стокгольм, Швеция). От каждого животного анализировали 5 последовательных коронарных срезов на расстоянии 100–120 мкм друг от друга, всего было исследовано 15 полей на одно животное ( n  = 5).Площадь, занятую Iba1- или GFAP-положительными клетками, измеряли, применяя порог с помощью NIH Image J (Национальные институты здоровья США). Все изображения были получены при одинаковых условиях освещения и настройках.

Патологию Aβ визуализировали с помощью иммуногистохимии с использованием антител, выработанных против пептида Aβ (6E10). Диффузные и нейритные бляшки анализировали в области коры головного мозга и гиппокампа путем анализа составных изображений срезов, дважды окрашенных тиофлавином-S.Изображения были получены с объективом 4X в коре (2 поля/срез) и гиппокампе (1 поле/срез). Количество бляшек на площадь оценивали в 5 последовательных корональных срезах на расстоянии 100–120  мкм от каждого животного, всего 15 полей на животное ( n  = 5), используя NIH ImageJ (Национальные институты здравоохранения США) с клеткой плагин счетчика. Количество бляшек на поле нормализовали к площади поля.

Экстракция белков

Растворимые и нерастворимые белковые фракции получали из коры головного мозга и гиппокампа.Свежезамороженные образцы головного мозга механически гомогенизировали с использованием трехэтапного протокола экстракции. Ткани гомогенизировали в буфере TRIS (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,4), содержащем смеси ингибиторов протеазы и фосфатазы (Chemical Co., Стокгольм, Швеция, и Thermo Fisher Scientific, Стокгольм, Швеция, соответственно). После центрифугирования (16 000 об/мин, +4 °С, 20 мин) супернатант собирали как фракцию 1. Осадок гомогенизировали в ТРИС-буфере, содержащем 1% Тритон Х-100, и центрифугировали (16 000 об/мин, +4 °С, 20 мин).Супернатант собирали как фракцию 2. Оставшийся осадок гомогенизировали в 70% муравьиной кислоте и центрифугировали (16 000 об/мин, +4°С, 20 мин), а полученный супернатант собирали как фракцию 3.

Вестерн-блоттинг

концентрацию белка во фракциях 1 и 2 определяли с помощью анализа белка на основе бицинхониновой кислоты (BCA) (Thermo Fisher Scientific). Равные количества белка разделяли электрофорезом на 15-луночных гелях Bis-Tris NuPAGE 4–12% (Invitrogen; NP0323BOX) в течение 1 ч при 160 В и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad, США).Мембраны блокировали блокирующим буфером Odyssey (TBS) (LI-COR 927-50000). Первичные антитела (таблица 1) разбавляли соответствующим блокирующим буфером и наносили на мембраны при +4 °C в течение ночи. После промывки 0,01 М трис-буферным солевым раствором (TBS) с 0,1% Tween-20 (TBS-T) мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем промывали TBS-T. Блоты сканировали в системе инфракрасной визуализации Odyssey (Li-COR Biosciences) и анализировали путем проведения денситометрического анализа с использованием Image Studio Ver 5.2. Все полосы были нормализованы к соответствующему уровню общего белка, обнаруженному с помощью Revert Total Protein Stain (LI-COR 926-11010).

Тесты Meso Scale V-plex

Про- и противовоспалительные белки анализировали во фракциях 1 и 2 гомогенатов головного мозга с использованием 96-луночного мышиного цитокина V-PLEX 19-plex (Провоспалительная панель 1 и цитокиновая панель-1). ) (# K15255D; мезошкала, Роквилл, Мэриленд, США). Экстракт мозга каждой мыши разбавляли в два раза разбавителями и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре.После промывки 0,05% Tween-20 в 0,01 М PBS планшеты инкубировали с детектирующими антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.

Уровни Aβ 40 и Aβ 42 анализировали во фракциях 1, 2 и 3 гомогенатов коры головного мозга с использованием 96-луночного набора V-PLEX Aβ 42 пептида (4G8) (#K150SLE-1; Мезо-шкала, Роквилл, Мэриленд, США). Планшет инкубировали с рекомендованным разбавителем в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали 1X промывочным буфером MSD и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре с обнаружением антител.Данные были получены из наборов цитокинов V-PLEX Mouse 19-plex и пептидов V-PLEX Aβ 42 путем смывания раствора детектирующих антител и добавления буфера для считывания для получения сигнала электрохемилюминесценции, измеренного с помощью Meso Quickplex SQ 120 (Meso Scale, Rockville). , Мэриленд, США) и определяли количественно с помощью программного обеспечения Discovery Workbench 4.0.

Экстракция и анализ липидов

Ткани мозга гомогенизировали с CHCl 3 /MeOH (2:1) и смесью внутренних стандартов липидов, меченных дейтерием (AA-d8 (5 нг/мкл), PGD2-d4 (1 нг/мкл), EPA-d5 (1 нг/мкл), 15-HETE-d8 (1 нг/мкл) и LTB 4 -d4 (1 нг/мкл)) добавляли к каждому образцу перед обработкой ультразвуком в течение 30 мин и хранение при -80 °С в течение ночи.На следующий день образцы центрифугировали при 4200 RCF в течение 30 мин и собирали супернатанты. Осадок промывали CHCl 3 /MeOH и центрифугировали, супернатанты от обоих центрифугирований объединяли. К каждому супернатанту добавляли по два мл дистиллированной H 2 O, pH 3,5, и после встряхивания и центрифугирования pH верхней фазы доводили до 3,5-4,0 с помощью 0,1 н. HCl. Нижнюю фазу сушили под N 2 и затем ресуспендировали в 1 мл МеОН.Анализ методом жидкостной хроматографии в тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) проводили с использованием Xevo TQ UPLC (Waters, Milford, MA, USA).

Анализ фосфолипидов фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭ) и фосфатидилинозитола (ФИ) проводили в образцах, высушенных под N 2 и ресуспендированных в 20 мкл растворителя образца (CH 3 CN/CHCl 3 /МеОН). Количество каждого вида фосфолипидов рассчитывали как % от общего количества в каждом образце.

Анализ ЖК и их производных проводили в образцах, высушенных под N 2 и ресуспендированных в 1 мл МеОН. После смешивания с 9  мл H 2 O при pH 3,5 образцы загружали в колонки C18 (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США), затем элюировали метилформиатом, сушили в атмосфере N 2 , ресуспендировали в 50 мкл MeOH/H 2 O (1:1) и вводят в колонку. Стандарты липидов (Кайман, Анн-Арбор, Мичиган, США) использовались для настройки и оптимизации, а также для создания калибровочных кривых для каждого соединения.Данные ЖХ-МС/МС анализировали после повторного наблюдения времени удерживания для каждого соединения с помощью расчетного предела обнаружения, полученного из отношения сигнал/шум (S/N). Пики низкой интенсивности, присутствующие в образцах, были интегрированы с шириной, соответствующей ширине пика измеряемого соединения. Затем площадь интересующего соединения была разделена на площадь шума. Двум мышам App NL-G-F вводили смесь меченных дейтерием LM для анализа LC-MS/MS.Кору и гиппокамп каждого животного подвергали липидной экстракции. Время удерживания соединений определяли из повторных наблюдений за временем элюирования и теоретическим сдвигом при добавлении дейтерия.

Статистика и воспроизводимость

Все статистические анализы были выполнены с использованием GraphPad Prism 9. Результаты выражены в виде диаграмм разброса с медианой и в виде гистограмм как среднее  ± SEM. P  < 0,05 считалось статистически значимым. Крускала-Уоллиса и однофакторный дисперсионный анализ использовались для проверки групповых различий, с апостериорным тестом Данна или вручную с U-критерием Манна-Уитни и коррекцией Бонферрони для множественных сравнений для анализа различий между обработками.Для электрофизиологии данные были отфильтрованы от выбросов с помощью метода ROUT и отнесены к параметрическому или непараметрическому анализу статистической значимости после критерия нормальности Шапиро-Уилка. Тесты на статистическую значимость были выполнены с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки и Крускала-Уоллиса с апостериорным тестом Данна. Подписи к рисункам указывают тип статистического теста, определение значимости для различных p значений и количество биологических повторов ( n ) для каждого эксперимента.Для анализа липидов отношение соединения к внутреннему стандарту статистически оценивали с использованием однофакторного ANOVA с поправкой Гейссера-Гринхауса. Метод Тьюки применялся для коррекции множественных сравнений, определяя значимость на основе P  < 0,05. Программное обеспечение MassLynx 4.2 и TargetLynx XS использовалось для просмотра данных и интеграции пиков. Excel и GraphPad Prism 9 использовались для статистического анализа.

Нейрональный гамма-рецептор Fc I как новый медиатор для IgG imm… : Исследования нейронной регенерации

Основные результаты исследований

  1. Это исследование раскрывает новый иммунный механизм боли, заключающийся в том, что иммунный комплекс IgG непосредственно сенсибилизирует первичные сенсорные нейроны через нейрональный гамма-рецептор Fc I.
  2. Эти результаты могут предложить новые терапевтические стратегии для лечения боли, связанной с антиген-специфическими иммунными заболеваниями.

Сокращения

IgG-IC, иммунный комплекс IgG; FcγRs, Fc-гамма-рецепторы; IgG, иммуноглобулин G; DRG: спинномозговой ганглий; TRPC3, транзиторный рецепторный потенциал, канонический 3; Syk, тирозинкиназа селезенки; PLC, фосфолипаза С; IP 3 , рецептор инозитолтрифосфата

ВВЕДЕНИЕ

Боль является серьезной проблемой для здоровья, которая часто сопровождает многочисленные антиген-специфические иммунные расстройства.Эти заболевания включают аутоиммунные заболевания, такие как синдром Гийена-Барре [ 1 ] и ревматоидный артрит [ 2 ], аллергические заболевания, такие как атопический и аллергический контактный дерматит [ 3 4 ], и инфекционные заболевания, такие как опоясывающий герпес. [ 5 ]. Общим признаком этих заболеваний является повышенный уровень антигенспецифических иммуноглобулинов (Ig), особенно IgG в сыворотке крови и/или наличие иммунных комплексов IgG (ИК) в пораженной ткани. Традиционный взгляд на такую ​​боль, ориентированный на иммунные клетки, заключается в том, что IgG-IC индуцирует высвобождение провоспалительных цитокинов из иммунных клеток, что, в свою очередь, приводит к сенсибилизации первичных сенсорных нейронов [ 6 7 8 ].Более того, гамма-рецепторы Fc (FcγR), экспрессируемые на иммунных клетках, по-видимому, играют важную роль в этом процессе [910]. В дополнение к косвенному влиянию IgG-IC на первичные сенсорные нейроны неясно, вызывает ли IgG-IC непосредственно периферическую сенсибилизацию и/или каким образом.

FcγR, рецепторы, связывающиеся с доменом Fc IgG, широко экспрессируются в иммунных клетках для регуляции иммунитета. Существует два функционально различных класса FcγR: активирующие и ингибирующие рецепторы [ 9 10 ].Среди них FcγRII функционирует как ингибирующие рецепторы, тогда как остальные три типа FcγR (FcγRI, FcγRIII и FcγIV) положительно регулируют иммунный ответ. Кроме того, FcγRI является единственным высокоаффинным рецептором для IgG-IC. Эти рецепторы опосредуют различные иммунные функции, включая фагоцитоз, антителозависимую цитотоксичность, высвобождение медиаторов воспаления и цитокинов и дегрануляцию [-10]. Предыдущие исследования с использованием мышей с нокаутом FcγRI показали, что FcγRI вносит существенный вклад в определенные воспалительные и иммунные реакции [, 11, , , 12, ].Такие методы лечения, как внутривенный иммуноглобулин, которые потенциально блокируют FcγRI или снижают уровень IgG IC, оказывают благотворное влияние на болезненные симптомы при рассеянном склерозе [ 13 ], системной красной волчанке [ 14 ] и сложных регионарных синдромах [ 15 ] . Было показано, что рекомбинантный растворимый FcγRI человека ингибирует опосредованную IgG-IC продукцию воспалительных цитокинов [-16-]. В дополнение к иммунным клеткам недавние исследования показали, что FcγRI, но не FcγRII и FcγRII, также экспрессируется в подмножестве первичных сенсорных нейронов [, 17, , , 18, ].Более того, перекрестное связывание FcγRI с помощью IgG-IC непосредственно активирует первичные сенсорные нейроны. Что еще более важно, наше недавнее исследование показало, что переходный рецепторный потенциал канонического 3 (TRPC3) является новым нижестоящим каналом трансдукции, участвующим в запускаемой FcγRI передаче сигналов в первичных сенсорных нейронах [-19]. Эти результаты обеспечивают потенциальную новую терапевтическую стратегию для лечения боли при заболеваниях, связанных с иммунитетом. В этом обзоре мы обсудим характер экспрессии, функции и связанную с ними клеточную передачу сигналов FcγR в первичных сенсорных нейронах.

ХАРАКТЕР ЭКСПРЕССИИ FcγR В ПЕРВИЧСЕНСОРНЫХ НЕЙРОНАХ

FcγR обычно экспрессируются на иммунных клетках для регуляции иммунитета, включая моноциты, макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты [ 10 20 ]. Удивительно, но несколько исследований показали, что FcγR также наблюдаются в некоторых типах нейронов, включая моторные нейроны в спинном мозге [ 21 ], клетки Пуркинье в мозжечке [ 22 ] и нейронах ганглиев дорсальных корешков (DRG) [ 21 ]. 17 18 ].Andoh и Kuraishi [ 17 ] впервые предоставили прямые доказательства того, что высокоаффинный рецептор IgG FcγRI, но не низкоаффинные рецепторы FcγRII и FcγRIII, экспрессируется в культивируемых нейронах DRG поясничного отдела мыши, особенно в нейронах малого или среднего диаметра. В более позднем исследовании была обнаружена экспрессия мРНК всех типов FcγR (FcγRI, II, III и IV) в нейронах верхнего шейного ганглия мыши. Более того, уровень экспрессии мРНК FcγRI, наблюдаемый в нейронах верхнего шейного ганглия, выше, чем в тучных клетках мыши, происходящих из костного мозга [-23-].В соответствии с предыдущими исследованиями [ 17 24 ], наше недавнее исследование показало, что FcγRI, но не FcγRII и FcγRIII, также экспрессируется в подгруппе нейронов DRG крысы [ 18 25 ]. Кроме того, FcγRI присутствует как на соматах, так и на аксонах нейронов DRG, указывая на то, что IC может активировать FcγRI на соматах и/или аксонах нейронов DRG, включая нервные окончания в периферических тканях [-18]. В отличие от исследования Andoh и Kuraishi [ 17 ], в нашем недавнем исследовании [ 18 ] экспрессия FcγRI не была обнаружена в сателлитной глии.Это расхождение между двумя исследованиями, вероятно, связано с использованием разных биомаркеров в двух исследованиях. В нашем исследовании [ 18 ] глутаминсинтетаза использовалась в качестве маркера для сателлитных глиальных клеток, тогда как отсутствие общего нейронального маркера, продукта гена белка 9.5 (PGP9.5), использовалось в качестве критерия для сателлитных глиальных клеток в сателлитных глиальных клетках. исследование Андоха и Кураиши [ 17 ]. Поскольку PGP9.5 отсутствует как в глиальных клетках, так и в других ненейрональных клетках, таких как иммунные клетки, PGP9.5-отрицательные клетки, которые проявляют иммуноокрашивание для FcγRI, на самом деле могут быть иммунными клетками, такими как макрофаги.Кроме того, мы показали, что FcγRI экспрессируется на крысиных DRG-нейронах во всех категориях размера, особенно много в крупных DRG-нейронах [ 18 ], что не согласуется с результатами, наблюдаемыми в культивируемых мышиных DRG нейронах [ 17 24 ]. Важно отметить, что мы впервые предоставляем прямые доказательства того, что FcγRI коэкспрессируется с ноцицептивными нейронными маркерами изолектином B4, транзиентным рецепторным потенциалом ваниллоида 1, субстанцией P и пептидом, связанным с геном кальцитонина, в нейронах DRG, что позволяет предположить потенциальную роль FcγRI в патогенезе боли [ 18 ].

ФУНКЦИИ И ПЕРЕДАЧА КЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛОВ FcγR В ПЕРВИЧНЫХ СЕНСОРНЫХ НЕЙРОНАХ

Нейрональные FcγR играют важную роль во многих физиологических функциях [ 26 ]. В спинном мозге FcγRs участвуют в поглощении IgG окончаниями двигательных нейронов и высвобождении ацетилхолина из окончаний аксонов двигательных нейронов [-21-]. FcγR, экспрессируемые на клетках Пуркинье в мозжечке, способствуют развитию и функциональному установлению в мозжечке [-22-].В нейронах ДРГ IgG-IC увеличивает концентрацию внутриклеточного Ca 2+ ([Ca 2+ ] i )[ 17 18 ]. Кроме того, замена интактного IgG фрагментами F(ab/)2, лишенными Fc-фрагмента, или предварительная обработка антителом FcγRI предотвращает индуцированное IgG-IC увеличение [Ca 2+ ] i , что позволяет предположить, что взаимодействие между Fc-фрагментом IgG и нейрональный FcγRI необходим для IgG-IC-индуцированного кальциевого ответа [-18-].Напротив, отдельные компоненты (только антиген или антитело) IgG-IC не могут вызвать увеличение [Ca 2+ ] i , что указывает на то, что только интактный IgG-IC может иметь конформацию, способную активировать FcγRI на первичных сенсорных нейронах. [ 18 ]. Кроме того, как поступление кальция из внеклеточного пространства, так и высвобождение кальция из внутренних запасов способствуют FcγRI-индуцированному кальциевому ответу в нейронах DRG [-18]. Кроме того, в этом процессе частично участвует приток Ca 2+ через потенциалзависимые кальциевые каналы L- или N-типа [ 17 ].

В дополнение к кальциевому ответу IgG-IC увеличивает высвобождение вещества P из культивируемых нейронов DRG через нейрональный FcγRI, что предполагает потенциальную роль нейронального FcγRI в ощущении боли [ 17 ]. Наше недавнее исследование предоставляет новые доказательства роли нейронального FcγRI в возбудимости нейронов DRG [ 18 25 ]. Связывание IgG-IC с нейрональным FcγRI напрямую деполяризует мембранный потенциал и запускает разряды потенциала действия в нейронах DRG.В макрофагах и моноцитах активация FcγRI запускает Ca 2+ -зависимый, неселективный катионный канал, который в основном проницаем для Na+[ 27 28 29 ]. В нейронах DRG неселективный катионный канал также может активироваться IgG-IC (I IC ), что способствует индуцированной IgG-IC деполяризации мембранного потенциала [, 19, , , 30, ]. В отличие от предыдущего отчета [ 27 ], этот ток также селективен для Ca 2+ и Na+.Кроме того, I IC можно регулировать или сенсибилизировать внутриклеточным кальцием. Эти особенности I IC аналогичны характеристикам переходного рецепторного потенциала канонических 3 (TRPC3) каналов in vitro [ 31 ]. Соответственно, недавнее исследование показало, что подтипы каналов TRPC3/6/7 участвуют в передаче сигналов FcεRI в тучных клетках [-32-]. Таким образом, вполне вероятно, что каналы TRPC являются потенциальными нижестоящими каналами трансдукции, опосредующими I IC в нейронах DRG.С помощью одноклеточной ОТ-ПЦР мы обнаружили, что мРНК TRPC3 всегда коэкспрессируется с мРНК FcγRI (CD64) в одном и том же нейроне DRG [-19]. Этот результат свидетельствует о том, что FcγRI, скорее всего, прямо или косвенно связан с TRPC3. Кроме того, фармакологическая блокада TRPC3 ингибирует I IC . В частности, специфический нокдаун TRPC3 с использованием малой интерферирующей РНК ослабляет IgG-IC-индуцированный ответ Ca 2+ и I IC [ 19 ].

Сигнальные пути FcγRI в иммунных клетках широко описаны [ 10 ]. Активация FcγRI с помощью IgG-IC приводит к фосфорилированию тирозинкиназы селезенки (Syk), нерецепторной тирозинкиназы [ 33 34 ]. Активированный СИК стимулирует фосфолипазу C (ПЛК), который гидролизует мембранные фосфолипиды фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат для производства рецептора INOSITOL трисфосфат (IP 3 ) и диамилглицерин (DAG) [ 20 34 36 36 36 36 36 36 36 36 36 36 36 36 37 ].IP 3 связывается с рецепторами IP 3 в эндоплазматическом ретикулуме и вызывает высвобождение Ca 2+ из внутренних запасов Ca 2+ . Наше недавнее исследование выявило сходные сигнальные пути FcγRI в нейронах DRG [ 19 ]. Более того, сигнальный путь Syk-PLC-IP 3 участвует в функциональном соединении FcγRI с TRPC3 в нейронах DRG [ 19 ].

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ

Возбуждение первичных ноцицептивных нейронов является одним из основных факторов болевой чувствительности, и устойчивое повышение возбудимости, ведущее к периферической и центральной сенсибилизации, может способствовать развитию и поддержанию хронической боли [ 38 ].Недавние исследования предполагают потенциальную роль нейронального FcγRI в ощущении боли и развитии хронической боли [, 18, , , 25, , , 39, ]. Сшивание нейронального FcγRI с помощью IgG-IC непосредственно возбуждало первичные сенсорные нейроны через нейрональный FcγRI [ 17 18 ], что может вызывать болевые ощущения. Кроме того, активация нейронального FcγRI запускала высвобождение определенных провоспалительных нейротрансмиттеров из нейронов DRG, таких как вещества P[ 17 ].Эти медиаторы могут дополнительно индуцировать нейрогенное воспаление и, в свою очередь, возбуждать нейроны DRG посредством их собственных рецепторов, экспрессируемых на нейронах DRG через паракринный или аутокринный путь [4041]. Наше недавнее исследование показало, что нейрональный FcγRI запускает неселективный катионный канал, который может способствовать индуцированному IgG-IC возбуждению нейронов DRG [, 19, , , 30, ]. Более того, TRPC3 действует как новый и важный нижестоящий канал передачи, опосредующий деполяризующие эффекты IgG-IC на нейроны DRG [-19].Между тем, сигнальный путь Syk-PLC-IP 3 способствует функциональному связыванию FcγRI с TRPC3 в нейронах DRG [ 19 ]. Эти результаты могут обеспечить новые терапевтические стратегии для лечения боли при иммунных заболеваниях.

Следует отметить, что нейропатические механизмы, опосредуемые FcγRI, становятся критическими только при определенных патологических состояниях. Поверхность первичного сенсорного нейрона обычно защищена от крупных молекул, таких как IgG-IC или IgG, благодаря наличию гематоэнцефалических/мозговых барьеров и окружающих глиальных клеток.Напротив, при патологических состояниях, которые разрушают эти барьеры и вызывают демиелинизацию периферических и центральных нейронов [, 42, , , 43, , , 44, ], поверхность нейронов легче подвергается воздействию IgG-IC, присутствующих в сыворотке или окружающих тканях. Связывание IgG-IC с нейрональным FcγRI напрямую активирует первичные сенсорные нейроны, поэтому может вызывать боль, гипералгезию и аллодинию. Интересно, что FcγRI также экспрессируется в нейронах DRG большого диаметра. Возможная IgG-IC-индуцированная активация нейронов среднего и большого диаметра может способствовать парестезии, аллодинии и гипералгезии [ 45 46 47 ] при иммунных заболеваниях.Экспрессия FcγRI в аксонах может свидетельствовать о потенциальной роли нейронального FcγRI в дегенерации и регенерации аксонов после повреждения нерва [-48-]. Однако отсутствует информация о роли нейронального FcγRI в патогенезе боли in vivo . Создание мышей с нокаутом нейронов FcγRI необходимо для будущих исследований in vivo .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хроническая боль часто устойчива к устоявшейся лекарственной терапии, поэтому приветствуются новые терапевтические стратегии.Недавние данные свидетельствуют о том, что активация периферического иммунитета необходима и достаточна для поддержания хронической боли. IgG-IC, по-видимому, является критическим фактором патогенеза боли, индуцируя высвобождение провоспалительных цитокинов из иммунных клеток [ 6 7 8 ]. В дополнение к эффектам непрямой сенсибилизации IgG-IC также напрямую сенсибилизирует первичные ноцицептивные афференты через нейрональных FcγRI [ 17 18 19 25 39 ].Лучшее понимание передачи сигналов FcγRI в периферической нервной системе обеспечит новые потенциальные терапевтические стратегии в лечении хронической боли при IgG-IC-опосредованных заболеваниях.

ССЫЛКИ

[1]. Moulin DE, Hagen N, Feasby TE и др. Боль при синдроме Гийена-Барре Неврология. 1997; 48: 328–331. [2]. Wolfe F, Michaud K. Оценка боли при ревматоидном артрите: минимальное клинически значимое различие, предикторы и эффект терапии фактором некроза опухоли J Rheumatol.2007; 34: 1674–1683. [3]. Valks R, Conde-Salazar L. Болезненный дерматит кончика пальца Am J Contact Dermat. 2003; 14: 219–220 [4]. Wittkowski A, Richards HL, Griffiths CE и др. Восприятие болезни у людей с атопическим дерматитом Psychol Health Med. 2007; 12: 433–444. [5]. Оклендер А.Л. Механизмы боли и зуда, вызванные опоясывающим лишаем (опоясывающим лишаем) J Pain. 2008;9:С10–18 [6]. Verri WA Jr, Guerrero AT, Fukada SY и др. IL-33 опосредует индуцированную антигеном кожную и суставную гиперноцицепцию у мышей Proc Natl Acad Sci USA.2008;105:2723–2728 [7]. Pinto LG, Cunha TM, Vieira SM и др. IL-17 опосредует суставную гиперноцицепцию при антиген-индуцированном артрите у мышей Pain. 2010; 148: 247–256. [8]. Verri WA Jr, Cunha TM, Parada CA, et al Индуцированная антигеном воспалительная механическая гиперноцицепция у мышей опосредуется IL-18 Brain Behav Immun. 2007; 21: 535–543. [9]. Ниммерьян Ф, Раветч СП. Fcgamma-рецепторы: старые друзья и новые члены семьи Иммунитет. 2006; 24:19–28 [10].Ниммерьян Ф, Раветч СП. Рецепторы Fcgamma как регуляторы иммунных ответов Nat Rev Immunol. 2008; 8: 34–47 [11]. Barnes N, Gavin AL, Tan PS и др. Мыши с дефицитом FcgammaRI демонстрируют множественные изменения воспалительных и иммунных реакций. Иммунитет. 2002; 16: 379–389. [12]. Ioan-Facsinay A, de Kimpe SJ, Hellwig SM и др. FcgammaRI (CD64) вносит существенный вклад в тяжесть артрита, реакцию гиперчувствительности и защиту от бактериальной инфекции. Иммунитет. 2002; 16: 391–402. [13].Хамле Йоргенсен С., Соренсен П.С. Внутривенное лечение иммуноглобулином рассеянного склероза и его модели на животных, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита J Neurol Sci. 2005; 233:61–65 [14]. Зандман-Годдард Г., Бланк М., Шенфельд Ю. Внутривенные иммуноглобулины при системной красной волчанке: от скамьи до прикроватной волчанки. 2009; 18: 884–888. [15]. Гебель А., Барановский А., Маурер К. и др. Внутривенное лечение комплексного регионарного болевого синдрома иммуноглобулином: рандомизированное исследование Ann Intern Med.2010; 152:152–158 [16]. Эллсворт Дж.Л., Маурер М., Хардер Б. и др. Борьба с гиперчувствительностью, опосредованной иммунными комплексами, с помощью рекомбинантного растворимого человеческого FcgammaRIA (CD64A) J Immunol. 2008; 180: 580–589. [17]. Андох Т., Кураиши Ю. Прямое действие иммуноглобулина G на первичные сенсорные нейроны через гамма-рецептор Fc I FASEB J. 2004; 18:182–184. [18]. Qu L, Zhang P, LaMotte RH и др. Нейрональный Fc-гамма-рецептор I опосредует возбуждающие эффекты иммунного комплекса IgG на нейроны ганглиев задних корешков крыс Brain Behav Immun.2011; 25:1399–1407 [19]. Qu L, Li Y, Pan X, Zhang P, et al Переходный канонический потенциал рецептора 3 (TRPC3) необходим для индуцированного иммунным комплексом IgG возбуждения нейронов ганглиев задних корешков крыс J Neurosci. 2012;32(28):9554–9562 [20]. Ниммерьян Ф, Раветч СП. Fc-рецепторы как регуляторы иммунитета Adv Immunol. 2007; 96: 179–204. [21]. Mohamed HA, Mosier DR, Zou LL и др. Гамма-рецептор Fc иммуноглобулина способствует поглощению иммуноглобулина, опосредованному иммуноглобулином увеличению содержания кальция и высвобождению нейротрансмиттера в моторных нейронах J Neurosci Res.2002; 69: 110–116. [22]. Nakamura K, Hirai H, Torashima T и др. CD3 и Fc-рецептор иммуноглобулина G регулируют функции мозжечка Mol Cell Biol. 2007; 27: 5128–5134 [23]. van der Kleij H, Charles N, Karimi K, et al Доказательства нейронной экспрессии функциональных рецепторов Fc (эпсилон и гамма) J Allergy Clin Immunol. 2010;125:757–760 [24]. Андох Т., Кураиши Ю. Экспрессия рецептора Fc-эпсилон I на первичных сенсорных нейронах у мышей. Нейроотчет. 2004; 15:2029–2031 [25].Qu L, Zhang P, LaMotte RH и др. Новый антиген-специфический иммунный механизм боли 13 th Всемирный конгресс по боли. 2010 г. Аннотация № 1470 [26]. Окун Э., Мэтсон, член парламента, Арумугам ТВ. Участие рецепторов Fc в заболеваниях центральной нервной системы. 2010; 12:164–178 [27]. Floto RA, Somasundaram B, Allen JM, et al. Активация рецептора Fcgamma I запускает новый Ca2+-активируемый ток, избирательный по отношению к одновалентным катионам в моноцитарной клеточной линии человека, U937 J Biol Chem.1997; 272:4753–4758. [28]. Nelson DJ, Jacobs ER, Tang JM и др. Одиночные ионные каналы, индуцированные иммуноглобулином G, в мембранах альвеолярных макрофагов человека J Clin Invest. 1985; 76: 500–507. [29]. Young JD, Unkeless JC, Kaback HR, et al Изменения мембранного потенциала макрофагов, связанные со связыванием рецептора Fc gamma 2b/gamma 1 с лигандом Proc Natl Acad Sci U S A. 1983; 80:1357–1361 [30]. Qu L, Zhang P, et al. Активация нейронального Fc-гамма-рецептора I запускает переходный ток, подобный рецепторному потенциалу, в нейронах ганглиев задних корешков крыс Soc Neurosci Abstr.2011;37:380 [31]. Wu LJ, Sweet TB, Clapham DE. Международный союз фундаментальной и клинической фармакологии. LXXVI. Текущий прогресс в семействе ионных каналов TRP млекопитающих Pharmacol Rev. 2010; 62: 381–404 [32]. Sanchez-Miranda E, Ibarra-Sanchez A, Gonzalez-Espinosa C. Киназа Fyn контролирует вход кальция, управляемый рецептором FcepsilonRI, необходимый для полной дегрануляции в тучных клетках Biochem Biophys Res Commun. 2010; 391:1714–1720 [33]. Индик З.К., Парк Дж.Г., Хантер С. и др. Молекулярная диссекция фагоцитоза, опосредованного гамма-рецептором Fc. Кровь.1995; 86: 4389–4399. [34]. Кинер П.А., Рэнкин Б.М., Буркхардт А.Л. и др. Перекрестное связывание рецептора Fc-гамма I (Fc-гамма RI) и рецептора II (Fc-гамма RII) на моноцитарных клетках активирует путь передачи сигнала, общий для обоих рецепторов Fc, который включает стимуляцию p72 Syk протеинтирозинкиназа J Biol Chem. 1993; 268:24442–24448 [35]. Bonilla FA, Fujita RM, Pivniouk VI, et al. Адаптерные белки SLP-76 и BLNK оба экспрессируются мышиными макрофагами и связаны с передачей сигналов через Fcgamma-рецепторы I и II/III Proc Natl Acad Sci U S A.2000; 97: 1725–1730. [36]. Ляо Ф., Шин Х.С., Ри С.Г. Тирозиновое фосфорилирование фосфолипазы С-гамма 1, индуцированное перекрестным связыванием высокоаффинного или низкоаффинного Fc-рецептора для IgG в клетках U937 Proc Natl Acad Sci U S A. 1992; 89:3659–3663 [37]. van de Winkel JG, Tax WJ, Jacobs CW и др. Перекрестное связывание обоих типов рецепторов Fc IgG, Fc гамма RI и Fc гамма RII, увеличивает внутриклеточный свободный Ca2+ в моноцитарной клеточной линии U937 Scand J Immunol. 1990; 31: 315–325. [38].Ченг Дж. К., Цзи Р. Р. Внутриклеточная передача сигналов в первичных сенсорных нейронах и постоянная боль Neurochem Res. 2008; 33:1970–1978. [39]. Ma C, Zhang P, Sikand P и др. Антиген-специфические иммунные механизмы хронической боли Soc Neurosci Abstr. 2009;39:459 5 [40]. Tang HB, Li YS, Arihiro K, et al. Активация рецептора нейрокинина-1 веществом P вызывает высвобождение вещества P из культивируемых нейронов ганглия задних корешков взрослых крыс Mol Pain. 2007;3:42 [41].van Rossum D, Hanisch UK, Quirion R. Нейроанатомическая локализация, фармакологическая характеристика и функции CGRP, родственных пептидов и их рецепторов Neurosci Biobehav Rev. 1997;21:649–678 [42]. Sastre-Garriga J, Montalban X. APS и волчанка головного мозга. 2003; 12: 877–882. [43]. Ху В., Луккинетти CF. Патологический спектр воспалительных демиелинизирующих заболеваний ЦНС Семин Иммунопатология. 2009; 31: 439–453. [44]. Abbott NJ, Mendonca LL, Dolman DE.Гематоэнцефалический барьер при системной красной волчанке. 2003; 12: 908–915. [45]. Декостер И., Оллчорн А., Вульф С.Дж. Прогрессирующая тактильная гиперчувствительность после сдавления периферического нерва: нейропатическая боль, вызванная невредным механическим раздражителем Боль. 2002; 100: 155–162. [46]. Ма QP, Вульф CJ. Прогрессирующая тактильная гиперчувствительность: вызванное воспалением постепенное повышение возбудимости спинного мозга Боль. 1996; 67: 97–106. [47]. Вульф СиДжей, Дубелл ТП.Патофизиология хронической боли — повышенная чувствительность к низкопороговым входам бета-волокна А Curr Opin Neurobiol. 1994; 4: 525–534. [48]. Стирлинг Д.П., Стис П.К. Механизмы повреждения аксонов: межузловые нанокомплексы и нарушение регуляции кальция Trends Mol Med. 2010;16:160–170

Финансирование: Эта работа поддерживается стипендией (2012-2014) Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR).

Конфликт интересов: Не объявлено.

(Под редакцией Yang Y/Zhao LJ/Song LP)

Адвокат по медиации в Денвере, Колорадо

Что такое медиация?

Посредничество — это форма разрешения споров, не затрагивающая судебную систему. Это работает следующим образом: стороны в споре выбирают посредника, которым обычно является кто-то, кто знаком и осведомлен о вашем типе спора, но не связан ни с одной из сторон (он должен быть беспристрастным). После того, как стороны выберут посредника, стороны назначат время для встречи с посредником.

Роль посредника

На этом посредничестве (также называемом конференцией по урегулированию) посредник выслушает аргументы и позиции каждой стороны в конфиденциальной обстановке. Посредничество может длиться часы или дни, в зависимости от случая.

Основная цель посредника — выяснить, чего хочет каждая сторона, и попытаться заставить все стороны прийти к какому-либо компромиссу. В отличие от судьи или присяжных, медиатор не может заставить стороны делать то, чего они не хотят.Медиатор просто дает рекомендации, но стороны могут принять или отклонить эти рекомендации.

Преимущества посредничества

Посредничество имеет много преимуществ перед судебным разбирательством. Во-первых, хотя расходы на посредничество могут возрасти до нескольких тысяч долларов, если посредничество займет весь день, затраты на недельное судебное разбирательство могут легко составить 20 000–30 000 долларов.

Во-вторых, при посредничестве стороны точно знают, с чем они уходят, если решат принять предложение/предложение, о котором договорился посредник.Эта уверенность иногда дорогого стоит людям. С другой стороны, в судебном процессе стороны не знают, каков будет результат, пока присяжные не вынесут вердикт в конце судебного процесса. И в отличие от предложений посредника, вердикт присяжных является окончательным и обязательным для всех сторон (за очень немногими исключениями, такими как апелляция).

Хорошая альтернатива для вашего дела

По этим причинам мы считаем, что посредничество, как правило, является отличным вариантом для большинства людей. При минимальных затратах (как правило, не более нескольких тысяч долларов) вы потенциально можете избежать дорогостоящего и трудоемкого пробного периода.Существует также очень небольшой риск или недостаток, поскольку посредник не может заставить вас урегулировать ваше дело или заставить вас что-либо сделать. Скорее, они предлагают свой профессиональный опыт и рекомендации каждой стороне с целью попытаться убедить стороны добровольно объединиться и прийти к компромиссу.

Влияние гамма-интерферона на продукцию иммунных медиаторов в нервных клетках человека, инфицированных двумя штаммами Toxoplasma gondii | Интернет-исследования в области здравоохранения и окружающей среды (HERO)

ID ГЕРОЯ

7066344

Тип ссылки

Журнальная статья

Заголовок

Влияние гамма-интерферона на продукцию иммунных медиаторов в нервных клетках человека, инфицированных двумя штаммами Toxoplasma gondii

Авторы)

Маммари, Н.; Виньоль, П; Халаби, Массачусетс; Дарде, мл.; Куртиу, Б; ,

Год

2015

Рецензируется ли эксперт?

да

Журнал

Паразит
ISSN: 1252-607X

Издатель

ЭДП НАУКИ С А

Место нахождения

ЛЕС УЛИС СЕДЕКС А

PMID

26692261

DOI

10.1051/паразит/2015039

Идентификатор Web of Science

WOS:000366927400002

Абстрактный

Гамма-интерферон (ИФН-гамма) является основным иммунным медиатором, предотвращающим токсоплазматический энцефалит на мышиных моделях. Отсутствие секреции IFN-gamma вызывает реактивацию латентных штаммов T.gondii, что может привести к развитию тяжелого токсоплазматического энцефалита. Мы анализируем влияние ИФН-гамма на продукцию иммунных медиаторов и размножение паразитов в нервных клетках человека, инфицированных тахизоитами двух штаммов T. gondii (RH и PRU). IFN-gamma снижал синтез MCP-1, G-CSF, GM-CSF и Serpin E1 во всех типах клеток. Он снижал синтез IL-6, фактора ингибирования миграции (MIF) и GRO-альфа только в эндотелиальных клетках, в то время как увеличивал синтез sICAM и Serpin E1 только в нейронах.Бремя штамма PRU увеличилось во всех нервных клетках, и, напротив, репликация штамма RH контролировалась в IFN-gamma-стимулированных микроглиальных и эндотелиальных клетках, но не в IFN-gamma-стимулированных нейронах. Пролиферация штамма PRU во всех стимулированных клетках может быть специфическим действием этого штамма на клетку-хозяина.

Влияние гамма-интерферона на продукцию иммунных медиаторов в нервных клетках человека, инфицированных двумя штаммами Toxoplasma gondii

Влияние гамма-интерферона на продукцию иммунных медиаторов в нервных клетках человека, инфицированных двумя штаммами

Toxoplasma gondii

Влияние гамма-интерферона на продукцию медиаторов иммунитета в отношении нервных клеток человека, инфицированных паром двух источников

Toxoplasma gondii

Nour Mammari 1 * , Philippe Vignole 1 , Mohamad Adnan Halabi 2 , Marie-Laure Dardé 1 , 3 и Bertrand Courtioux 1

1 ун-тЛимож, UMR-S 1094, Тропическая нейроэпидемиология, Институт нейроэпидемиологии и тропической неврологии, CNRS FR 3503 GEIST, 87000 Лимож, Франция
2 UMR CNRS 7276, FR 3503 GEIST, фармацевтический факультет Лиможского университета, 87000 Лимож, Франция
3 CHU Limoges, Отделение паразитологии и Центр биологических ресурсов токсоплазмы, 87000 Лимож, Франция

* Автор, ответственный за переписку: [email protected]фр

Получено: 7 Октябрь 2015
Принято: 29 ноябрь 2015

Аннотация

Гамма-интерферон

(IFN-γ) является основным иммунным медиатором, предотвращающим токсоплазматический энцефалит в моделях на мышах. Отсутствие секреции IFN-γ вызывает реактивацию латентной инфекции T. gondii , что может создавать риск развития тяжелого токсоплазматического энцефалита. Мы анализируем влияние IFN-γ на продукцию иммунных медиаторов и размножение паразитов в нервных клетках человека, инфицированных тахизоитами двух штаммов T.gondii (RH и PRU). IFN-γ снижал синтез MCP-1, G-CSF, GM-CSF и Serpin E1 во всех типах клеток. Он снижал синтез IL-6, фактора ингибирования миграции (MIF) и GROα только в эндотелиальных клетках, в то время как увеличивал синтез sICAM и Serpin E1 только в нейронах. Бремя штамма PRU увеличилось во всех нервных клетках, и, напротив, репликация штамма RH контролировалась в IFN-γ-стимулированных микроглиальных и эндотелиальных клетках, но не в IFN-γ-стимулированных нейронах. Пролиферация штамма PRU во всех стимулированных клетках может быть специфическим действием этого штамма на клетку-хозяина.

Резюме

Гамма-интерферон (ИФН-γ) является основным медиатором иммунитета, способствующим развитию токсоплазматического энцефалита в мышиной модели. Отсутствие секреции IFN-γ провоцирует реактивацию латентной инфекции T. gondii с риском развития тяжелой формы токсоплазмоза головного мозга. Nous avons проанализировал влияние IFN-γ на продукцию иммунных медиаторов и паразитарное размножение в клетках, инфицированных людьми, среди тахизоитов deux souches de T.gondii (RH et PRU). L’IFN-γ подавляет синтез MCP-1, G-CSF, GM-CSF и Serpin E1 в различных типах клеток. Уменьшение уникальности синтеза IL-6, MIF и GROα в эндотелиальных клетках, а также стимуляция синтеза SICAM и Serpin E1 в нейронах. La Charge parasitaire de la souche PRU augmente dans toutes les Cellules neurouses. En revanche, размножение источника RH контролируется микроглиальными и эндотелиальными клетками, стимулирующими IFN-γ, больше, чем нейроны, стимулирующие IFN-γ.La prolifération de la souche PRU dans toutes les Cellules stimulées pourrait être un effet specifique de cette souche sur la cellule hôte.

Ключевые слова: Токсоплазма гондии / Нервные клетки человека / IFN-γ / Иммунитет

© N. Mammari et al., опубликовано EDP Sciences, 2015 г.

Оценка естественного косвенного эффекта и доли посредничества с помощью метода продукта | BMC Medical Research Methodology

Дизайн моделирования

Мы провели исследования моделирования в рамках ряда сценариев, которые могут встретиться на практике, чтобы оценить эффективность точечных и интервальных оценок NIE и MP.Чтобы представить широкий диапазон размеров выборки, обычно встречающихся на практике, мы рассмотрели 4 уровня размеров выборки: 150, 500, 1000 и 5000 для случаев непрерывного исхода (случай № 1 и № 2). При исходной распространенности исхода 3%, чтобы получить 15, 30, 150, 600 ожидаемых случаев заболевания, мы рассмотрели размеры выборки 500, 1000, 5000, 20000 для сценариев бинарного исхода (случаи № 3 и № 4). . Здесь мы не рассматривали размер выборки в 150 для сценариев с бинарными результатами, поскольку ожидаемое количество случаев (около 5 случаев в каждом смоделированном наборе данных) было бы слишком маленьким для получения стабильных оценок NIE и MP.Для каждого типа данных и размера выборки мы рассматривали экспозицию ( X ) как бинарную переменную и для простоты предположили, что как в модели посредника, так и в модели результата не было искажающих факторов. Когда результат был непрерывным, мы установили TE ∈ (0,25, 0,5, 1), указав малые, средние и большие суммарные эффекты на шкале различий. Когда результат был двоичным, мы установили TE, измеренную по логарифмической шкале отношения шансов, как log (1,2), log (1,5) и log (2). Для каждого значения TE мы считали MP ∈ (0,05,0,2,0.5). Все меры посредничества определены для изменения X от 0 до 1. Ожидается, что при меньшем TE потребуется больший размер выборки для получения достаточно точной оценки посредничества, поскольку доступная информация или оценка даже общего воздействия эффект довольно ограничен. Кроме того, для фиксированного TE меньший MP или, что эквивалентно, меньший NIE потребует большего размера выборки для достаточно точного анализа посредничества, поскольку размер эффекта посредничества становится ограниченным.

Дело №1, непрерывный исход и непрерывный посредник. Сначала мы создали экспозицию X ∼Бернулли(0,5). Затем смоделировали медиатор M N ( γ 0 + γ 1 X ,1), где γ 1 было выбрано равным 0,408, что соответствует корреляции воздействие-медиатор, Corr( X , M )=0,2. Наконец, дан x и м , мы смоделировали y ~ N ( β 0 + β 1 1 x + β 2 м , 1) , где β 0 было зафиксировано как 0.Положим β 1 = (1−MP)×TE и \(\beta _{2}=\frac {\text {MP}\times \text {TE}}{\gamma _{1}} \) на основе соотношений NDE=(1−MP)×TE= β 1 и NIE=MP×TE= β 2 γ 1 .

Случай №2, непрерывный исход и бинарный посредник. Сначала мы смоделировали X ∼Бернулли(0,5). Тогда, мы сгенерировали м условного на x от логистической регрессии ( г ( м = 1 | γ 0 + γ 1 x .Отметив, что \(\gamma _{0}=\log \left (\frac {P(M=1|X=0)}{1-P(M=1|X=0)}\right)\), мы выбрали значения γ 0 таким образом, чтобы исходная распространенность медиатора P ( M =1 | X =0)=0,2. Как и в случае № 1, мы выбрали γ 1 = 0,903, чтобы получить корреляцию воздействие-медиатор 0,2. Наконец, мы смоделировали Y ~ N ( β 0 + β 1 1 x + β 2 м , 1), где β 0 = 0, β 1 = (1−MP)×TE из определения NDE=(1−MP)×TE= β 1 , и \(\beta _{2} = {\text { MP} \ times \ text {TE}} / \ left \ {\ frac {e ^ {\ gamma _ {0} + \ gamma _ {1}}} { 1+ e ^ {\ gamma _ {0} + \ gamma _ {1} }} — \ frac {e ^ {\ gamma _ {0} }} { 1+ e ^ {\ gamma _ {0}}} \ right \} \), заметив \ (\ text {MP }\times \text {TE} = \text {NIE} = \beta _{2} \left \{\frac {e^{\gamma _{0}+\gamma _{1}}}}{1+ e ^{\gamma _{0}+\gamma _{1}}} — \frac {e^{\gamma _{0}}}}{1+ e^{\gamma _{0}}}\right \} \).

Случай №3, бинарный исход и непрерывный посредник. Сначала мы сгенерировали X и M , используя ту же процедуру, что и в случае № 1. Теперь, учитывая X и M , мы использовали следующую модель логистической регрессии для имитации Y ,

$$ \text{logit}\Big(P(Y=1|X,M)\Big) = \beta_{0} + \beta_{1} X +\beta_{2} M. $$

(10)

Поскольку \(\beta _{0}=\log \left (\frac {P(Y=1|X=0,M=0)}{1-P(Y=1|X=0,M= 0)}\справа)\), мы выбрали β 0 , поэтому исходная распространенность результатов составила 3%.Затем мы выбрали β 1 и β 2 путем численного решения системы уравнений },\beta _{1},\beta _{2},\gamma _{0},\gamma _{1})\) и \((1-\text {MP})\times \text {TE } = \mathscr {NDE}(\beta _{0},\beta _{1},\beta _{2},\gamma _{0},\gamma _{1})\), где \(\ mathscr {NIE}(\beta _{0},\beta _{1},\beta _{2},\gamma _{0},\gamma _{1})\) и \(\mathscr {NDE} (\beta _{0},\beta _{1},\beta _{2},\gamma _{0},\gamma _{1})\) относятся к точным выражениям NIE и NDE, приведенным в (5) и (6).

Случай №4, бинарный исход и бинарный посредник. Сначала мы сгенерировали X и M , используя ту же процедуру в Случае № 2, а затем сгенерировали результат Y , используя модель логистической регрессии (10). Значения β 0 , β 1 и β 2 были получены следующим образом. Мы выбрали β 0 таким образом, чтобы исходная распространенность исхода составляла около 3%. Затем мы выбрали β 1 и β 2 путем решения системы уравнений \(\text {MP}\times \text {TE} = \mathscr {NIE}(\beta _{0}, \beta _{1},\beta _{2},\gamma _{0},\gamma _{1})\) и \((1-\text {MP})\times \text {TE} = \mathscr {NDE}(\beta _{0},\beta _{1},\beta _{2},\gamma _{0},\gamma _{1})\), где \(\mathscr { NIE}(\beta _{0},\beta _{1},\beta _{2},\gamma _{0},\gamma _{1})\) и \(\mathscr {NDE}(\ beta _{0},\beta _{1},\beta _{2},\gamma _{0},\gamma _{1})\) относятся к точным выражениям NIE и NDE, приведенным в (8 ) и (9).

Для каждого типа данных мы получили \(\widehat {\text {NIE}}\) и \(\widehat {\text {MP}}\), оценки дисперсии \(\widehat {\text {NIE }}\) и \(\widehat {\text {MP}}\) с помощью многомерного дельта-метода, а также 95% доверительные интервалы NIE и MP с помощью многомерного дельта-метода и процентильного бутстрап-метода. Мы не использовали подход начальной загрузки для размера выборки 20 000 в случаях № 3 и № 4 из-за вычислительных затрат на выполнение количества выборок начальной загрузки с большим набором данных в 5000 повторений.С бинарным результатом мы сначала оценили производительность оценщиков на основе приблизительных выражений (т. е. NIE ( a ) и MP ( a ) ) и сравнили производительность между приблизительным и точным оценки мер посредничества путем варьирования исходной распространенности от 1% до 50%.

Процентная погрешность (Bias(%)) использовалась для оценки точности точечных оценок NIE и MP. Его рассчитывали как среднее отклонение относительно истинного значения для 5000 повторений.Мы использовали «медиану», а не «среднее» значение по всем повторениям, чтобы избежать чрезмерного влияния выбросов на результаты, когда размеры выборки были небольшими. Коэффициент дисперсии был определен как отношение между медианой оценочной дисперсии и эмпирической дисперсией и используется для определения точности оценки дисперсии, полученной многомерным дельта-методом. Точность интервальной оценки определяется путем расчета эмпирической степени охвата (CR) 95% доверительного интервала в 5000 повторений.Результаты моделирования для точечных, дисперсионных и интервальных оценок NIE и MP по четырем типам данных показаны в таблице 3 (случай № 1), веб-таблице 1 (случай № 2), веб-таблице 2 в дополнительном файле 1 (случай № 2). 3) и веб-таблицу 3 в дополнительном файле 1 (кейс №4) соответственно. Подробные результаты исследования моделирования представлены ниже.

Таблица 3 Результаты моделирования для случая № 1: непрерывный результат и непрерывный посредник

Оценка NIE

Когда результат является непрерывным, точечные оценки NIE обычно имели минимальную погрешность для размеров выборки, равных или превышающих 500, для всех значений ТЭ и МП учтены.Когда выборка была всего 150, точечные оценки NIE имели относительно небольшую погрешность (процентная погрешность в пределах ±10 % ) до тех пор, пока MP≥0,2 и TE≥0,5. Однако при бинарном результате точечные оценки не давали достаточно малой процентной погрешности до тех пор, пока размер выборки не достигал 1000, как показано в веб-таблице 2 в дополнительном файле 1 (случай № 3) и в веб-таблице 3 в дополнительном файле 1 (случай № 4). ). Когда результат был относительно редким, а размер выборки был небольшим, данных было недостаточно для точной оценки NIE методом произведения.{(a)}\) была заметна, когда TE = log (2) и MP = 0,5, даже когда размер выборки составлял 20 000, что указывает на то, что в редких случаях систематическая ошибка сохранялась, когда TE и MP также были большими.

Коэффициент дисперсии NIE для всех типов данных и размеров выборки был очень близок к 1, что указывает на точность оценки дисперсии, полученной с помощью многомерного дельта-метода. По сравнению с многомерным дельта-методом бутстрап обеспечивает более точные оценки интервала NIE, особенно при небольшом размере выборки.{(a)}\) более выражена при большем размере выборки.В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что многомерный дельта-метод является допустимым подходом для оценки дисперсии и доверительных интервалов для NIE, когда размер выборки составляет не менее 500 с непрерывным результатом.

Для случаев двоичного результата мы также оценили эффективность оценок NIE на основе точных выражений (т. е. \(\widehat {\text {NIE}}\)). Результаты показаны в веб-таблицах 2 и 3 в (см. дополнительный файл 1) или случаях № 3 и № 4 соответственно. До тех пор, пока размеры выборки больше или равны 1000, оценка, основанная на точных выражениях, неизменно имела небольшую процентную погрешность и номинальную степень охвата.

Оценка MP

В отличие от оценок NIE, точечные оценки MP часто расходились с истинными значениями MP при меньших размерах выборки. Когда результат был бинарным, процентная погрешность в MP обычно превышала 30% для размеров выборки ≤1000, а иногда даже превышала 70% для размера выборки ≤500, как показано в веб-таблице 2 (случай № 3) и веб-таблице. 3 (случай № 4) в дополнительном файле 1. Оценки точек MP были более стабильными с непрерывным результатом, и в этом случае систематическая ошибка незначительна, когда размер выборки составлял не менее 500.Для сценариев с бинарными исходами процентная погрешность MP не была близка к 0 до тех пор, пока размер выборки не достиг 5000 или количество случаев не превышало 200. Для всех типов данных процентное смещение \(\widehat {\text {MP}}\) кажется большим, когда TE мал. Для одного и того же TE меньшая процентная погрешность имела место, когда MP был больше.

Оценки дисперсии \(\widehat {\text {MP}}\), полученные с помощью многомерного дельта-метода, были меньше соответствующих им эмпирических дисперсий, и это явление становилось более заметным при малых размерах выборки и небольшой TE.В целом, многомерный дельта-метод обеспечивает точную оценку дисперсии, когда размер выборки составляет не менее 500 для сценариев непрерывного результата. Когда результат был бинарным, многомерный дельта-метод обеспечивал точные оценки дисперсии только при размере выборки не менее 5000 и TE ≥ log(1,5).

Подобно оценкам интервалов NIE, бутстрап обеспечивает более точные оценки интервалов MP, чем многомерный дельта-метод, особенно при меньших размерах выборки, поскольку распределение \(\widehat {\text {MP}}\) при малых размерах выборки может отклоняться от нормальности, что предполагалось в многомерном дельта-методе.Для всех типов данных и размеров выборки бутстрапный подход обычно имел степень охвата выше 95% и начал обеспечивать коэффициенты покрытия, близкие к номинальным, для размера выборки 500 для сценариев с непрерывным результатом и 5000 для сценариев с бинарным результатом. С другой стороны, многомерный дельта-метод не давал точных доверительных интервалов для меньших размеров выборки, а его охват иногда опускался ниже 80% в некоторых условиях с бинарным результатом. При непрерывном исходе для многомерного дельта-метода требовалась выборка размером 1000, чтобы обеспечить удовлетворительные интервальные оценки, тогда как требования к размеру выборки для сценариев с бинарными исходами были значительно больше.Как показано в веб-таблице 2 (случай № 3) и веб-таблице 3 (случай № 4) в дополнительном файле 1, многомерный дельта-метод обеспечивает удовлетворительные показатели охвата, когда TE ≥ log (1,5) и размер выборки ≥ 5000 с бинарным результатом. При малом TE (TE = log(1,2)) потребуется размер выборки не менее 20 000, чтобы многомерный дельта-метод мог обеспечить оценки интервала MP с номинальным охватом. Производительность дельта-метода также была чувствительна к величине TE. Когда TE был небольшим, доверительный интервал MP, как правило, был намного шире, чем он должен быть, когда MP также был мал, но, как правило, был уже, чем должен быть для больших MP.{(а)}\) по сравнению с \(\widehat {\text {MP}}\}), когда распространенность исходного исхода варьировалась от 1% до 50%. Мы рассмотрели TE ∈ {log (1,2), log (2)}, MP ∈ {0,1,0,5} и большой размер выборки в 20 000, чтобы уменьшить опасения по поводу систематических ошибок небольшой выборки.

На рис. 2 и веб-рис. 2 в дополнительном файле 1 представлены результаты оценок MP и NIE, соответственно, для сценария бинарного исхода и бинарного посредника (т. е. случай № 4). Оценки, основанные на точных выражениях причинного опосредования, \(\widehat {\text {MP}}\) и \(\widehat {\text {NIE}}\), обеспечили точные точечные и интервальные оценки, когда распространенность исхода> 1 % .{(a)}\) также сильно отличалось от своего истинного значения, когда исходная распространенность исхода ≥10 % (см. Интернет-рисунок 1 в дополнительном файле 1).

Рис. 2

Эффективность оценок MP ( a ) (черная линия) и оценок MP (синяя пунктирная линия) при изменении исходной распространенности с 1% до 50% в случае № 4, где размер выборки 20 000. Bias(%), CR ( d ) и VR обозначают процентное смещение, степень охвата многомерным дельта-методом и коэффициент дисперсии.Верхний ряд: результаты для TE=log(1,2) и MP=0,1; вторая строка: результаты для TE=log(1,2) и MP=0,5; третья строка: результаты для TE=log(2) и MP=0,1; нижний ряд: результаты для TE=log(2) и MP=0,5

С бинарным исходом и непрерывным медиатором (случай №3), \(\widehat {\text {MP}}\) и \(\widehat {\ text {NIE}}\) предоставил точные точечные и интервальные оценки среди всех уровней распространенности исходных исходов, как показано на веб-рисунках 3 и 4 (см.{(a)}\) также обеспечивал очень надежные точечные и интервальные оценки (веб-рисунок 2 в дополнительном файле 1) для распространенных сценариев результатов, где его процентное смещение было меньше чем 1% среди всех рассматриваемых TE, MP и распространенности результатов.{(a)}\) был незначительным в диапазоне рассмотренных исходов.

Предположения о гомоскедастичности и нормальности в случае № 3

В приведенном выше моделировании мы смоделировали M | X при гомоскедастическом нормальном распределении, как предполагалось при выводе выражений меры посредничества в случае № 3. В качестве анализа чувствительности здесь мы оцениваем производительность метода произведения в случае № 3 на основе оценок (5) и (6), когда M либо гетероскедастично, либо не имеет нормального распределения.{2}\) равно 1 во всех рассмотренных случаях, таким образом общая дисперсия остается постоянной для изучения гетероскедастичности. Когда η 1 = 0, сохраняется гомоскедастичность, и более высокое значение η 1 представляет более сильную степень гетероскедастичности. Положим η 1 ∈ {0,0,25,0,5,0,75,1} так, чтобы дисперсия медиатора в экспонированной группе была в κ ∈{1,1,26,1,67,2,20,3} раз больше, чем в нераскрытая группа. Мы использовали предложенные точную и приблизительную оценки для оценки NIE и MP.Результаты приведены в веб-таблице 4 (см. дополнительный файл 1). Мы обнаружили, что как точные, так и приближенные оценки относительно нечувствительны к нарушениям предположения о гомоскедастичности. В частности, точные оценки продемонстрировали минимальное смещение и покрытие номинального доверительного интервала при всех рассматриваемых степенях гетероскедастичности, а приблизительная оценка также показала хорошие результаты, когда исход был редким (распространенность исхода на уровне 3%). Эти результаты предполагают, что предложенные оценки устойчивы к гетероскедастичности, по крайней мере, к тем ее формам, которые мы рассмотрели.

Во-вторых, мы исследуем чувствительность предлагаемых оценок, когда член ошибки не имеет нормального распределения.{-b/\theta}\) ( b > 0), k и θ — параметры формы и масштаба.Мы вычитаем b с его математическим ожиданием E [ b ] = k θ , а затем делим его на стандартное отклонение \(\sqrt {k}\theta \), чтобы зафиксировать среднее значение и дисперсию ε в точках 0 и 1, что соответствует первым двум моментам стандартного нормального распределения. Здесь мы выбрали k = (2/ s ) 2 и θ = s /2 так, чтобы коэффициент асимметрии ε был равен s . Мы выбираем s равным 1, 1.5 и 2, представляющие различные степени асимметрии, а затем по-прежнему использовать наши точные оценки NIE и MP, основанные на (5) и (6), и соответствующие приблизительные оценки для анализа. Результаты моделирования представлены в веб-таблице 5 (см. дополнительный файл 1). Мы также включили сценарий, согласно которому ε соответствует стандартному нормальному распределению в качестве эталона. Мы заметили, что как точный, так и приближенный метод устойчивы к нарушениям предположения о нормальности, когда все точечные оценки и оценки дисперсии, а также коэффициенты охвата доверительных интервалов сопоставимы для двух процессов генерации данных.Этот вывод предполагает, что наши точные оценки NIE и MP, основанные на (5) и (6), нечувствительны к умеренной асимметрии распределения результатов, даже если вывод предполагает нормальность.

В присутствии бинарного вмешивающегося фактора

Чтобы оценить надежность результатов моделирования с учетом наблюдаемого вмешивающегося фактора, мы провели дополнительные симуляционные исследования в присутствии бинарного вмешивающегося фактора, связанного с воздействием, посредником и исходом. Мы исследовали оценки NIE и MP с точки зрения процентной систематической ошибки, отношения дисперсии и охвата 95% доверительного интервала для каждого типа данных путем изменения ассоциаций «вмешивающийся фактор — воздействие», «вмешивающийся фактор — посредник» и «вмешивающийся фактор — результат».Схема моделирования и результаты подробно описаны в веб-приложении D и веб-таблицах 6–7 в дополнительном файле 1. В целом, мы заметили, что производительность метода продукта устойчива при смешивании различных величин и структур. Процентное смещение, коэффициент дисперсии и степень охвата доверительного интервала 95% сопоставимы для сценариев с бинарным искажающим фактором и без него.

Приложение к исследованию maxART

Мы провели посреднический анализ в исследовании MaxART [4], которое представляет собой кластерное рандомизированное исследование со ступенчатым клином среди ВИЧ-позитивных участников в Эсватини.Основная цель исследования заключалась в том, чтобы понять влияние раннего доступа к антиретровирусной терапии (EAAA) по сравнению со стандартом лечения (SoC). С сентября 2014 г. по август 2017 г. консорциум MaxART случайным образом попарно распределил 14 участвующих клиник для перехода с SoC на EAAA в случайно выбранные заранее указанные даты. Более подробную информацию о дизайне этого исследования MaxART можно найти в [52]. Исследование MaxART ранее показало, что EAAA улучшает удержание в лечении ВИЧ [4], но механизмы, лежащие в основе взаимосвязи между вмешательством и удержанием, неизвестны.В этом иллюстративном примере мы исследовали, в какой степени влияние вмешательства (SoC по сравнению с EAAA) на 12-месячное удержание в системе помощи при ВИЧ было опосредовано приверженностью к посещению через 6 месяцев. Участники классифицировались как получающие помощь при ВИЧ-инфекции в течение 12 месяцев, если в конце 12-го месяца после включения участник был жив и не прекратил лечение, если либо последний визит в клинику был менее чем через 90 дней после окончания исследования, или дата следующего запланированного визита была в течение 30 дней после окончания исследования.Чтобы получить 12-месячное удержание, мы требовали, чтобы (1) дата включения участника была длиннее 12 месяцев с момента окончания исследования и/или (2) если первоначально получавший лечение SoC, дата перехода участника в EAAA была длиннее, чем 12 месяцев с момента регистрации. Участники, не соответствующие двум вышеуказанным требованиям, были исключены. Наконец, в нашем иллюстративном анализе был использован 1731 участник, из которых 1335 человек оставались под опекой в ​​​​течение 12 месяцев, а 396 человек не удерживались, из которых 1014 человек получали SoC, а 717 человек получали EAAA.Базовые характеристики участников приведены в веб-таблице 8 (см. дополнительный файл 1). В целях иллюстрации мы не рассматриваем кластеризацию субъектов внутри клиник; мы отмечаем, однако, что минимальная степень кластеризации сообщалась ранее в предыдущем анализе исследования MaxART [4].

Гипотетический медиатор, рассматриваемый здесь, — это приверженность посещений в течение 6 месяцев, которая измеряет, совпадает ли частота клинических посещений участника с протоколом MaxART в течение первых 6 месяцев после зачисления.Согласно протоколу MaxART, участники должны проходить контрольные визиты каждые 30 дней. Отсюда следует, что к концу 6-го месяца участники должны были совершить 6 и более посещений. Здесь определение приверженности посещению через 6 месяцев завершает 5 или более клинических посещений к концу 6-го месяца после зачисления (да = 1, нет = 0). Основываясь на этом определении, 831 участник придерживался графика посещений MaxART в течение первых 6 месяцев, тогда как 900 участников этого не сделали.

Мы рассмотрели два сценария смешанной корректировки (т.e., W ) в исходной и медиаторной моделях. В сценарии I мы сделали поправку только на время шага. В Сценарии II мы скорректировали все факторы, которые могли искажать отношения «вмешательство-удержание», «приверженность к лечению — удержание» или «вмешательство-посещение — приверженность». Исходя из клинических знаний и предшествующего анализа этих данных, полный набор потенциальных искажающих факторов включал время шага, возраст при включении в исследование (<20 лет, [20,30) лет, [30,40) лет, [40,50) лет, [ 50,60 лет, ≥60 лет), пол, семейное положение (замужем, разведен/вдовец, холост), образование (неграмотный/начальное, среднее, среднее и высшее), количество CD4 (<350 клеток/мкл, [ 350 500] клеток/мкл, >500 клеток/мкл), стадия ВОЗ (стадии I, II, III и IV), ИМТ (<18.5, [18,5,25), [25,30), ≥30 кг/м 2 ), скрининг на симптомы ТБ (да, нет), вирусная нагрузка (<5000 копий/мл, [5000,30000] копий/мл , >30000 копий/мл), поддержка лечения (да, нет), уровень клиники (больница, клиника с родильным отделением, клиника без родильного отделения), время от положительного результата теста на ВИЧ до включения (<1 года, 1-3 года, >3 лет) и объем клиники (низкий: < медианы, высокий ≥ медианы). Для простоты и согласованности с первичным анализом исследования MaxART [4] был использован метод отсутствующих индикаторов [53] для учета отсутствующих ковариат, где отсутствующие данные рассматривались как отдельная группа для каждой смешанной переменной в моделях.

Сначала мы реализовали метод произведения на основе приблизительных выражений меры посредничества, предполагая редкий результат. Мы закодировали неудержание как 1, а удержание как 0. Мы рассчитали NIE, TE и MP, сравнивая EAAA с SoC, в зависимости от режима для каждой ковариации модели. Хотя мы оценили меры посредничества в моде каждой ковариаты модели, эти меры можно было бы также рассчитать и при других значениях ковариат. Результаты представлены в Таблице 4. В Сценарии I, модели с пошаговой поправкой на время, мы обнаружили, что вмешательство защищало от 12-месячного неудержания с отношением шансов, равным 0.{(a)}\) составил 40,8% (95% ДИ по дельта-методу: (0,27, 0,54)), что означает, что более 40% эффекта вмешательства было опосредовано соблюдением режима лечения в течение 6 месяцев. В многофакторном анализе (сценарий II) были получены более сильные эффекты NIE и TE, соответствующие отношениям шансов 0,08 и 0,38 соответственно, а оценка MP с многомерной поправкой также составила около 40%. Бутстрепный и многомерный доверительные интервалы были очень близки в этом анализе, хотя ширина бутстрепного доверительного интервала была немного меньше, чем при использовании дисперсии дельта-метода для NIE и TE, но немного больше, чем дельта-метода для MP.

Таблица 4 Медиационный анализ MaxART [4]. ( n =1731)

Поскольку распространенность исходов в исследовании MaxART составляет около 23%, приведенный выше анализ, основанный на приближении редких исходов, может быть необъективным, как предполагает наше имитационное исследование. Таким образом, мы повторили анализ посредничества, используя точные выражения, приведенные в Таблице 2. Вообще говоря, результаты анализа посредничества, учитывающие распространенность общего исхода, были аналогичны результатам, полученным с использованием аппроксимации редкого исхода.Как в модели с пошаговой поправкой, так и в многомерной модели скорректированные \(\widehat {\text {TE}}\) были немного слабее, чем предыдущие результаты, предполагающие редкий результат (с поправкой на пошаговое время \(\widehat {\text {TE}} = 0,24 \) и с многомерной поправкой \ (\ widehat {\ text {TE}} = 0,10 \) по шкале отношения шансов по сравнению с 0,23 и 0,08 соответственно). В результате \(\widehat {\text {MP}}\) немного увеличилось в скорректированном анализе (шаг с поправкой на время \(\widehat {\text {MP}}=44\%\), многомерный с поправкой \ (\widehat {\text {MP}}=42\%\)), по сравнению с 41 % и 40 % соответственно при приближении к редкому результату.Таким образом, как для результатов, основанных, так и не основанных на предположении о редком заболевании, более 40% эффекта вмешательства на 12-месячное удержание в лечении было опосредовано приверженностью к визитам в течение 6 месяцев.

Ответить

Ваш адрес email не будет опубликован.